两株马来西亚传染性法氏囊病病毒强毒株在BGM-70细胞系中的适应性和分子特征

摘要

从当地IBD暴发中分离的两株马来西亚极强传染性法氏囊病病毒(vvIBDV)株UPM0081和UPM190(又称UPMB00/81和UPM04/190)经绒毛膜尿囊膜(CAM)途径在SPF鸡胚蛋(CEE)中连续传代12次(EP12)。EP12分离株在BGM-70细胞株上连续繁殖20代(P20)。在接种后72小时(pi)，两株菌株的P1均微妙地观察到典型的细胞病变效应(CPEs)。从第3天开始至第7天开始，CPE在P5处明显，细胞圆形、细胞质空泡、肉芽化、脱离烧瓶，滴度为10^9.50TCID₅₀/毫升,TCID₅₀/mL分别适用于UPM0081和UPM190。UPM0081和UPM190的CPE分别在P17和P18时变弱，在P19时消失。然而，通过免疫过氧化物酶、免疫荧光和RT-PCR技术证实了IBDV的存在。系统发育分析表明，这两个分离株均属于vvIBDV。UPM190和UPM0081 IBDV菌株在D279N位点的单突变可能有助于vvIBDV菌株在CEE和BGM-70培养物中的适应性。

1.介绍

传染性法氏囊病(IBD)是一种具有高度经济重要性的疾病，具有高度传染性和免疫抑制作用，影响雏鸡，特别是3 - 6周龄之间的雏鸡。病原体IBD病毒(IBDV)是一种二十面体裸病毒，具有属于属的分段双链RNA基因组Avibirnavirus，贝纳病毒科[1].编码病毒多蛋白的基因组片段A已通过分子技术进行了广泛研究，其中病毒外壳蛋白（VP2）被确定为IBDV毒株之间抗原和病理类型变异的基础[2，3.］．也有报道称VP2蛋白高变区特异性氨基酸的变化决定了IBD病毒细胞培养的适应和衰减[3.］．据报道，野生型IBD病毒极难适应细胞培养，特别是毒性极强的IBDV (vvIBDV)，除非在鸡胚蛋(CEE)中传代几次[4］．通过CAM接种9 ~ 11日龄SPF鸡胚分离IBDV的传统方法昂贵且污染风险高，特别是对于疫苗的开发和生产[5］．报道了IBDV分离株在鸡胚成纤维细胞(CEF)、鸡胚肾和鸡胚囊中的成功适应[6，7]，但主要来自禽类的细胞寿命有限，产生的病毒效价低，并可能含有外来禽类病毒，这些病毒可能污染用它们研制的疫苗[8，9］．据报道，许多哺乳动物来源的连续细胞系支持IBDV分离株的生长，包括MA-104 [10,好吧11], bgm - 70 [10，12， Vero细胞[10，13- - - - - -15]和RK-13 [14，16］．这些细胞系更容易维持，也不受禽类病毒的污染[9］．使用这些细胞株获得了不同水平的病毒滴度，使它们成为IBDV繁殖的更好选择，特别是当疫苗生产需要更高的病毒滴度时。本研究的目的是确定马来西亚vvIBDV分离株在BGM-70细胞系中的适应性和分子特征。

2.材料和方法

2．1．病毒和细胞系

这两株本地vvIBDV分离株分别来自马来西亚2000年和2004年爆发的传染性法氏囊病(IBD)，被指定为UPM0081 (AY520910) [22]及UPM04/190 (AY791998) [23，亦分别命名为UPM190。这些分离株是从被感染的滑囊中分离出来的，经过研磨、离心和通过0.2µm过滤器(Millipore, Merck)。滤液通过绒毛膜尿囊膜(CAM)接种特定的无病原体鸡蛋(SPF CEE) (MVP，马来西亚)连续传代。7天孵育后，收集CAM、均质和过滤CAM匀浆，并将CAM匀浆保存在−80°C，直到需要时。

BGM-70细胞系(ECACC猫编号90092601)是一种上皮样细胞，来自婴儿grivet猴肾(ECACC, Porton Down, Salisbury, SP4 0JG, UK)，在含有5% CO的最低必需培养基(MEM)中维持₂在37°C。

2．2.病毒对特定无病原体鸡胚的适应性研究

为了激活vvIBDV分离株，采用已建立的方法，通过CAM途径将两种病毒的CAM匀浆接种到11天龄的SPF CEE[24然后在37°C的培养箱中培养。在接种后48小时(pi)，每天观察CEE的死亡率7天。在第7天，死亡和存活的胚胎在4°C冷藏过夜，无菌收获CAM和胚胎，用磷酸盐缓冲盐水(PBS, NaCl)均质₂8 g / L, KH₂人事军官₄-0.2 g / L,不₂人事军官₄-1.15 g / L,氯化钾₂-0.2 g, pH 7.2)，在1500 ×g 4°C澄清20分钟。每个分离株的上清液合并1%的抗生素和抗真菌药物(青霉素10000 IU/mL，链霉素10000 IU/mL)µg/mL，两性霉素B-25µg/mL）添加，并使用0.2 µm滤液连续使用11次，得到用于接种BGM-70细胞的UPM0081和UPM190的EP12。

2.3。病毒对BGM-70细胞系的适应性研究

在BGM-70细胞的融合单层中，用500感染µ1平均组织培养感染剂量(TCID)对EP12 vvIBDV多重感染的影响₅₀)按既定方法计算每个细胞的病毒数[25］．将病毒在37°C下吸附2小时，并定期轻轻摇动烧瓶，随后向每个烧瓶中加入5 ml 2% MEM，并在37°C下5% CO中孵育₂每天检查两次，连续7天检查细胞病变效应(CPE)的发展。按照前面描述的方法，用三次冻融循环收获繁殖的病毒[26，用0.2过滤µm（密理博，默克）等分，标记为BGMP1。连续重复19次以获得BGMP20。TCID₅₀在BGMP5是按照标准方法确定的[27］．

２.４.IBDV在BGM-70细胞中的检测

通过凋亡检测、免疫荧光、免疫过氧化物酶检测细胞培养上清中vvIBDV的存在[28]和逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR) [29］．

2.5. 吖啶橙/碘化丙啶凋亡测定

用吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI) DNA结合染料对BGM-70病毒进行了双染色，评价其诱导细胞凋亡的能力[30]简而言之，如前所述，用适应病毒感染BGM-70细胞的融合单层，同时保持另一个烧瓶作为未接种对照。分别从感染瓶和对照瓶中收集培养基24份 hrs-pi和单层用温PBS洗涤并胰蛋白酶化，将分离的细胞吸入适当标记的试管中，并在4°C和1000℃下离心 ×g。丢弃上清液，同时用PBS重新悬浮颗粒，并在4°C和1000℃下再次离心 ×g，丢弃上清液，只留下少量PBS使细胞重新悬浮。在黑暗的房间里，5 µL AO染料原液(10 mg/mL, A3568, ThermoFisher Scientific)稀释在PBS (0.5µL的AO库存溶液49.5µL)与5µ1升PI染料储备溶液（1.0 mg/mL，P3566，ThermoFisher Scientific）在PBS（5）中稀释 µ45中PI储备溶液的L µL的PBS)，并将混合物加到10µL的感染细胞或未感染对照，轻轻混合在玻片上，并立即盖玻片。然后在30分钟内用免疫荧光显微镜(Leica Microsystems Limited, Heerbrugg, Switzerland)观察载玻片。

2.6.间接免疫过氧化物酶测定

从培养箱中取出四个含有融合BGM-70细胞单层的6孔板（康宁®，德国西格玛-奥尔德里奇），丢弃培养基，用预热PBS冲洗两次，并在单个孔中接种200 µ取UPM0081和UPM190第5代、第10代、第15代、第16代、第17代、第18代和第19代收获的细胞培养上清液，在37℃、5% CO条件下孵育120分钟吸附₂．每孔加1.8 mL维持培养基(MEM + 2%胎牛血清)，未感染对照孔加2ml维持培养基。然后在37°C和5% CO下孵育板₂连续观察4 d。用4%多聚甲醛(P6148, Sigma-Aldrich, Germany)在室温下固定30分钟，用冰冷PBST(含0.5%吐温20的PBS)清洗两次5分钟，用3%双氧水(H₂O₂)在室温下烤30分钟。用PBST洗涤2次，每次5分钟，用柠檬酸缓冲液在微波(50功率级)中提取VP2 IBDV抗原10分钟。用PBST冲洗2次，5分钟，用PBST中5% BSA封闭1小时，室温。细胞被冲洗两倍于之前和40µ取1株鸡抗vp2 - ibdv特异性一抗(美国Charles River Laboratories)，用蒸馏水1:200稀释后，配药于细胞上，4℃湿室孵育过夜。用PBST冲洗2次，分别持续5分钟和40分钟µ取兔抗鸡igy - fc - hrp偶联二抗(ThermoFisher Scientific)，蒸馏水1:10 00稀释，每孔配药，室温暗室孵育1小时。用PBST和100µ加入L/孔的3,3 '二氨基联苯胺(Sigma-Aldrich，德国)孵育5分钟，然后用PBST简单冲洗，苏木精染色15秒，然后在慢速流动的自来水中冲洗5分钟。盖片干燥后，使用DPX (Sigma-Aldrich，德国)标记干净的玻片，最后在显微镜下观察(Leica Microsystems Limited, Heerbrugg，瑞士)，观察细胞胞浆内呈棕色或金色的阳性反应[28］．

2.7。间接免疫荧光法检测

将干净的盖玻片放置在四个6孔组织培养皿中，并在紫外线照射下放置过夜。按照标准的既定方案，在培养皿中接种BGM-70细胞[26］．融合后，用预温的PBS洗涤两次，单个孔接种200µl收集UPM0081和UPM190病毒第5、10、15、16、17、18、19代上清，37℃、5% CO孵育120分钟吸附₂条件下，每孔加1.8 mL维持液，未感染对照孔加2ml维持液。然后在37°C和5% CO下孵育板₂每天观察3天。在室温下用4%多聚甲醛固定板30分钟，并用冰冷的PBST（PBS含有0.5%吐温20）清洗三次，持续5分钟。此后，将培养板在PBST（PBS 1）中的0.5%Triton X-100中培养 L pH值7.2+0.5 mL吐温20）15分钟使细胞渗透，然后用PBST冲洗三次，持续5分钟。在室温下，使用封闭缓冲液（PBST中的5%BSA）封闭非特异性结合1小时。平板用PBST冲洗三次5分钟，然后冲洗40分钟 µ1份鸡单克隆抗VP2-IBDV特异性一级抗体（美国查尔斯河实验室），稀释至1 : 将带有无菌蒸馏水的200滴在细胞上，然后在4°C的黑暗加湿室中培养过夜。用PBST和40洗涤皿三次，持续5分钟 µ兔抗鸡fitc标记的抗鸡IgY-Fc二抗(Sigma-Aldrich，德国）稀释至1 : 将装有无菌蒸馏水的200滴于每个含有孔的载玻片上，并在室温下在黑暗中培养1小时。用PBST冲洗平板5分钟，三次20分钟 µ向培养皿中加入1/4′，6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）（德国西格玛·奥尔德里奇）并在室温下培养10分钟，然后用PBST对培养皿进行短暂冲洗。干燥盖玻片，并使用贴片剂（DPX）将其放置在标记的干净玻片上进行荧光显微镜检查（Leica Microsystems Limited，Heerbrugg，瑞士）的VP2抗原阳性细胞[28］．

2.8。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

取CEE第12代和BGM-70细胞第1、5、10、15、16、17、18、19、20代CAM匀浆进行RNA提取、cDNA合成和PCR分析。简单地说,250年µ取CAM匀浆或细胞培养上清L，置于1.5 mL无菌Eppendorf试管中，750毫升µ在1中添加1 l Trizol®LS : 通过多次上下移液管重新悬浮混合物，并在室温下静置15分钟。氯仿（200 µL)加入混合物，剧烈摇晃15秒，室温静置5分钟，4℃，12000 ×g离心15分钟。将上面透明的含RNA的水相从两个有机和DNA相中轻轻地移到新的标记的1.5 mL管中，用于RNA沉淀。每管加入500微升100%异丙醇，室温静置10分钟，12000 ×g离心10分钟，弃异丙醇，1000洗涤RNAµ75%酒精，在7500 ×g离心5分钟。酒精被丢弃，RNA颗粒在2级生物安全柜内部分干燥5 - 10分钟，最后35分钟µ加入无菌RNAse游离水L重悬RNA，测定浓度、纯度及后续后续应用。提取的RNA用于扩增A段基因组RNA序列VP2高变区。

2.9.cDNA合成

将提取的RNA用MMLV cDNA合成试剂盒合成cDNAµL)、RNAase游离水(1.5µL)和随机低聚物(1.0µL).将混合物简单离心，在65°C孵育2分钟，然后迅速冰封5分钟，之后2.0µl的MMLV缓冲，2.0µDTT的L, 2.0µdNTPs的L, 0.5µL和1.0µ加入逆转录酶L，使总反应体积为20µL.将混合物轻轻混合，简单离心，37℃孵育60分钟，然后将温度提高到85℃，按表中循环条件孵育5分钟1．

2.10。PCR扩增

将合成的cDNA作为模板，使用KAPA HIFI PCR试剂盒(KAPA Biosystems, Boston, Massachusetts, USA)进行PCR扩增，试剂体积和浓度由制造商推荐:5倍KAPA HIFI Buffer 10.0µL (1x)， 10mm KAPA dNTP Mix 1.5µL (0.3 mM each)、10 . mMµM正向底漆1.5µL (0.3µM） ，10 µM反向引物1.5µL (0.3µM)， DNA模板µL, 1 U /µL KAPA HiFi DNA聚合酶1.0µL (1u)和4.5µL pcr级水最高可达25µL总反应体积。以下引物(Liu et al.， 1994)用于扩增hvVP2序列的643-bp区域:643-1 (5 ' -TCACCGTCCTCAGCTTAC-3 ')和643-2 (5 ' -TCAGGATTTGGGATCAGC-3 ')。将混合物简单离心并在PCR循环条件下孵育，如表所示2．

2.11。核苷酸序列分析

为了确认CEE和BGM-70适应病毒的病理类型特征，所有扩增的643 通过Sanger法（马来西亚雪兰莪州Seri Kembangan的First BASE Laboratories）直接对来自所有不同通道的bp PCR产物进行测序，并使用BioEdit序列比对编辑器v7.2.5（Tom Hall，Ibis Biosciences，Carlsbad，CA）对核苷酸序列进行分析。使用大型version 7 (19］．采用Clustal W对核苷酸序列进行比对，采用neighbor joining (NJ)方法和多达1000个bootstrap重复设计系统发育树。分析的部分序列从核苷酸位置637到879，对应于氨基酸位置213到293，编号根据[31］．用于比较的序列包括非常强毒、变异和经典的1型和2型IBDV，如表所示3.．

3.结果

３．１．特异性无病原体胚卵传代

两株病毒均表现出典型的IBD病变，包括颅内出血、肝脏大理石纹、头部水肿、充血、EP2 - EP12腹胀。平均胚胎死亡率为5天。UPM0081分离株表现为充血、大腿、胸肌瘀斑出血、肝脏斑驳(有时苍白或黄色)、头部水肿、颅内出血和侏儒。单独的UPM190偶尔引起充血或苍白，大腿和乳房肌肉的淤血出血，颅内出血，腹部肿胀，皮下水肿和肝脏斑点(图)1(一)- - - - - -1 (d))在EP12处，这两个分离物中的一个。

３.２．病毒对BGM-70细胞系的适应性研究

72小时内获得正常融合的BGM-70细胞单层，呈成纤维细胞形态(图)2(一个)）.在第一次传代中，病毒诱导的CPE很少，单分子层保持100%完整，直到4天pi。CPE的证据从第5天开始表现为病毒开始适应细胞系。在BGMP2时，CPE在第4天达到pi，在第7天和P5时达到20%;清晰的CPE在48小时内出现。CPE在第6天表现为小而圆的折射细胞，胞浆颗粒形成，细胞脱离，单层缓慢破坏(图)2 (b)）.CPE在P18开始时变得微妙，仅在9天后出现，表明繁殖病毒的毒力降低(图)2 (c)和2 (d)）.在BGMP5位点，适应病毒的感染效价为10^9.98TCID₅₀/毫升和10^9.50TCID₅₀UPM190和UPM0081分别在3天pi时/mL。

3.3.吖啶橙/碘化丙啶凋亡测定

使用AO/PI染料进行的细胞凋亡试验表明，在24小时PI时，IBDV作为病毒传播的一种手段，很少引起被感染的细胞发生凋亡(图)5）.AO染料染色正常和凋亡细胞的细胞核绿色因为它成为绑定到DNA,因为它可以很容易地穿透完整活细胞的膜,而PI染色只能渗透细胞,破坏膜细胞凋亡和坏死等污渍橙红色为红色。凋亡细胞呈橙色(图)3 (c)和3（f）)，由于AO/PI染料和膜起泡的共同作用(图3（f）)在24和48小时的pi与未感染对照组相比(图3（i））.

3．4．间接Immunoperoxidase化验

为了验证感染的BGM-70细胞中是否存在IBD病毒，对在玻片上生长的感染细胞进行间接免疫过氧化物酶测定。该测定结果显示存在胞浆内棕色，表明在感染的BGM-70细胞的细胞质中存在IBDV VP2抗原（图4(一))与未感染的对照组相比（图4 (b)）.

3．5．间接免疫荧光试验

为了进一步证实BGM-70细胞的细胞质中存在VP2病毒抗原，我们进行了间接免疫荧光检测。检测结果显示，感染细胞的细胞质和核膜上IBDV VP2蛋白呈阳性绿色荧光(绿色)，而未接种的阴性对照仅显示核染色DAPI的兴奋(蓝色)。VP2抗原绿色信号的存在表明IBD病毒存在于被感染的BGM-70细胞的细胞质和核膜上。

3.6.逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

中东欧和bgm - 70改造病毒的鉴定证实了通过胚胎病变和CPE的出现一个明显的643个基点乐队当一个rt - pcr的凸轮匀浆和bgm - 70细胞培养上清液和产品分析了凝胶电泳,溴化乙锭染色(图6）.

3.7。核苷酸序列分析

为了确定RT-PCR产物是否为IBDV基因组，将RT-PCR产物直接测序并使用BioEdit进行分析v7和MEGAv7.ClustalW将两个分离株的核苷酸序列与其他参考序列进行比对(图)7）.比对结果显示，预适应亲本病毒UPM04/190、UPM190EP1、UPM190EP12、UPM190BGMP5和UPM190BGMP10在642和645位点的核苷酸由C、A向T、G方向变化。从648 - 650位，UPM04/190与包括参考序列在内的其他分离株的CTC相比具有TAG。UPM04/190在652 - 654核苷酸位置存在TCA - AGC核苷酸突变。其他观察到的核苷酸突变有C660T、A663G、A666G、T669C、A675G、A693C、T696C、T699C、C702T、C708G、C711T、A714C、C720G、C726T、G729C、A732C、A752C、C759G、T758G、T777C和C780G。其他型号包括C786T、C789T、T792G、G807C、T810C、A816G、C819T、A823C、A825T。在T828G、C834G、A837G、C840T、T843C、G846C、A849G、G852C、C855G、T861C、C864T、T870G、A876G、C879T进一步检测到变化。UPM190EP1、UPM190EP12、UPMBGMP5和UPMBGMP10在部分参考序列中核苷酸发生了变化。

当预适应、CEE、BGM-70和参考分离株的核苷酸序列被翻译为氨基酸时，可以看到识别vvIBDV致病型的假定基序显示在242、256和294位的异亮氨酸(I)和299位的丝氨酸(S)(图)8）.在预适应和CEE和BGM-70适应病毒中，234到236位的IDA基元都存在(图)8）.在249位，UPM04/190、UPM190EP1、UPM190EP12、UPM190BGMP1和UPM190BGMP5所含的氨基酸是E249，而其他CEE和BGM-70适应株所含的氨基酸是Q249。同样，除了KF241548.1具有H249外，所有的参考序列都具有Q249。同样，在270位点，UPM B0081预适应病毒、UPM04/190、UPM190EP1和UPM190EP12、UPM190BGMP5和UPM190BGMP10等内参序列在该位点具有丙氨酸，而其他CEE和BGM-70适应病毒在该位点具有谷氨酸(E270)。除AF527039.1和U30818.1含有E270氨基酸外，其余参考序列均含有A、T、S或V。在279氨基酸位置，只有UPM190EP12、UPMBGM190P1和UPMBGM190P5具有天门冬酰胺(N)，而预适应亲本病毒和其他CEE和BGM-70适应分离株具有D(图)8）.然而，当病毒在BGM-70细胞系中进一步连续传代时，N279突变逆转。

序列系统进化分析显示，我们的分离株与GenBank中保存的欧洲、亚洲、中东和非洲的vvIBDV分离株序列聚类(图)9）.距离矩阵(图10结果显示，UPM B0081与AF508177的差异为0.8%，与Edgar菌株的差异为10.9%，与AY819701的差异为11.5%，与AY963132的差异为9%，与JX424076.1的差异为8%，与U30818的差异为43.4%，与KP642112.1的差异为45.9%。与UPM190和UPM0081序列比较，预适应菌株UPM B0081与UPM04/190序列差异为33.8%，与CEE和BGM-70其余菌株差异为0.4% ~ 3.4%。UPM04/190与AF508177的差异为33.2%，与所有CEE和BGM-70的差异为34.5%，除了UPM190BGMP1和UPM190BGMP5和UPM190EP12与UPM190P1的差异为32.5%和31.8%。UPM04/190与2型血清分离株比较，U30818.1差异为62.9%，KP642112差异为64.9%。其余CEE和BGM-70菌株的UPM04/190在0.4%和3.9%之间存在差异。用于构建系统发生树和计算距离矩阵的序列如表所示3.．

4.讨论

马来西亚报道了通过RT-PCR和限制性片段长度多态性(RFLP)技术证实的鸡中暴发vvIBDV [22和世界其他地方。据报道，初级SPF CEE和几个连续的禽类和哺乳动物细胞系，包括BGM-70细胞，支持许多感染脊椎动物和无脊椎物种的病毒的生长和繁殖，包括IBDV [9，10，12，21］．在本研究中，两株马来西亚vvIBDV分离株UPM0081和UPM190在CEE中适应并连续传代12次，随后在哺乳动物的连续细胞系BGM-70中生长。与CEE相比，连续的哺乳动物细胞系的优势包括:不受禽流感病毒污染、易于处理、成本低、无限寿命和易于维护[9］．用于控制IBDV感染的大多数商业可用疫苗，特别是毒性非常强的IBDV (vvIBDV)型疫苗，都是以鸡蛋为基础的，这使得它们的生产既费力又昂贵，而且可能是重要禽流感病毒向接种过的禽群垂直传播的来源。需要基于从鸡蛋到细胞培养IBD疫苗开发使用vvIBDV作为种子病毒是非常重要的为了减少劳动力和生产成本高,但问题是,vvIBDV报道很难适应细胞培养(32，33］．在盲传代10次后，试图将来自荷兰、台湾和土耳其的vvIBDV菌株移植到BGM-70细胞系上，但未成功[25]在该研究中，vvIBDV菌株在SPF CEE中传代8次，然后用于BGM-70培养物的连续接种，最多10次，无CPE发展。在本研究中，通过第5代，两株马来西亚vvIBDV分离株UPM0081和UPM190成功地适应于具有独特CPE发育的BGM-70细胞系。这与哈桑及其同事的观察结果相似[9]和Abdel-Alim和Saif [34经典(STC)和变异(IN) IBDV分别在2次和3次盲传代中成功地适应于BGM-70细胞，并具有CPE发育的特点。此外，El-mahdy等人的报告[12]研究埃及本地vaIBDV分离株在第1代BGM-70细胞系上的适应性和高病毒产量(TCID₅₀结果表明，IBDV UPM190和UPM0081的病毒效价高达10^9.98TCID₅₀/毫升和10^9.50TCID₅₀/mL，分别在感染第5代72小时后。

早期关于BGM-70细胞系用于IBDV繁殖的有用性的研究表明，经典型（STC）和变异型（IN）IBDV的连续繁殖低至4代，导致致病性丧失[9];同样,连续使高达30段落(变异株)或40通道(变体E应变)会导致病毒的复制能力的丧失囊的SPF鸡活疫苗,但使用时保护鸡对实验的挑战时,病毒被用作灭活疫苗(26］．在本研究中，两种病毒仅在BGM-70细胞中传代20次，病毒效价较高(log10 9.98 TCID)₅₀/毫升,9.50 TCID₅₀/mL分别适用于UPM190和UPM0081);有必要评估它们的致病性、免疫原性和实验性挑战研究的有效性，以确定它们作为潜在的减毒活疫苗或灭活疫苗候选的有效性。

凋亡是一种程序性细胞死亡，由细胞因子高度调控，其特征是明显的形态学细胞变化，如染色质凝聚、核碎裂和膜泡[35］．一些有助于识别和分化坏死细胞凋亡的染色方法被开发，包括Annexin V染色，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，吖啶橙/溴化乙啶/碘化丙啶染色和Hoechst染色。这些荧光色素与DNA结合时发出荧光，用荧光显微镜在一定的激发光谱下观察[36］．IBDV对细胞系的生产性感染与细胞凋亡的诱导有关[30，37，38，这一过程与IBDV的非结构性VP5蛋白有关，只在IBDV感染的细胞中发现[37，39- - - - - -41］．使用AO/PI染料对感染的培养物进行染色，以区分凋亡细胞和坏死细胞[30，36］．AO/PI双染色后出现橙色，被认为是除核碎裂、缩合和膜泡外的凋亡指标之一[42]在这项研究中，AO/PI染料用于证明IBDV VP5非结构蛋白诱导的细胞凋亡，该蛋白仅在生产性感染中出现[30，37- - - - - -41，43，44］．AO/PI染色对IBDV感染的BGM-70细胞进行双重染色，可以检测到细胞凋亡，荧光显微镜下可见染色细胞的细胞核呈橙色。细胞中碘化丙啶的存在表明细胞膜完整性的丧失;因此，这种染料只能渗透到受损的细胞中，将细胞核染成红色。另一方面，吖啶橙容易穿过健康和早期凋亡细胞的细胞膜，并将细胞核染成绿色。这两种染料同时存在于细胞中，将细胞核染成橘红色，这是膜选择性通透性丧失的证据，这种情况只在死亡细胞中可见。PI联合AO将细胞核染成红色表明细胞坏死，而橙色则表明细胞正在经历晚期凋亡[42］．这种技术简单而优雅，因为它能够区分死细胞和因IBD病毒等讨厌刺激而发生凋亡的细胞。

为了进一步证实感染的BGM-70细胞内存在IBDV，采用免疫组化和免疫荧光技术鉴定抗原阳性细胞[44- - - - - -48］．免疫过氧化物酶和免疫荧光在感染细胞的细胞质中显示VP2抗原的存在，表明BGM-70细胞株有能力支持这两种vvIBDV分离株的生长和复制，因为据报道，病毒在48小时内在被感染细胞的细胞质内复制，产生病毒衣壳蛋白(VP2和VP3) [30，49，50］．这两种技术对检测和定位感染细胞和组织中的IBDV是灵敏、特异和有用的诊断工具。

利用RT-PCR、序列和序列分析的分子分析显示，由于A222的存在，这两个分离株与在亚洲、欧洲、中东和非洲发现的vvIBDV具有系统发育相关[51，52]和I242、I256、I294、S299 [51]与caIBDV或vaIBDV（具有V222、VA或E256）或血清型2病毒（具有P222、V242、I或S256、N或F294和T或P299）相比，其VP2高变氨基酸组成[51在同一地区。正如其他IBDV一样，我们菌株中233-236 IDA基元的存在表明这些病毒能够适应细胞培养，因为据报道这些氨基酸对细胞培养适应非常重要[51，53通过整合素受体。此外，在CEE传代过程中，UPM190分离物在EP12的D279N处获得了一个突变，据报道，该突变是在减弱和/或细胞培养适应IBD病毒中观察到的两个变化的一部分[7，54- - - - - -56］．然而，当病毒在BGM-70细胞中传代时，在BGM-70适应病毒的氨基酸序列中可以看到N279还原为D279。仅在D279N突变的该分离物在BGM-70细胞培养中复制的能力表明，单是D279N突变可能有助于细胞培养对一种毒性很强的IBDV菌株的适应性。这可能是UPM190比UPM0081更有效和更明显的CPE复制的原因，而UPM0081的氨基酸在CEE代保持不变。此外，BGM-70的适应性导致UPM190 VP2高变区E249Q和A270E位置的其他氨基酸序列突变。A270E突变此前仅在UPM94/273(一种具有异常致病性的vvIBDV)和非致病性血清型2 OH株中报道[57]。以前曾有报道说，特定部位的两种氨基酸变化可能导致病毒减弱[58］．这种A270E突变出现在BGM-70适应的UPM190序列中，可能是BGM-70细胞培养中CPE减少的原因。而对于UPM0081, A270E突变是在CEE适应过程中获得的，然后在BGM-70细胞系中传代。这种突变的重要性还需要进一步的反基因技术实验来证实。

系统进化上，与GeneBank中已发表的vvIBDV参考序列聚类，所有分离株均属于vvIBDV分支，表明BGM-70传代和突变并没有导致分离株的发病类型发生改变。

综上所述，马来西亚vvIBDV在CEE中连续传代12次，在BGM-70细胞系中连续传代20次，获得了减弱的马来西亚vvIBDV。UPM190在CEE传代第12代出现1个氨基酸突变，该突变在BGM-70细胞系传代后出现逆转;在BGM-70细胞系传代过程中，UPM190出现2个氨基酸突变和1个氨基酸突变。据我们所知，这是首次报道马来西亚本地vvIBDV分离株在BGM-70细胞系中成功适应;因此，本研究强调了该细胞系的优点在体外A270E突变可能作为一个新的衰减位点发挥作用，进一步加强VP2高变区许多不同位点可能参与IBDV衰减的可能性。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

本研究由马来西亚科技创新部科技基金项目(6364002)和马来西亚高等教育部HiCoE项目(6369101)资助。

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