AVgydF4y2Ba 病毒学的进步gydF4y2Ba 1687 - 8647gydF4y2Ba 1687 - 8639gydF4y2Ba HindawigydF4y2Ba 10.1155 / 2017/8359047gydF4y2Ba 8359047gydF4y2Ba 研究文章gydF4y2Ba 适应和分子特性的两个马来西亚非常致命的传染性法氏囊病病毒分离株在bgm - 70细胞系gydF4y2Ba LawalgydF4y2Ba 纳菲'ugydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba http://orcid.org/0000 - 0001 - 6052 - 3290gydF4y2Ba Hair-BejogydF4y2Ba 穆罕默德gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba 艾尔沙德gydF4y2Ba 西蒂苏瑞gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba http://orcid.org/0000 - 0001 - 7379 - 0507gydF4y2Ba 奥马尔gydF4y2Ba 阿卜杜勒·拉赫曼gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba http://orcid.org/0000 - 0001 - 8640 - 517 xgydF4y2Ba IderisgydF4y2Ba 爱伲人gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba 时gydF4y2Ba Subhash C。gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 兽医病理学和微生物学gydF4y2Ba 兽医学院gydF4y2Ba 马来西亚Putra大学(其)gydF4y2Ba 43400年SerdanggydF4y2Ba 雪兰莪州gydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba upm.edu.mygydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 美国兽医微生物学gydF4y2Ba 兽医学院gydF4y2Ba Usmanu Danfodiyo大学gydF4y2Ba 索科托市(UDUS)gydF4y2Ba 索科托州2346gydF4y2Ba 尼日利亚gydF4y2Ba udusok.edu.nggydF4y2Ba 3gydF4y2Ba 实验室疫苗和免疫治疗gydF4y2Ba 生物科学学院gydF4y2Ba 马来西亚Putra大学(其)gydF4y2Ba 43400年SerdanggydF4y2Ba 雪兰莪州gydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba upm.edu.mygydF4y2Ba 4gydF4y2Ba 兽医临床研究gydF4y2Ba 兽医学院gydF4y2Ba 马来西亚Putra大学(其)gydF4y2Ba 43400年SerdanggydF4y2Ba 雪兰莪州gydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba upm.edu.mygydF4y2Ba 2017年gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba 11gydF4y2Ba 2017年gydF4y2Ba 2017年gydF4y2Ba 17gydF4y2Ba 05年gydF4y2Ba 2017年gydF4y2Ba 07年gydF4y2Ba 08年gydF4y2Ba 2017年gydF4y2Ba 28gydF4y2Ba 08年gydF4y2Ba 2017年gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba 11gydF4y2Ba 2017年gydF4y2Ba 2017年gydF4y2Ba 版权©2017纳'u Lawal et al。gydF4y2Ba 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。gydF4y2Ba

两个马来西亚非常致命的传染性法氏囊病病毒(vvIBDV)菌株UPM0081 UPM190(也称为UPMB00/81和UPM04/190)从当地IBD暴发分离连续通道12倍(EP12)在特定病原体免费(SPF)鸡肉受孕的鸡蛋(中东欧)绒毛膜尿囊的膜(CAM)的路线。EP12孤立进一步适应和连续传播bgm 20 - 70细胞系段落(P20)。特征细胞病变效应(cpe)巧妙地观察到P1在两个隔离72小时postinoculation(π)。CPE成为著名的在P5细胞四舍五入,细胞质液泡,造粒,从第三天开始从烧瓶和超然π,7天π10滴度gydF4y2Ba9.50gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba/毫升,gydF4y2Ba lgydF4y2Ba ogydF4y2Ba ggydF4y2Ba 10gydF4y2Ba 9.80gydF4y2Ba TCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba/毫升UPM0081 UPM190,分别。在P17 CPE变得微妙,消失P18和P19 UPM0081和UPM190分别。然而,IBDV的存在证实了immunoperoxidase,免疫荧光和rt - pcr技术。的系统发育分析表明,这两个隔离vvIBDV。看来单一突变UPM190和UPM0081 IBDV隔离在D279N可以促进vvIBDV应变适应能力在中东欧和bgm - 70的文化。gydF4y2Ba

 Kementerian理科,各种丹InovasigydF4y2Ba 6364002gydF4y2Ba 高等教育、马来西亚gydF4y2Ba 6369101gydF4y2Ba 1。介绍gydF4y2Ba

传染性法氏囊病(IBD)是一种疾病的高经济重要性的高度传染性和免疫抑制影响年轻的鸡尤其3至6周的年龄。病原体,炎症性肠病病毒(IBDV),是一个裸体的二十面体病毒有分段双链RNA基因组属于属gydF4y2Ba AvibirnavirusgydF4y2Ba、家庭Birnaviridae [gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba]。基因组片段编码病毒多蛋白被广泛研究使用分子技术和病毒衣壳蛋白外(VP2)确认为抗原的基础和pathotypic IBDV毒株之间的变化(gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba]。也报道,特定的氨基酸变化VP2蛋白的高变区确定IBD病毒的细胞培养适应和衰减(gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba]。据报道,野生型IBD病毒很难适应细胞培养尤其是非常致命的IBDV (vvIBDV)除非通过几次鸡鸡胚蛋(中东欧)[gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba]。IBDV的传统隔离凸轮接种的9 - 11-day-old SPF鸡胚是昂贵的加上高风险污染尤其是对疫苗的开发和生产(gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba]。成功适应IBDV隔离在鸡胚成纤维细胞(CEF),鸡胚胎肾,和鸡胚胎囊被报道(gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba),但主要的细胞被鸟类起源的寿命有限,产生病毒效价低,可能包含无关的禽流感病毒可能污染疫苗使用他们开发的gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba]。据报道许多连续的哺乳动物细胞系来源支持IBDV分离株的生长包括ma - 104 (gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba,好吧gydF4y2Ba 11gydF4y2Ba],bgm - 70 [gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba),维洛细胞(gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 13gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 15gydF4y2Ba],RK-13 [gydF4y2Ba 14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 16gydF4y2Ba]。这些细胞系从禽流感病毒污染物更容易维护和自由gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba]。各种级别的病毒滴度获得使用这些细胞系使他们更好的选择对IBDV传播尤其是当需要更高的病毒滴度在疫苗生产一样。本研究的目的是确定的适应和分子特征马来西亚vvIBDV隔离在bgm - 70细胞系。gydF4y2Ba

 2。材料和方法gydF4y2Ba 2.1。病毒和细胞系gydF4y2Ba

两个本地vvIBDV隔离分别从严重的传染性法氏囊病(IBD)的爆发在2000年和2004年在马来西亚,并指定UPM0081 (AY520910) [gydF4y2Ba 22gydF4y2Ba)和UPM04/190 (AY791998) [gydF4y2Ba 23gydF4y2Ba也叫UPM190,分别。这些孤立隔绝感染黏液囊地面,离心机,透过一个0.2gydF4y2Ba µgydF4y2Bam过滤器(微孔,默克公司)。滤液的连续通道通过绒毛膜尿囊的膜(CAM)接种特定的无菌鸡蛋(SPF中东欧)(MVP、马来西亚)。经过7天的孵化,凸轮是收获,均质,过滤和凸轮匀浆是储存在−直到需要80°C。gydF4y2Ba

细胞系bgm - 70 (ECACC猫号90092601)是一种epithelial-like细胞来自婴儿grivet猴肾(ECACC, Porton下来,索尔兹伯里,SP4 0詹,英国)保持在最低基本培养基(MEM)有限公司为5%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在37°C。gydF4y2Ba

 2.2。病毒适应特定的无菌鸡受孕卵gydF4y2Ba

激活vvIBDV隔离,11-day-old SPF中东欧注射两种病毒通过凸轮凸轮匀浆的路线使用一个确定的方法(gydF4y2Ba 24gydF4y2Ba在37°C)和孵化一个孵化器。七天的中东欧观察每日死亡率丢弃任何胚胎死亡48小时postinoculation(π)。在7天内π,死亡,存活的胚胎冷冻一夜之间在4°C和凸轮和胚胎无菌收获,与磷酸缓冲盐均质(PBS,氯化钠gydF4y2Ba2gydF4y2Ba8 g / L, KHgydF4y2Ba2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba-0.2 g / L,不gydF4y2Ba2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba-1.15 g / L,氯化钾gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-0.2克、pH值7.2)和澄清在1500×g 20分钟在4°C。每个隔离的上层清液池和1%的抗生素和抗真菌剂(青霉素10000单位/毫升,链霉素10000gydF4y2Ba µgydF4y2Bag / mL,两性霉素,依靠“b - 25gydF4y2Ba µgydF4y2Ba0.2 g / mL)被添加和过滤后使用gydF4y2Ba µgydF4y2Bam连续过滤,滤液用于十一多通道给EP12 UPM0081和UPM190用于bgm - 70细胞接种。gydF4y2Ba

 2.3。改编的病毒bgm - 70细胞系gydF4y2Ba

融合性的层的bgm 500 - 70细胞被感染了gydF4y2Ba µgydF4y2BaL (EP12 vvIBDV在感染复数1意味着组织培养(TCID感染剂量gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)病毒/细胞后建立的方法(gydF4y2Ba 25gydF4y2Ba]。病毒吸附在37°C 2小时后与周期性轻轻的摇动烧瓶的MEM 5毫升的2%被添加到每个瓶,37°C 5%孵化有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba并分析了连续7天每天两次的细胞病变效应(CPE)的发展。使用三个冻融循环,传播病毒收获后先前所描述的方法(gydF4y2Ba 26gydF4y2Ba)、过滤与0.2gydF4y2Ba µgydF4y2Bam(微孔,默克公司)整除,贴上BGMP1。这是连续重复19次获得BGMP20。的TCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba在BGMP5决心按照标准方法gydF4y2Ba 27gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

 2.4。检测IBDV bgm - 70细胞gydF4y2Ba

vvIBDV在细胞培养上清液的存在被细胞凋亡分析评估,免疫荧光,immunoperoxidase [gydF4y2Ba 28gydF4y2Ba),和反向transcriptase-polymerase连锁反应(rt - pcr) [gydF4y2Ba 29日gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

 2.5。吖啶橙/碘化Propidium细胞凋亡测定gydF4y2Ba

bgm - 70改编病毒诱导细胞凋亡的能力评估在感染细胞通过与吖啶橙(AO)双重染色,propidium碘(PI) DNA结合染料(gydF4y2Ba 30.gydF4y2Ba]。短暂,汇合的单层bgm - 70细胞像之前描述的那样是感染了病毒而另一个烧瓶作为未经变质处理的控制。中受感染的玻璃瓶和控制分别收集24小时π和单层被温暖的PBS和使胰蛋白酶化分离细胞被吸进适当标记管子和离心机在4°C 1000×g。浮在表面的丢弃,而球被resuspended PBS和离心机在4°C 1000×g和上层的丢弃,只留下少量的PBS resuspend细胞。在一个黑暗的房间,5gydF4y2Ba µgydF4y2BaL (AO染料股票的解决方案(10毫克/毫升,A3568 ThermoFisher科学)在PBS稀释(0.5gydF4y2Ba µgydF4y2Ba在49.5 L AO股票的解决方案gydF4y2Ba µgydF4y2BaL (PBS)和5gydF4y2Ba µgydF4y2BaL(π染料股票的解决方案(1.0毫克/毫升,P3566 ThermoFisher科学)稀释在PBS (5gydF4y2Ba µgydF4y2BaLπ原液的45gydF4y2Ba µgydF4y2BaL (PBS)和混合添加到10gydF4y2Ba µgydF4y2BaL感染细胞或未受感染的控制,轻轻地混合载玻片,立即盖玻片覆盖着。幻灯片在30分钟内被认为与一个免疫荧光显微镜(瑞士徕卡微系统有限公司,Heerbrugg)。gydF4y2Ba

 2.6。间接Immunoperoxidase化验gydF4y2Ba

四6-well板块(康宁®、Sigma-Aldrich、德国)包含支流bgm - 70细胞单层的孵化器,媒介与prewarmed PBS丢弃,冲洗两次,和个别井注射200gydF4y2Ba µgydF4y2BaL收获细胞培养上清液的通道5、10、15、16、17、18日和19日的UPM0081 UPM190和孵化120分钟吸附在37°C和5%的公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。体积为1.8毫升的维护媒介(MEM + 2%的边后卫)被添加到每个好,而未受感染的控制井满心2毫升的媒介。盘子被37°C和5%孵化有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和观察每日4天。板块与4%多聚甲醛固定(P6148 Sigma-Aldrich,德国)30分钟在室温和洗两次使用冰冷PBST (PBS含有0.5%渐变20)5分钟和淬火3%过氧化氢(HgydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba在室温下)30分钟。盘子都洗了两次,每次PBST 5分钟,VP2 IBDV抗原是检索与柠檬酸缓冲微波(50功率)10分钟。板块与PBST两次冲洗5分钟和屏蔽5% BSA PBST室温1小时。这些细胞被冲洗前40的两倍gydF4y2Ba µgydF4y2Bal单克隆鸡anti-VP2-IBDV特定主要抗体(美国查尔斯河实验室)和蒸馏水稀释1:200年是分发的细胞,然后在4°C湿润孵化室过夜。盘子被冲洗两次PBST 5分钟和40gydF4y2Ba µgydF4y2Bal的兔子anti-chicken-IgY-Fc-HRP-conjugated二级抗体(ThermoFisher科学)与蒸馏水稀释1:1000年是分发到每个好,室温下孵化1小时在黑暗的房间里。板块与PBST冲洗和100年gydF4y2Ba µgydF4y2BaL / 3, 3′diaminobenzidine (Sigma-Aldrich、德国)添加了5分钟的孵化,前板简要冲洗PBST和与苏木精染色15秒之后,在缓慢运行自来水冲洗5分钟。封面都干,转移到标签清洁玻璃幻灯片使用mountant DPX (Sigma-Aldrich、德国),最后在显微镜下观察(瑞士徕卡微系统有限公司,Heerbrugg)阳性反应看作是棕色或金色颜色细胞质内的细胞(gydF4y2Ba 28gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

 2.7。间接免疫荧光法检测gydF4y2Ba

干净的盖玻片放置在四个6-well组织培养板和被允许在紫外线照射下站在一夜之间。盘子被播种bgm - 70细胞后标准建立协议(gydF4y2Ba 26gydF4y2Ba]。融合后,与prewarmed PBS盘子都洗了两次,个别井接种200gydF4y2Ba µgydF4y2Bal细胞培养收获上层清液的通道5、10、15、16、17日,18日和19日UPM0081和UPM190病毒和孵化为120分钟吸附在37°C, 5%的公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba条件,然后1.8毫升的维护中添加到每个好而未感染控制井满心2毫升的媒介。盘子被37°C和5%孵化有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和观察每日3天。板块与4%多聚甲醛固定30分钟在室温和洗了三次5分钟使用冰冷PBST (PBS含有0.5%渐变20)。之后,板块中孵化PBST Triton x - 100 0.5% (PBS 1 L pH值7.2 + 0.5毫升渐变20)15分钟与PBST permeabilize细胞随后冲洗5分钟的三倍。不具体的绑定使用阻断缓冲区阻塞(PBST 5% BSA)在室温下1小时。板块与PBST冲洗三次5分钟然后40gydF4y2Ba µgydF4y2Bal鸡单克隆anti-VP2-IBDV特定主要抗体(美国查尔斯河实验室)稀释1:200年与无菌蒸馏水被孵化掉在随后的细胞在4°C暗调湿室过夜。盘子都洗了三次5分钟PBST和40gydF4y2Ba µgydF4y2BaL(多克隆兔anti-chicken-FITC共轭二次抗体对鸡IgY-Fc(σgydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba奥尔德里奇,200年德国)和稀释1:无菌蒸馏水是掉在每个幻灯片包含井和孵化在黑暗中在室温1小时。板块与PBST冲洗5分钟和20的三倍gydF4y2Ba µgydF4y2Bal (4′, 6-diamidino-2-phenylindole盐酸盐(DAPI)(德国Sigma-Aldrich)添加到盘子和孵化10分钟在室温和PBST简要清洗盘子。封面都干,放在一个标签干净玻璃幻灯片使用mountant (DPX)荧光显微镜检查(瑞士徕卡微系统有限公司,Heerbrugg) VP2抗原阳性细胞(gydF4y2Ba 28gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

 2.8。反向Transcriptase-Polymerase连锁反应(rt - pcr)gydF4y2Ba

中东欧通道12和bgm的凸轮匀浆- 70细胞培养上清液通道1、5、10、15、16、17、18、19日和20个被用于RNA提取,互补脱氧核糖核酸的合成,PCR分析。简单地说,250年gydF4y2Ba µgydF4y2Ba我的凸轮匀浆或细胞培养上清液在750年1.5毫升无菌埃普多夫管和分发gydF4y2Ba µgydF4y2Bal的试剂盒®LS在1:添加3比率。混合物是由几个resuspended——downpipetting和允许在室温下放置15分钟。氯仿(200gydF4y2Ba µgydF4y2BaL)添加到混合物,动摇了15秒,然后允许在室温下站5分钟在12000×g离心之前15分钟在4°C。上清晰的水相含有RNA轻轻地从两个有机和DNA阶段到新标签1.5毫升管用于RNA降水。五百毫升100%的异丙醇被添加到每个管并允许站在室温下10分钟前在12000×g离心10分钟和异丙醇被丢弃而RNA是用1000年gydF4y2Ba µgydF4y2BaL 75%的酒精和7500×g离心5分钟。酒精是丢弃和RNA颗粒部分干二级生物安全柜内部最后5到10分钟的35gydF4y2Ba µgydF4y2BaL无菌的核糖核酸酶游离水被添加到resuspend RNA浓度的测定,纯度,随后为下游应用程序使用。提取的RNA是用来放大VP2高变区部分的基因组RNA序列。gydF4y2Ba

 2.9。互补脱氧核糖核酸的合成gydF4y2Ba

提取的RNA被用来合成cDNA用MMLV cDNA合成装备以下试剂混合物和条件:RNA模板(10gydF4y2Ba µgydF4y2Ba自由水(1.5 L),核糖核酸酶gydF4y2Ba µgydF4y2BaL)和随机寡聚物(1.0gydF4y2Ba µgydF4y2BaL)。混合短暂离心,在65°C的环境2分钟,迅速在冰上冷却5分钟后2.0gydF4y2Ba µgydF4y2Bal MMLV缓冲区,2.0gydF4y2Ba µgydF4y2BaL德勤,2.0gydF4y2Ba µgydF4y2Ba0.5 L的核苷酸gydF4y2Ba µgydF4y2BaRiboguard L和1.0gydF4y2Ba µgydF4y2BaL逆转录酶的添加到反应总量为20gydF4y2Ba µgydF4y2Bal .混合物轻轻混合,短暂离心,孵化后60分钟37°C的温度提高到85°C 5分钟使用周期性条件见表gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

用IBDV RNA模板互补脱氧核糖核酸的合成。gydF4y2Ba

条件gydF4y2Ba 温度(°C)gydF4y2Ba 时间gydF4y2Ba 周期gydF4y2Ba
第一个变性gydF4y2Ba 98年gydF4y2Ba 2分钟gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba
第二个变性gydF4y2Ba 98年gydF4y2Ba 30秒gydF4y2Ba 35gydF4y2Ba
退火gydF4y2Ba 56gydF4y2Ba 30秒gydF4y2Ba 35gydF4y2Ba
扩展gydF4y2Ba 72年gydF4y2Ba 1分钟gydF4y2Ba 35gydF4y2Ba
最后扩展gydF4y2Ba 72年gydF4y2Ba 10分钟gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba
2.10。PCR扩增gydF4y2Ba

合成cDNA是用作PCR扩增模板使用KAPA HIFI PCR试剂盒(KAPA生物系统公司,波士顿,麻萨诸塞州,美国)使用以下试剂体积和浓度作为推荐的制造商:5 x KAPA HIFI缓冲10.0gydF4y2Ba µgydF4y2Ba1 L (x) 10毫米KAPA核苷酸混合1.5gydF4y2Ba µgydF4y2BaL(0.3毫米),10gydF4y2Ba µgydF4y2Ba1.5 M正向引物gydF4y2Ba µgydF4y2BaL (0.3gydF4y2Ba µgydF4y2Ba米),10gydF4y2Ba µgydF4y2Ba米反向引物1.5gydF4y2Ba µgydF4y2BaL (0.3gydF4y2Ba µgydF4y2Ba5米),模板DNAgydF4y2Ba µgydF4y2BaL, 1 U /gydF4y2Ba µgydF4y2Ba1.0 L KAPA HiFi DNA聚合酶gydF4y2Ba µgydF4y2BaL U (1), 4.5gydF4y2Ba µgydF4y2BaL PCR-grade水前25gydF4y2Ba µgydF4y2BaL反应总额。以下引物前面描述(刘et al ., 1994)被用来放大hvVP2序列643 - bp地区:643 - 1 (5′-TCACCGTCCTCAGCTTAC-3′)和643 - 2 (5′-TCAGGATTTGGGATCAGC-3′)。混合物被短暂离心和孵化PCR循环条件如表所示gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

PCR循环条件用于放大合成互补脱氧核糖核酸模板。gydF4y2Ba

条件gydF4y2Ba 温度gydF4y2Ba 时间gydF4y2Ba 周期gydF4y2Ba
最初的变性gydF4y2Ba 95°CgydF4y2Ba 3分钟gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba
变性gydF4y2Ba 98°CgydF4y2Ba 20秒gydF4y2Ba 35gydF4y2Ba
退火gydF4y2Ba 60°CgydF4y2Ba 15秒gydF4y2Ba 35gydF4y2Ba
扩展gydF4y2Ba 72°CgydF4y2Ba 15-60秒/ kbgydF4y2Ba 35gydF4y2Ba
最后扩展gydF4y2Ba 72°CgydF4y2Ba 1分钟/ kbgydF4y2Ba 1gydF4y2Ba
2.11。核苷酸序列分析gydF4y2Ba

确认pathotypic中东欧和bgm的身份- 70改编病毒,所有的放大643个基点PCR产品不同段落由桑格直接测序法(一垒实验室Seri Kembangan,雪兰莪州,马来西亚)和核苷酸序列分析使用BioEdit序列比对编辑器v7.2.5(汤姆大厅,宜必思生物科学,卡尔斯巴德,CA)。系统发育分析进行使用gydF4y2Ba 大型gydF4y2Baversion 7 (gydF4y2Ba 19gydF4y2Ba]。核苷酸序列的一致性是通过使用Clustal W,和系统发育树的设计与neighbor-joining (NJ)方法和1000引导程序复制。核苷酸序列分析的部分职位637到879氨基酸对应位置和编号根据213年到293年(gydF4y2Ba 31日gydF4y2Ba]。用于比较的序列组成非常致命,变体,和古典血清型1和血清型2 IBDV如表所示gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

加入的名字,号码,原产地国家,和引用的序列用于核苷酸、氨基酸,和系统发育分析与UPM0081 UPM190隔离。gydF4y2Ba

S /数量gydF4y2Ba 序列gydF4y2Ba 应变gydF4y2Ba 加入数量gydF4y2Ba 国家gydF4y2Ba 引用gydF4y2Ba
(1)gydF4y2Ba UPM94/230gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba AY520911.1gydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba 谭et al ., 2004gydF4y2Ba
(2)gydF4y2Ba UPM94/273gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba AF527039.1gydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba 香港et al ., 2004gydF4y2Ba
(3)gydF4y2Ba 芬欧蓝B0081gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba FJ824699.1gydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba 穆罕默德et al ., 2009gydF4y2Ba
(4)gydF4y2Ba UPM92-04gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba AF262030.1gydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba
(5)gydF4y2Ba 应变哈尔滨gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba AF092171.1gydF4y2Ba 中国gydF4y2Ba 胡&张,1998gydF4y2Ba
(6)gydF4y2Ba 应变SA-KZN95gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba KF241548.1gydF4y2Ba 南非gydF4y2Ba Vukea et al ., 2014gydF4y2Ba
(7)gydF4y2Ba IBDV77 /格鲁吉亚休假gydF4y2Ba 疫苗gydF4y2Ba JX424076.1gydF4y2Ba 尼日利亚gydF4y2Ba 达姆,2012gydF4y2Ba
(8)gydF4y2Ba 应变埃德加gydF4y2Ba 细胞培养适应gydF4y2Ba AY462026.1gydF4y2Ba 美国gydF4y2Ba Petkov et al ., 2007gydF4y2Ba
(9)gydF4y2Ba 韩国(应变)gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba AF165151.1gydF4y2Ba 韩国gydF4y2Ba Kwon et al ., 2000gydF4y2Ba
(10)gydF4y2Ba UK661gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba X92760.1gydF4y2Ba 英国gydF4y2Ba 布朗和斯金纳,1996年gydF4y2Ba
(11)gydF4y2Ba GA97gydF4y2Ba vIBDVgydF4y2Ba AY963132.1gydF4y2Ba 美国gydF4y2Ba 之旅,Jackwood 2005gydF4y2Ba
(12)gydF4y2Ba iraq12.i27 - 743gydF4y2Ba IBDVgydF4y2Ba KC352669.1gydF4y2Ba 库尔德斯坦和伊拉克gydF4y2Ba Gergis Jackwood, 2013gydF4y2Ba
(13)gydF4y2Ba ISR13gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba AY907012.1gydF4y2Ba 美国gydF4y2Ba Jackwood大梁,2005gydF4y2Ba
(14)gydF4y2Ba UPM0081EP12gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba KY411641gydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(15)gydF4y2Ba UPM190EP12gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
S /数量gydF4y2Ba 的名字gydF4y2Ba 应变gydF4y2Ba 加入数量gydF4y2Ba 国家gydF4y2Ba 引用gydF4y2Ba
(16)gydF4y2Ba IBDV /土耳其/ PA / 00924/14gydF4y2Ba 血清型2gydF4y2Ba KP642112.1gydF4y2Ba 美国gydF4y2Ba 陆、唐叶,et al ., 2015gydF4y2Ba
(17)gydF4y2Ba OKYMgydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba D49706.1gydF4y2Ba 日本gydF4y2Ba 山口,小川,Inoshima, et al ., 1995gydF4y2Ba
(18)gydF4y2Ba Thai4经典gydF4y2Ba caIBDVgydF4y2Ba AY907014gydF4y2Ba 泰国gydF4y2Ba Jackwood大梁,2005gydF4y2Ba
(19)gydF4y2Ba JNeto-BRgydF4y2Ba IBDVgydF4y2Ba AY780423gydF4y2Ba 巴西gydF4y2Ba Hayashi,布和费雷拉,2004gydF4y2Ba
(20)gydF4y2Ba 应变EgydF4y2Ba vIBDVgydF4y2Ba AY819703gydF4y2Ba 美国gydF4y2Ba Khatri沙玛,2004gydF4y2Ba
(21)gydF4y2Ba 紧张我gydF4y2Ba vIBDVgydF4y2Ba AY819702gydF4y2Ba 美国gydF4y2Ba Khatri沙玛,2004gydF4y2Ba
(22)gydF4y2Ba 应变STCgydF4y2Ba caIBDVgydF4y2Ba AY819701gydF4y2Ba 美国gydF4y2Ba Khatri沙玛,2004gydF4y2Ba
(23)gydF4y2Ba 西班牙1gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba AY907007gydF4y2Ba 西班牙gydF4y2Ba Jackwood大梁,2005gydF4y2Ba
(24)gydF4y2Ba D78gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba EU162087.1gydF4y2Ba 美国gydF4y2Ba Jackwood d J。,Sreedevi,LeFeveret al., 2008
(25)gydF4y2Ba 应变B00/81 (Pre-adaptation)gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba AY520910.1gydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba 谭et al ., 2004gydF4y2Ba
(26)gydF4y2Ba HK46gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba AF092943gydF4y2Ba 香港gydF4y2Ba Lim曹,Yu et al ., 1999gydF4y2Ba
(27)gydF4y2Ba Cevac-Gumbo-LgydF4y2Ba 疫苗gydF4y2Ba EU544158gydF4y2Ba 巴西gydF4y2Ba 阿伯,戈麦斯Resende et al ., 2008gydF4y2Ba
(28)gydF4y2Ba Singapore97S181gydF4y2Ba IBDVgydF4y2Ba DQ916216gydF4y2Ba 新加坡gydF4y2Ba Jackwood Sommer-Wagner, 2006gydF4y2Ba
(29)gydF4y2Ba 哦,应变gydF4y2Ba 血清型2gydF4y2Ba U30818.1gydF4y2Ba 加拿大gydF4y2Ba Kibenge。麦凯纳Dybing, 1995gydF4y2Ba
(30)gydF4y2Ba UPM190BGMP15gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba KY418010gydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(31)gydF4y2Ba UPM190BGMP20gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba KY418009gydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(32)gydF4y2Ba UPM0081BGMP20gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba KY418011gydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(33)gydF4y2Ba UPM04/190 (Pre-adaptation)gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba KU958716.1gydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba 刘,Hair-Bejo,奥马尔et al ., 2016gydF4y2Ba
(34)gydF4y2Ba UPM190EP1gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(35)gydF4y2Ba UPMBGMP0081P15gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba KY418012gydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(36)gydF4y2Ba UPMBGMP0081P16gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(37)gydF4y2Ba UPMBGMP0081P17gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(38)gydF4y2Ba UPMBGMP0081P18gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(39)gydF4y2Ba UPMBGMP0081P19gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(40)gydF4y2Ba UPMBGMP0081P10gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(41)gydF4y2Ba UPMBGMP0081P5gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(42)gydF4y2Ba UPMBGMP0081P1gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(43)gydF4y2Ba UPMBGMP190P16gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(44)gydF4y2Ba UPMBGMP190P17gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(45)gydF4y2Ba UPMBGMP190P18gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(46)gydF4y2Ba UPMBGMP190P19gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(47)gydF4y2Ba UPMBGMP190P10gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(48)gydF4y2Ba UPMBGPM190P5gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(49)gydF4y2Ba UPMBGMP190P1gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(50)gydF4y2Ba UPM190EP1gydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba 马来西亚gydF4y2Ba Lawal、Hair-Bejo艾尔沙德,et al ., 2016gydF4y2Ba
(51)gydF4y2Ba 韩国IBDVgydF4y2Ba vvIBDVgydF4y2Ba AF508177.1gydF4y2Ba 韩国gydF4y2Ba 金姆和杨,2002年gydF4y2Ba
3所示。结果gydF4y2Ba 3.1。特定的无菌孵化蛋gydF4y2Ba

两种病毒株显示典型的炎症性肠病病变包括颅内出血,肝脏的大理石花纹,头部的水肿,充血,腹胀EP2 EP12。平均5天胚胎死亡率π。UPM0081隔离了病变如充血,ecchymotic出血大腿,胸部肌肉,斑驳的肝脏(有时苍白或黄色),头部的水肿,颅内出血,相形见绌。隔离UPM190诱导偶尔充血或苍白,ecchymotic出血的大腿和胸部的肌肉,颅内出血,腹胀,皮下水肿,斑驳的肝脏(数字gydF4y2Ba 1(一)gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 1 (d)gydF4y2Ba在EP12)两个隔离。gydF4y2Ba

vvIBDV感染SPF胚胎(a)颅内出血(UPM0081), (b)充血,腹胀,和皮下水肿(UPM190), (c)瘀斑的出血在胸前的肌肉(UPM0081)和(d)斑驳EP12肝脏(UPM0081)。gydF4y2Ba

 3.2。改编的病毒bgm - 70细胞系gydF4y2Ba

正常汇合的单层bgm - 70细胞与成纤维细胞形态(图72小时内获得gydF4y2Ba 2(一个)gydF4y2Ba)。在第一段中,病毒诱导小CPE与单层剩余100%完整4天π。CPE的证据显示从第五天π的病毒开始适应细胞系。在BGMP2, CPE发达4天π和第七天π和P5达到20%;清晰的CPE发达在48小时内π。CPE的特点是小折射的圆形细胞,胞质肉芽,细胞分离,缓慢破坏单层白天6π(图gydF4y2Ba 2 (b)gydF4y2Ba)。CPE变得微妙P18开始出现只有9天后π建议减少毒性传播病毒(数字gydF4y2Ba 2 (c)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba 2 (d)gydF4y2Ba)。感染了病毒的效价BGMP5被发现10gydF4y2Ba9.98gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba/毫升和10gydF4y2Ba9.50gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba在3天π/毫升UPM190 UPM0081,分别。gydF4y2Ba

(a)一个正常汇合的单层bgm - 70细胞与(b) UPM0081相比,BGMP5诱导CPE bgm - 70感染细胞包括小折射细胞,细胞质造粒,细胞舍入,在6天π和超然。(c) bgm - 70细胞感染UPM0081 BGMP18和(d) UPM190 BGMP19和8 9天,分别显示小CPE与第五天(e)未感染的控制,并在第七天(f)。酒吧= 100gydF4y2Ba µgydF4y2Bam。gydF4y2Ba

 3.3。吖啶橙/碘化Propidium细胞凋亡测定gydF4y2Ba

细胞凋亡测定用AO /π染料显示,在24小时内π,IBDV引发一些感染细胞进行细胞凋亡的病毒传播(图gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba)。AO染料染色正常和凋亡细胞的细胞核绿色因为它成为绑定到DNA,因为它可以很容易地穿透完整活细胞的膜,而PI染色只能渗透细胞,破坏膜细胞凋亡和坏死等污渍橙红色为红色。凋亡细胞被证明了橙色颜色(人物的存在gydF4y2Ba 3 (c)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba 3 (f)gydF4y2Ba)由于AO /π的染料和膜起泡(图gydF4y2Ba 3 (f)gydF4y2Ba)在24和48小时π比未感染的控制(图gydF4y2Ba 3(我)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

(一)AO染色,(b)π染色,和(c)合并感染UPM0081 bgm - 70细胞显示green-orange荧光作为早期的指标(白色箭头),中间(黄色箭头)和晚期凋亡(蓝色箭头)和坏死(白色箭头)在24小时内π。酒吧= 50gydF4y2Ba µgydF4y2Bam。(d) AO染色,(e)π染色,(f)合并感染UPM190 bgm - 70细胞显示膜起泡(白色箭头)和积极的病毒引发的橙色在48小时内π凋亡的标志。酒吧= 50gydF4y2Ba µgydF4y2Bam。(g) AO染色,PI染色(h),(我)合并感染控制bgm - 70细胞显示正常unapoptotic(白色箭头)和坏死细胞(黄色箭头)后24小时内文化。酒吧= 50gydF4y2Ba µgydF4y2Bam。gydF4y2Ba

 3.4。间接Immunoperoxidase化验gydF4y2Ba

验证存在IBD病毒感染bgm - 70细胞,间接immunoperoxidase试验进行感染细胞生长在玻璃幻灯片。分析导致胞浆内的存在棕色颜色表明IBDV的存在VP2在bgm - 70感染细胞的胞浆抗原(图gydF4y2Ba 4(一)gydF4y2Ba)比未感染的控制(图gydF4y2Ba 4 (b)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

(a) Immunoperoxidase积极bgm布朗- 70细胞显示细胞质沉淀相比(b)未受感染的bgm - 70细胞。gydF4y2Ba

感染IBDV bgm - 70细胞显示蓝色荧光与DAPI染色时(a) (b)绿色荧光染色时FITC-labeled anti-chicken指示VP2抗原和抗体(c)两个渠道时的荧光被合并(c),未受感染的bgm - 70控制(d, e, f)没有绿色荧光由于缺乏IBDV VP2抗原在细胞内。gydF4y2Ba

 3.5。间接免疫荧光试验gydF4y2Ba

进一步证实VP2病毒抗原的存在bgm - 70细胞的细胞质内,间接免疫荧光法测定。分析揭示了积极的绿色荧光IBDV VP2蛋白在细胞质和感染细胞的核膜(绿色)比未接种负控制显示只激发核DAPI染色(蓝色)。绿色信号VP2抗原的存在因此表明IBD病毒的存在在细胞质和感染bgm - 70细胞的核膜。gydF4y2Ba

 3.6。反向Transcriptase-Polymerase连锁反应(rt - pcr)gydF4y2Ba

中东欧和bgm - 70改造病毒的鉴定证实了通过胚胎病变和CPE的出现一个明显的643个基点乐队当一个rt - pcr的凸轮匀浆和bgm - 70细胞培养上清液和产品分析了凝胶电泳,溴化乙锭染色(图gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

rt - pcr产品bgm - 70细胞培养上清液显示100个基点分子梯(巷1),nontemplate控制(通道2和3),负控制(巷4),积极控制(5道),UPM0081(巷6),和UPM190(巷7)。gydF4y2Ba

 3.7。核苷酸序列分析gydF4y2Ba

确认身份的rt - pcr产品IBDV基因组,rt - pcr产物直接测序和分析使用BioEditgydF4y2Ba vgydF4y2Ba7和大型gydF4y2Ba vgydF4y2Ba7所示。两个隔离的核苷酸序列对齐ClustalW连同其他参考序列(图gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba)。对齐序列显示,在642年和645年,核苷酸位置有变化从C和G T和核苷酸序列的预适应UPM04/190父病毒,UPM190EP1, UPM190EP12 UPM190BGMP5, UPM190BGMP10。从职位648 - 650,UPM04/190标签相比CTC被隔离的其余部分包括参考序列。在652年到654年,核苷酸位置有从柠檬酸在UPM04/190 AGC核苷酸突变。其它核苷酸突变观察C660T、A663G A666G, T669C, A675G, A693C, T696C, T699C, C702T, C708G, C711T, A714C, C720G, C726T, G729C, A732C, A752C, C759G, T758G T777C, C780G。其他人包括C786T、C789T T792G、G807C T810C, A816G, C819T A823C, A825T。进一步变化被发现在T828G、C834G A837G, C840T, T843C, G846C, A849G, G852C, C855G, T861C, C864T, T870G A876G, C879T。此外,隔离UPM190EP1、UPM190EP12 UPMBGMP5, UPMBGMP10核苷酸变化观察到参考序列。gydF4y2Ba

分离株的核苷酸序列。645个基点的核苷酸序列片段的VP2高变区比较中东欧和bgm - 70适应马来西亚的隔离和参考序列。点(.)表示与AF508177.1共识,韩国IBDV隔离,破折号(-)表示缺口。gydF4y2Ba

当预适应的核苷酸序列、中东欧bgm - 70改编,和参考隔离被翻译成氨基酸,假定的图案识别vvIBDV致病型被揭示异亮氨酸(I)在242年职位,256年,294年和299年丝氨酸(S)的位置(图gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba)。国际开发协会图案在234年到236年出现氨基酸位置预适应和中东欧和bgm - 70改编病毒(图gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba)。在249位置,UPM04/190、UPM190EP1 UPM190EP12, UPM190BGMP1, UPM190BGMP5拥有氨基酸E249代替Q249被其他中东欧和bgm - 70菌株。同样,所有的参考序列具有Q249拥有H249 KF241548.1除外。同样,在270年的位置,芬欧蓝B0081预适应病毒,UPM04/190, UPM190EP1 UPM190EP12, UPM190BGMP5 UPM190BGMP10和其他参考序列具有丙氨酸在那个位置,而其他中东欧和bgm - 70改编病毒谷氨酸(E270)位置。但是拥有一个参考序列,T, S,或者V在那个位置除了AF527039.1和U30818.1拥有E270氨基酸。279年在氨基酸位置,只有UPM190EP12, UPMBGM190P1, UPMBGM190P5拥有一个天冬酰胺(N),而预适应父母病毒和其他中东欧和bgm - 70改编隔离具有D(图gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba)。然而回归N279突变的病毒进一步连续通过bgm - 70细胞系。gydF4y2Ba

推导的氨基酸序列的隔离。图gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba显示了位置的推导氨基酸序列213 - 293中东欧和bgm - 70改编UPM190和UPM0081隔离显示高相似性与参考vvIBDV来自世界不同的地方,如UK661 HK46, JNeto-BR, SA-KZN95欧。聂96 - 09年,iraq12.127 - 743但与经典的显著差异,变体,血清型2参考隔离。注意E249和E270(盒装)氨基酸存在于一些适应病毒未见的其他vvIBDV除了UPM94/273,马来西亚孤立和不寻常的致病性血清型2哦压力。gydF4y2Ba

核苷酸序列的系统发育分析表明我们隔离集群的序列vvIBDV隔离来自欧洲、亚洲、中东和非洲存入基因库中分析(图gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba)。距离矩阵(图gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba公司芬欧汇川集团)透露成对相似性指数从B0081 0.8%和AF508177不同,10.9%不同细胞培养适应埃德加压力,11.5%和AY819701不同,不同与AY963132 9%, 8%和JX424076.1不同,43.4%与U30818不同,45.9%与KP642112.1不同。UPM190和UPM0081序列相比,公司芬欧汇川集团预适应B0081 33.8% UPM04/190和0.4% - 3.4%不同与其他中东欧和bgm - 70隔离。另一方面,UPM04/190 33.2%不同AF508177和34.5%的中东欧和bgm - 70除了UPM190BGMP1 UPM190BGMP5和UPM190EP12不同与UPM190P1 32.5%和31.8%。此外,当UPM04/190与血清型2隔离,U30818.1不同而KP642112不同它62.9% 64.9%。其余的中东欧和bgm - 70改编隔离不同与UPM04/190在0.4%和3.9%之间。序列用于构建系统发育树,计算距离矩阵如表所示gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

核苷酸系统发育树分析。系统发育分析的高变区IBDV的VP2基因片段的基因组核苷酸位置637到876。预适应,中东欧和bgm - 70改编病毒位于红色分支。的vvIBDV致病型包含在分析AJ878898, AF051838, KF241548, AF508177, D49706.1, X92760, AY780423, AF262030.1, AY520910.1, AF092171.1, AY907007, KC352669.1, AY907012.1 AJ586926.1, DQ916216。JX424079.1、AY462026 EU162087、AY819703 EU544158, AY907014, AY819702, AY819701 AY963132.1代表经典的菌株,而U30818.1 KP642112.1代表血清型2序列。进化历史和距离推断使用neighbor-joining方法(gydF4y2Ba 17gydF4y2Ba和木村出现的方法gydF4y2Ba 18gydF4y2Ba),分别。进化分析进行MEGA7 [gydF4y2Ba 19gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

种系发生树推导的氨基酸。50个氨基酸序列被用来推断进化历史使用neighbor-joining方法(gydF4y2Ba 17gydF4y2Ba和1000引导测试gydF4y2Ba 20.gydF4y2Ba]。泊松校正方法被用来计算进化距离(gydF4y2Ba 21gydF4y2Ba]。分析了MEGA7进行(gydF4y2Ba 19gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

 4所示。讨论gydF4y2Ba

爆发在鸡vvIBDV证实通过rt - pcr和限制性片段长度多态性(RFLP)技术是在马来西亚报告(gydF4y2Ba 22gydF4y2Ba和世界其他地方。主要SPF中东欧和几个连续的鸟类和哺乳动物细胞系包括bgm - 70细胞据报道支持许多病毒的增长和传播感染脊椎动物和无脊椎动物物种包括IBDV [gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 21gydF4y2Ba]。在这项研究中,两个马来西亚vvIBDV隔离指定UPM0081和UPM190适应连续通道12次在中东欧和后来适应生长在bgm - 70,连续细胞系的哺乳动物的起源。连续的哺乳动物细胞系在中东欧的优点包括在其他方面,如缺乏与禽流感病毒污染,易于处理、低成本、无限寿命,和易于维护gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba]。大多数商用疫苗感染IBDV的控制尤其是非常致命的IBDV (vvIBDV)致病型蛋,让他们生产费劲的,昂贵的,一个可能的来源的垂直传播重要的禽流感病毒接种疫苗的羊群。需要基于从鸡蛋到细胞培养IBD疫苗开发使用vvIBDV作为种子病毒是非常重要的为了减少劳动力和生产成本高,但问题是,vvIBDV报道很难适应细胞培养(gydF4y2Ba 32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 33gydF4y2Ba]。失败的尝试适应vvIBDV隔离从荷兰、台湾和土耳其bgm - 70细胞系以前记录[10盲人通道后gydF4y2Ba 25gydF4y2Ba]。在这项研究中,研究vvIBDV菌株通过8倍防晒系数中东欧前使用串行接种bgm - 70文化没有CPE发展的10倍。在这项研究中,两个马来西亚vvIBDV隔离UPM0081和UPM190成功改编bgm - 70细胞株与独特的CPE发展通道5。这类似于哈桑的观察和同事(gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba)和Abdel-Alim赛义夫(gydF4y2Ba 34gydF4y2Ba]在古典(STC)和变体()IBDV成功改编bgm - 70细胞在两和三只瞎段落,分别与CPE的发展特征。此外,报告El-mahdy et al。gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba)的适应当地埃及vaIBDV隔离在bgm - 70细胞株高病毒产量(通道1和gydF4y2Ba 日志gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba ⁡gydF4y2Ba 7所示。5gydF4y2Ba TCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba/毫升)同意我们的发现为IBDV UPM190和UPM0081产生病毒效价高10gydF4y2Ba9.98gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba/毫升和10gydF4y2Ba9.50gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba分别/毫升,72小时后感染通过5。gydF4y2Ba

早些时候调查的有效性bgm - 70细胞系IBDV的传播表明,串行传播的经典(STC)和变体(在)IBDV低至4通道导致丧失致病性(gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba];同样,连续使高达30段落(变异株)或40通道(变体E应变)会导致病毒的复制能力的丧失囊的SPF鸡活疫苗,但使用时保护鸡对实验的挑战时,病毒被用作灭活疫苗(gydF4y2Ba 26gydF4y2Ba]。在这项研究中,两种病毒是通过仅在20倍bgm - 70细胞病毒效价高收益率(log10 9.98 TCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba/毫升,gydF4y2Ba lgydF4y2Ba ogydF4y2Ba ggydF4y2Ba 10gydF4y2Ba 9.50 TCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba分别/毫升UPM190和UPM0081);有需要评估他们的致病性,免疫原性和有效性,建立其效用挑战实验性研究潜在的减毒活疫苗和灭活疫苗的候选人。gydF4y2Ba

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡细胞高度管制的因素表现为不同的形态细胞学的变化如染色质缩合、核分裂和膜起泡gydF4y2Ba 35gydF4y2Ba]。某些染色方法在识别和开发援助的分化凋亡坏死细胞,包括膜联蛋白V污点,4′,6-diamidino-2-phenylindole DAPI染色,吖啶橙/溴化乙锭/ propidium碘染色,和赫斯特污渍。这些荧光染料的发射荧光,当它们与DNA结合,认为在一定的激发光谱和荧光显微镜(gydF4y2Ba 36gydF4y2Ba]。细胞系的生产性感染IBDV与诱导细胞凋亡有关(gydF4y2Ba 30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 38gydF4y2Ba),这一过程与非结构IBDV VP5蛋白质,只有在IBDV感染细胞gydF4y2Ba 37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 39gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 41gydF4y2Ba]。使用AO /π染料染色感染文化被用来区分凋亡和坏死细胞(gydF4y2Ba 30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 36gydF4y2Ba]。橘子颜色的存在与AO /π双重染色后细胞凋亡被认为是其中一个指标的核分裂,旁边凝结,膜起泡gydF4y2Ba 42gydF4y2Ba]。在这项研究中,AO /πVP5染料被用来演示细胞凋亡诱导的非结构蛋白感染IBDV的认为只有在生产(gydF4y2Ba 30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 37gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 41gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 43gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 44gydF4y2Ba]。感染IBDV的双重染色bgm和AO - 70细胞/π染料允许细胞发生细胞凋亡的检测证明的橙色颜色染色细胞的细胞核,在荧光显微镜下观察。存在碘化propidium细胞表明细胞膜完整性的损失;因此这染料只能渗透到受损的细胞染色细胞核红色。吖啶橙另一方面容易穿过细胞膜健康和早期凋亡细胞和染色细胞核的绿色。细胞的存在这两种染料在染色细胞核橙色,红色是一个损失的证据膜选择性渗透中只看到死细胞。红核的染色AO的PI相结合表明坏死细胞而橙色颜色表明接受晚期凋亡的细胞(gydF4y2Ba 42gydF4y2Ba]。这种技术是素雅的能力区分死细胞发生细胞凋亡在应对IBD病毒等不愉快的刺激。gydF4y2Ba

进一步证实感染IBDV的存在在bgm - 70细胞,免疫组织化学和免疫荧光技术进行识别抗原阳性细胞(gydF4y2Ba 44gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 48gydF4y2Ba]。VP2抗原的存在,表现出immunoperoxidase以及免疫荧光感染细胞的细胞质内48小时π表示bgm - 70细胞株的能力来支持这两个vvIBDV分离株的生长和复制,因为据报道,病毒复制在感染细胞的细胞质代病毒衣壳蛋白(VP2、VP3)在48小时内π(gydF4y2Ba 30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 50gydF4y2Ba]。这两个技术是敏感的和特定的和有用的诊断工具的检测和定位IBDV在受感染的细胞和组织。gydF4y2Ba

分子使用rt - pcr分析,序列,序列分析表明,两个隔离系统相关vvIBDV发现在亚洲、欧洲、中东、和非洲由于A222[的存在gydF4y2Ba 51gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 52gydF4y2Ba)和I242 I256、I294 S299 [gydF4y2Ba 51gydF4y2Ba)在其VP2高变的氨基酸组成比caIBDV或拥有V222 vaIBDV,弗吉尼亚州,E256或血清型2病毒拥有P222, V242,我或S256 N或F294和T P299 [gydF4y2Ba 51gydF4y2Ba在相同的地区]。233 - 236年艾达主题的存在在我们的压力就像其他IBDV表明这些病毒能适应细胞培养,因为据报道这些氨基酸是重要的细胞培养适应(gydF4y2Ba 51gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 53gydF4y2Ba通过整合素受体)。此外,在中东欧使UPM190分离获得突变在D279N EP12,据报道的突变部分的两个变化观察到减毒和/或细胞培养适应IBD病毒(gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 54gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 56gydF4y2Ba]。然而,当病毒在bgm - 70细胞通道,N279恢复回到D279见bgm - 70改编的氨基酸序列的病毒。这个孤立的能力只有单一突变在bgm D279N复制- 70细胞培养表明,也许独自D279N突变可以促进细胞培养IBDV的适应性非常强毒株。这可能是为什么UPM190复制UPM0081相比更有效率和更明显CPE的氨基酸在中东欧段落保持不变。此外,bgm - 70适应导致其他UPM190氨基酸序列的突变位置E249Q和A270E VP2高变区。只在UPM94/273 A270E突变之前报道,vvIBDV与不寻常的致病性,在不致病的血清型2哦应变[gydF4y2Ba 57gydF4y2Ba]。之前在特定网站报道,两个氨基酸的变化可能导致病毒衰减(gydF4y2Ba 58gydF4y2Ba]。的外观A270E序列中的突变bgm - 70年改编UPM190可能负责减少CPE bgm - 70年观察到的细胞培养显示衰减。然而,UPM0081, A270E突变收购在中东欧在隔离通道,适应适应bgm - 70细胞系。的重要性,需要进一步的实验证实了这种突变涉及反向遗传技术。gydF4y2Ba

过去,所有的隔离属于vvIBDV发表的聚类与其他演化支vvIBDV参考序列存入资源库,表明bgm - 70使观察到的突变并没有导致隔离的致病型的变化。gydF4y2Ba

总之,减毒马来西亚vvIBDV得到12串行通道在中东欧紧随其后20串行通道在bgm - 70细胞系。一个氨基酸的变化被认为在中东欧UPM190通道12时回归隔离在bgm - 70细胞系,通过和两个氨基酸的变化被认为在UPM190和一个突变被认为在UPM0081 bgm - 70系列文章。据我们所知,这是第一个报道成功的适应当地的马来西亚vvIBDV隔离在bgm - 70细胞系;因此,本研究强调这个细胞系的优点gydF4y2Ba 在体外gydF4y2Ba传播vvIBDV在实验室和可能A270E突变可能扮演的角色作为衰减的一个小说网站,进一步加强在许多不同的网站的可能性VP2高变区可能参与IBDV衰减。gydF4y2Ba

 的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。gydF4y2Ba

 确认gydF4y2Ba

本研究赞助下TechnoFund项目(6364002),科学,技术和创新,马来西亚,和HiCoE项目(6369101)、高等教育、马来西亚。gydF4y2Ba

 DobosgydF4y2Ba P。gydF4y2Ba 山gydF4y2Ba b . J。gydF4y2Ba 哈雷特gydF4y2Ba R。gydF4y2Ba 凯尔经gydF4y2Ba d . T。gydF4y2Ba 白克gydF4y2Ba H。gydF4y2Ba TeningesgydF4y2Ba D。gydF4y2Ba 生物物理和生物化学特性bisegmented双链RNA基因组的5个动物病毒gydF4y2Ba 病毒学杂志gydF4y2Ba 1979年gydF4y2Ba 32gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 593年gydF4y2Ba 605年gydF4y2Ba 2 - s2.0 - 0018634084gydF4y2Ba 伯格gydF4y2Ba T。gydF4y2Ba 急性传染性法氏囊病在家禽:审查gydF4y2Ba 禽流感病理学gydF4y2Ba 2000年gydF4y2Ba http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/03079450050045431gydF4y2Ba 引导gydF4y2Ba h·J。gydF4y2Ba HoekmangydF4y2Ba a·J。gydF4y2Ba GielkensgydF4y2Ba a . L。gydF4y2Ba 非常致命的传染性法氏囊病病毒的毒性增强部分取决于它的b级gydF4y2Ba 档案病毒学gydF4y2Ba 2005年gydF4y2Ba 150年gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 137年gydF4y2Ba 144年gydF4y2Ba 10.1007 / s00705 - 004 - 0405 - 9gydF4y2Ba 麦克费兰gydF4y2Ba j·B。gydF4y2Ba 麦克纳尔蒂gydF4y2Ba m . S。gydF4y2Ba •麦基洛普爵士gydF4y2Ba e·R。gydF4y2Ba 康纳gydF4y2Ba t·J。gydF4y2Ba 麦克拉肯gydF4y2Ba r·M。gydF4y2Ba 柯林斯gydF4y2Ba d S。gydF4y2Ba 艾伦gydF4y2Ba g . M。gydF4y2Ba 隔离和血清学研究从鸡传染性法氏囊病病毒,火鸡和鸭子:演示第二个血清型gydF4y2Ba 禽流感病理学gydF4y2Ba 1980年gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba 395年gydF4y2Ba 404年gydF4y2Ba 2 - s2.0 - 33644919444gydF4y2Ba 10.1080 / 03079458008418423gydF4y2Ba HitchnergydF4y2Ba 美国B。gydF4y2Ba 传染性法氏囊病病毒的传染性胚胎的鸡蛋gydF4y2Ba 家禽科学gydF4y2Ba 1970年gydF4y2Ba 49gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 511年gydF4y2Ba 516年gydF4y2Ba 10.3382 / ps.0490511gydF4y2Ba 2 - s2.0 - 0014759105gydF4y2Ba 赵gydF4y2Ba b R。gydF4y2Ba 雷蒙德gydF4y2Ba r·G。gydF4y2Ba 山gydF4y2Ba r·W。gydF4y2Ba 传染性法氏囊病病毒的增长与斑块形成小鸡胚胎成纤维细胞细胞培养gydF4y2Ba 禽流感疾病gydF4y2Ba 1979年gydF4y2Ba 23gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 209年gydF4y2Ba 10.2307 / 1589688gydF4y2Ba 山口那津男gydF4y2Ba T。gydF4y2Ba 近藤gydF4y2Ba T。gydF4y2Ba InoshimagydF4y2Ba Y。gydF4y2Ba 小川gydF4y2Ba M。gydF4y2Ba 三好gydF4y2Ba M。gydF4y2Ba 柳井正gydF4y2Ba T。gydF4y2Ba MasegigydF4y2Ba T。gydF4y2Ba FukushigydF4y2Ba H。gydF4y2Ba 平井伯昌gydF4y2Ba K。gydF4y2Ba 体外衰减的高度传染性法氏囊病病毒的毒性:减毒株的一些特征gydF4y2Ba 禽流感疾病gydF4y2Ba 1996年gydF4y2Ba 40gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba 501年gydF4y2Ba 509年gydF4y2Ba 2 - s2.0 - 0030199129gydF4y2Ba 10.2307 / 1592257gydF4y2Ba LukertgydF4y2Ba P。gydF4y2Ba 伦纳德gydF4y2Ba J。gydF4y2Ba 戴维斯gydF4y2Ba R。gydF4y2Ba 传染性法氏囊病病毒:抗原生产和免疫力gydF4y2Ba 美国兽医研究杂志》上gydF4y2Ba 1975年gydF4y2Ba http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/164798gydF4y2Ba 哈桑gydF4y2Ba m·K。gydF4y2Ba Al-NatourgydF4y2Ba m Q。gydF4y2Ba 病房gydF4y2Ba l。gydF4y2Ba 赛义夫gydF4y2Ba y . M。gydF4y2Ba 致病性、衰减和传染性法氏囊病病毒的免疫原性gydF4y2Ba 禽流感疾病gydF4y2Ba 1996年gydF4y2Ba 40gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba 567年gydF4y2Ba 10.2307 / 1592265gydF4y2Ba JackwoodgydF4y2Ba d . H。gydF4y2Ba 赛义夫gydF4y2Ba y . M。gydF4y2Ba 休斯gydF4y2Ba j . H。gydF4y2Ba 传染性法氏囊病病毒的复制在连续细胞系gydF4y2Ba 禽流感疾病gydF4y2Ba 1987年gydF4y2Ba 31日gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 370年gydF4y2Ba 10.2307 / 1590888gydF4y2Ba KibengegydF4y2Ba f·S。gydF4y2Ba 麦肯纳gydF4y2Ba p K。gydF4y2Ba 传染性法氏囊病病毒隔离和传播使用绵羊的肾脏连续细胞系gydF4y2Ba 禽流感疾病gydF4y2Ba 1992年gydF4y2Ba 36gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 256年gydF4y2Ba 261年gydF4y2Ba 10.2307 / 1591499gydF4y2Ba 2 - s2.0 - 0026843585gydF4y2Ba El-MahdygydF4y2Ba 年代。gydF4y2Ba HayamgydF4y2Ba F。gydF4y2Ba NAgydF4y2Ba 一个。gydF4y2Ba 疫苗株在埃及gydF4y2Ba 是我gydF4y2Ba 2013年gydF4y2Ba http://www.usa-journals.com/wp-content/uploads/2013/09/El-mahdy_Vol110.pdfgydF4y2Ba KibengegydF4y2Ba f·S。gydF4y2Ba DhillongydF4y2Ba 答:S。gydF4y2Ba 罗素gydF4y2Ba r·G。gydF4y2Ba 增长的血清型I和II和传染性法氏囊病病毒变异株在维洛细胞。gydF4y2Ba 禽流感疾病gydF4y2Ba 1988年gydF4y2Ba 32gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 298年gydF4y2Ba 303年gydF4y2Ba 2 - s2.0 - 0023993303gydF4y2Ba 10.2307 / 1590816gydF4y2Ba 西摩尼gydF4y2Ba 我。gydF4y2Ba 费尔南德斯gydF4y2Ba M。gydF4y2Ba 库斯托迪奥gydF4y2Ba R。gydF4y2Ba 禽流感病毒的易感性的细胞系gydF4y2Ba 微生物学gydF4y2Ba 1999年gydF4y2Ba = sci_arttext http://www.scielo.br/scielo.php?pid=s0001 - 37141999000400015和脚本gydF4y2Ba AhasangydF4y2Ba M。gydF4y2Ba 侯赛因gydF4y2Ba K。gydF4y2Ba 伊斯兰教gydF4y2Ba M。gydF4y2Ba 改编的传染性法氏囊病病毒(IBDV)州立细胞系gydF4y2Ba 生物科学杂志》gydF4y2Ba 2002年gydF4y2Ba http://www.medwelljournals.org/ref.php?doi=jbs.2002.633.635gydF4y2Ba PetekgydF4y2Ba M。gydF4y2Ba D 'AprilegydF4y2Ba p . N。gydF4y2Ba CancellottigydF4y2Ba F。gydF4y2Ba 生物和物理化学性质的传染性法氏囊病病毒(ibdv)gydF4y2Ba 禽流感病理学gydF4y2Ba 1973年gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 135年gydF4y2Ba 152年gydF4y2Ba 2 - s2.0 - 0001243770gydF4y2Ba 10.1080 / 03079457309353791gydF4y2Ba 斯尼斯gydF4y2Ba p·h·A。gydF4y2Ba 索gydF4y2Ba R R。gydF4y2Ba 数值分类法:数值分类的原则和实践gydF4y2Ba 1973年gydF4y2Ba 旧金山,加州,美国gydF4y2Ba w·h·弗里曼gydF4y2Ba MR0456594gydF4y2Ba Zbl0285.92001gydF4y2Ba 木村gydF4y2Ba M。gydF4y2Ba 一个简单的方法估算的进化率基本替换通过核苷酸序列的比较研究gydF4y2Ba 杂志的分子进化gydF4y2Ba 1980年gydF4y2Ba 16gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 111年gydF4y2Ba 120年gydF4y2Ba 10.1007 / BF01731581gydF4y2Ba 2 - s2.0 - 0019296687gydF4y2Ba 库马尔gydF4y2Ba 年代。gydF4y2Ba StechergydF4y2Ba G。gydF4y2Ba (尽管)gydF4y2Ba K。gydF4y2Ba MEGA7:分子进化遗传学分析7.0版本的更大的数据集gydF4y2Ba 分子生物学与进化gydF4y2Ba 2016年gydF4y2Ba 33gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba 1870年gydF4y2Ba 1874年gydF4y2Ba 10.1093 / molbev / msw054gydF4y2Ba FelsensteingydF4y2Ba J。gydF4y2Ba 信心限制的发展史:使用引导的方法gydF4y2Ba 进化gydF4y2Ba 1985年gydF4y2Ba 39gydF4y2Ba 783年gydF4y2Ba 791年gydF4y2Ba 10.2307 / 2408678gydF4y2Ba 达尔gydF4y2Ba D。gydF4y2Ba 莱特gydF4y2Ba B。gydF4y2Ba 复苏的病毒从水改性絮凝过程的第二次浓度。:环境MicrobiolgydF4y2Ba 访问gydF4y2Ba 1986年gydF4y2Ba / /aem.asm.org/content/51/6/1326.shortgydF4y2Ba URL的httpgydF4y2Ba http://aem.asm.org/content/51/6/1326.shortgydF4y2Ba 棕褐色gydF4y2Ba d . 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M。gydF4y2Ba 免疫原性和抗原性的传染性法氏囊病病毒的毒性菌株gydF4y2Ba 禽流感疾病gydF4y2Ba 2001年gydF4y2Ba 45gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 92年gydF4y2Ba 101年gydF4y2Ba 2 - s2.0 - 0035067395gydF4y2Ba 10.2307 / 1593016gydF4y2Ba 蔡gydF4y2Ba h·J。gydF4y2Ba 赛义夫gydF4y2Ba y . M。gydF4y2Ba 细胞培养的影响通过两个变异菌株的致病性和免疫原性的传染性法氏囊病病毒gydF4y2Ba 禽流感疾病gydF4y2Ba 1992年gydF4y2Ba 36gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 415年gydF4y2Ba 10.2307 / 1591522gydF4y2Ba 里德gydF4y2Ba lgydF4y2Ba MuenchgydF4y2Ba H。gydF4y2Ba 一个简单的方法估计百分之五十的端点gydF4y2Ba 美国流行病学杂志》gydF4y2Ba 1938年gydF4y2Ba 27gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba 493年gydF4y2Ba 497年gydF4y2Ba 10.1093 / oxfordjournals.aje.a118408gydF4y2Ba HeydermangydF4y2Ba E。gydF4y2Ba Immunoperoxidase组织病理学技术:应用程序、方法和控制gydF4y2Ba 临床病理学杂志gydF4y2Ba 1979年gydF4y2Ba 32gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba 971年gydF4y2Ba 978年gydF4y2Ba 10.1136 / jcp.32.10.971gydF4y2Ba 2 - s2.0 - 0018662889gydF4y2Ba JackwoodgydF4y2Ba d . J。gydF4y2Ba SreedevigydF4y2Ba B。gydF4y2Ba LeFevergydF4y2Ba l . 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