文摘

大多数抗逆转录病毒医学治疗是开发和测试主要是对hiv - 1 B nonrecombinant应变,代表全球HIV-1-infected人口的不到10%。hiv - 1循环在西非和重组形成CRF02_AG普遍在其他国家正变得越来越频繁。先前的研究表明,hiv - 1多态性可能相关变量对抗逆转录病毒药物的敏感性。这项研究指出,比较容易hiv - 1整合酶抑制剂(在)亚型CRF02_AG分别在hiv - 1 B .结构性模型的hiv - 1 B和CRF02_AG INs游离酶和复杂的基质是由DNA同源性建模。在inhibitors-raltegravir (、), elvitegravir(弱电)和L731,988-were停靠到模型,和他们的亲和力为hiv - 1 B和CRF02_AG INs相比。CRF02_AG INs是克隆和表达从等离子体整合酶的链转移剂(INSTI)天真的受感染的病人。我们的在网上和在体外研究表明,序列差异的INs CRF02_AG和B菌株没有导致任何显著的差异酶的结构特点和不影响抑制剂的易感性。绑定模式和亲和力INSTI抑制剂B和CRF02_AG INs是相似的。尽管先前的研究表明,一些天然CRF02_AG的变化可能会改变在/ vDNA交互或INSTIs绑定,我们的研究表明,这些变化影响活动和其INSTIs的易感性。

1。介绍

的波尔编码的hiv - 1整合酶(在)是一种逆转录病毒的复制机制的关键酶。它会刺激共价插入病毒cDNA感染细胞的染色体(1]。两个反应共价集成所需的病毒DNA。首先,在结合短序列位于两端的长末端重复(LTR) vDNA和催化endonucleotide乳沟,3′加工反应,导致移除两个核苷酸的3′末端的LTR和羟基组的亲核攻击。然后使用修剪DNA作为链转移衬底(ST)反应,导致共价DNA插入宿主基因组(1]。抑制剂的链转移reaction-INSTIs-constitute小说家庭抗逆转录病毒(ARV)药物,与raltegravir角(、),这是一个第一次INSTI批准艾滋病治疗。其他抑制剂在高级阶段的发展是elvitegravir(弱电)和GSK572。

人类免疫缺陷病毒1型(hiv - 1)表现出一种特殊的遗传变异水平,这可能会影响病毒传染性等属性,遗传性,或响应抗病毒治疗(2]。最流行的hiv - 1 M组基因亚型是形式,B, C和循环CRF02_AG重组形式。

分析全球hiv - 1亚型的分布和重组在随后的两个三年时间,2000 - 2003和2004 - 2007年,表示一个广泛稳定的全球hiv - 1亚型的分布与流通的比例显著增加重组形式(crf),减少独特的重组形式(URFs)和重组的整体提升3]。尤其是在2004 - 2007年,CRF02_AG占全球8%的感染,C亚型(48%)后,(12%),B (11%)。CRF02_AG是主要的西非洲中部和西部[艾滋病毒的病毒株4- - - - - -6]。最近,重组CRF02_AG形式被确定在巴西亚马逊地区(7和在中国8]。

在法国的频率antiretroviral-naive慢性感染艾滋病毒的患者感染non-B亚型在2006/2007达到了42%,自1998年以来有显著增加(10%)和2001年(33%)。亚型分布的演变主要是由于更高比例的病人来自撒哈拉以南的非洲国家。在这些non-B亚型中,最普遍的是CRF02_AG 2001和2006/2007之间的比例稳定在20%左右9]。

酶和病毒学数据支持这一概念,天然不同non-B子类型多态性可以影响hiv - 1的易感性不同的抗逆转录病毒药物,阻力的大小赋予主要突变,获得一些阻力突变倾向(10]。病毒分离株之间的遗传变异逆转录酶估计多达25 - 35%;特别是波尔基因表现出高的变异,对逆转录酶(RT) 10 - 15%和8 - 12%整合酶(在)11]。整合酶抑制剂是活跃的在活的有机体内对B和non-B亚型。此外,在体外研究表明,C亚型整合酶同样容易INSTIs [12]。同样,分析波尔基因多态性在感染患者显示高度普遍对INSTIs易感性影响甚微(13]。然而,在B和CRF02_AG毒株序列的比较表明,CRF02_AG序列不同于B序列由13残留物(K / R14、V / I31 L / I101, T / V112, T / A124, T / A125, G / N134 I / V135, K / T136, V / I201, T / S206 L / I234和S / G283) (14]。基于模型B hiv - 1整合酶/ DNA的复杂(15),建议这些变化的几个K / R14、T / V112, T / A125, G / N134, K / T136, T / S206可能影响与DNA相互作用或INSTIs易感性。后来我们比较了B和CRF02_AG菌株之间遗传障碍;我们发现亚型之间的差异影响了遗传障碍G140C / S和V151I更高的遗传障碍被计算亚型CRF02_AG暗示很难选择这些突变CR02_AG亚型B[相比16]。

整合酶是一个288个氨基酸的酶,它由三个结构不同的功能域(17]。结构报告hiv - 1在单一或两个域数据允许生物相关的生成模型,代表了游离酶二聚的或与病毒复合物(vDNA)和/或宿主DNA (hDNA) [18]。完整的原型的x射线结构泡沫病毒(PFV)在复杂的DNA同源和整合酶链转移抑制剂(INSTIs;、、弱电和其他第一代和第二代INSTIs)最近被解决了19,20.]。报告结构被用于同源建模的释放和在绑定到vDNA CRF02_AG和B菌株。此外,所构造的模型被用来估计的易感性INs链转移抑制剂、、、弱电和L731,988(计划1)。从分子模拟结果相比,获得的实验数据与B和CRF02_AG INs隔绝HIV-1-infected患者的血浆样本,然后克隆和表达在体外。

2。结果与讨论

2.1。在序列分析CRF02_AG INSTI-Naive感染病人

完整的编码区序列波尔血浆样品的基因被放大和克隆CRF02_AG HIV-1-infected病人。四个序列,N¹到N⁴十三残留物中,存在一些差异,显示受多态替换CRF02_AG和B之间hiv - 1序列(K / R14、V / I31 L / I101, T / V112, T / A124, T / A125, G / N134 I / V135, K / T136, V / I201, T / S206 L / S / G283 I234;表1)[14]。序列N₁(CRF02_AG 33 cr)显示七K14R变化,T112V, T125A, G134N, K136T, t206, S283G;N₂CRF02_AG 49 cr五T112V变化、T125A G134N, K136T, S283G;N₃(CRF02_AG 68 cr)五个变体K14R T112V, T125A, K136T, t206;N₄(CRF02_AG 52 cr Q148K)两种变体T125A和t206 Q148K INSTI电阻突变。尽管Q148K参与INSTIs阻力,病人从编码的DNA是派生不暴露在INSTI-containing治疗。因此我们推测Q148K可能是天然氨基酸替换。

2.2。B和CRF02_AG hiv - 1整合酶的结构比较

为了确定蛋白质的自然变化的潜在影响活动和易感性INSTIs,我们建立了模型结构相应的共识序列和CRF02_AG变异不同于B亚型的十二残留。包含S283G 18-aas的c端端是省略了因为这个域的结构不是由x射线分析和解决这部分蛋白质的折叠apo状态是极难预测,由于其长度和高度solvent-exposed地位至关重要。

比较结构分析模型中进行考虑6所产生的同源性建模(图1)。模型1 (B)和2 (CRF02_AG)(图1(一)整合酶(在)游离为代表^{1 - 270}),它描述了酶的构象状态之前的3′加工vDNA (apo状态);模型3′(B)和4 (CRF02_AG)(图1 (b))代表了二聚体在复杂vDNA(整体状态),描绘了活跃的单位vDNA链转移intasome;模型5 (B)和6 (CRF02_AG)(图中未显示)被移除vDNA源自模型3和4。

模型1和2是由hiv - 1在孤立的晶体结构域或双域。总的来说,模型的分析表示之前构象状态3中的hiv - 1′加工(apo状态)没有任何明显的两个亚型(数据之间的结构性变化1(一)和1 (c))。

模型3和4是由晶体的结构vDNA复杂的PFV intasome [19,20.]。尽管hiv - 1之间的序列的身份和PFV INs很低(22%),两种蛋白质的结合小演示高保护的关键二级结构元素和三个PFV域与hiv - 1在本质上是相同的结构孤立的hiv - 1域。此外,结构的PFV intasome显示活性3′末端的距离vDNA对应于预期的hiv - 1整合网站之间的距离在目标DNA碱基对(4)。因此,我们相信,在x射线结构PFV代表一个好的模板模型生成的hiv - 1 (21]。获得一个健壮的对齐,我们调整了目标(hiv - 1英寸从B和CRF02_AG亚型)和手动模板(PFV)序列,分别考虑每个结构域,为了考虑保护二级结构(见部分4)。

模型3和4,代表vDNA intasomes菌株,叠加完美,没有观察(数据结构不同1 (b)和1 (d))。大多数变化都远离活动网站,和最近的两个突变残留活性部位,在134年和136年,暴露在溶剂和显然没有显著影响结构。同样的3′加工链转移活动B和CRF02_AG重组蛋白是化验和比较。协议的建模结果,INs都比较(图活动2 (c))。

值得注意的是,大型结构和构象变化之间观察到的人群(模型1和2)和整体(3和4)州的相对位置在域(RMSD,均方根偏差,31,基于C_α)(图1 (e))。这些结构性的修改导致不同的接触域,n端结构域(元),催化核心域(CCD), c端域(CDD)。因此,在模型1和2 (apo状态)之间没有交互检测CTD和CCD,而两个域紧密交互模型3和4(整体状态)。NTD-CCD界面也展示巨大的变化:在apo形式NTD-CCD接口属于相同的单体单元而在整体形式的接口是两个不同的子单元。此外,在经历了重要的结构转型导致催化部位的结构重组循环vDNA绑定;盘绕的部分循环减少从10残留物(140 - 149年aas)人群的表格5中残留(140 - 144年aas)整体(图形式1 (f))。这可能部分折叠催化循环的稳定通过intra-IN domain-domain互动和交互与vDNA螺旋的贡献4伸长。

2.3。在体外酶重组hiv - 1 B和CRF02_AG比较

确认实验缺乏差异的两株CRF02_AG INs和B, N₁到N₄序列是表达和纯化(图2(一个))和酶的活动比较HxB2 B之一。首先,重组INs的DNA结合活动比较使用稳态荧光各向异性分析(图2 (b))[22]。在这个试验,结合在fluorophore-labeled dsODN衬底模仿病毒DNA的一端是进行稳态各向异性值的增加,造成基板运动的限制。我raln图如图所示2 (b)无显著差异,在DNA结合活性的重组亚型B和观察CRF02_AG INs在一系列浓度的100至250海里,从而表明序列的变化并不影响酶的亲和力。然后,3′-处理hiv - 1 B和CRF02_AG INs相比在体外。无显著差异的3′加工活动重组hiv - 1 B和CRF02_AG INs被发现在一系列浓度的50到400海里(图2 (c))。受损的3′加工和链转移活动,但守恒的DNA结合的能力CRF02_AG 52 cr Q148K观察,与之前的研究相一致(23]。最后我们决定分析3′加工动力学,CRF02_AG 33 cr的重组hiv - 1 B的浓度的增加在50到200 nM重组蛋白质增加孵化时间,同时使用在体外3′加工活动分析和稳态荧光anisotropy-based化验(图3)。再次,可以检测到没有区别。这一结果进一步证实了稳态荧光各向异性分析(数据没有显示)。

在协议的建模结果,在体外研究证实,INs都类似的酶的活动。

2.4。对接INSTIs

虽然B和CRF02_AG INs结构相似,残留的变化可能会影响和随后的交互活动的抑制剂。为了解决这个假说,三个抑制剂、弱电、L731,988(计划1)被使用两种不同的停靠在INs对接算法,滑移和AutoDock。、和弱电坐标的晶体结构被PFV intasome cocomplexes [19,20.],L731,988建于从头开始(见部分4)。这三个化合物被认为是在他们deprotonated形式,因为它已经明确,diketo酸(分析)主要存在于这种形式在解决方案(24]。获得的结合能滑翔和Autodock得分函数被发表在表2。

抑制剂第一停靠到释放,模型1和2 (apo状态),用一个毫克^{2 +}离子催化部位。这三个抑制剂都位于远离催化部位的催化部位灵活的循环。亚型B值的结合能获得滑行的一个相对狭窄的区间范围从8.49−−7.42千卡/摩尔,可以同AutoDock范围从8.72−−6.65千卡每摩尔。成绩获得了对于一个给定的抑制剂显示一些变化从一个应变到另一个和两个对接项目。报废汽车的最佳姿势模型1 (B亚型)预测的滑翔非常接近,在模型2 (CRF02_AG亚型)。微小的差异与弱电的一种改进的关联模型2显示一个更好的分数(−8.20千卡每摩尔)和羟基之间形成的一个额外的H-bond群弱电和E152侧链(数字4(一)和4 (b))。、提出了在模型1和2不同强烈。在这两种情况下、坐标同样毫克^{2 +}阳离子ketoenolate功能,但抑制剂采用相反的立场,更确切地说在模型1 fluorobenzyl环是面向Y143,而在对Q148 2。L731,988姿势也在不同的模型1和2,表现为不同的吡咯环的位置,接近E152 1和Y143 2。这样的选择带来了可能是因为一个大口袋里形成的活性部位和折叠的开放构型循环,允许大量的构象和取向与等效灵活、亲和力和L731,988分子。因此绑定之间没有显著差异可以评估的三个研究抑制剂从菌株B和CRF02_AG游离。

进一步抑制剂被停靠到模型3和4代表preintegration复合物2毫克^{2 +} DNA,分别从B和CRF02_AG亚型。对接导致的绑定三抑制剂显著更高的分数比发现的人群。这一发现同意与以前发表的实验数据表明高亲和力的l - 731988只对与病毒DNA构象采用组装后(25]。滑翔成绩排名在范围从10.22−−8.73千卡/摩尔,虽然AutoDock分数范围从13.45−−11.11千卡每摩尔。比较提出了由两个对接软件被发现相似,因此我们重点分析滑移的结果。

这三个化合物在催化部位定位和螯合毫克^{2 +}阳离子同意这些分子的作用机制,这是链转移抑制剂(26]。、绑定模式的特点是更高的分数在两个模型3 (B亚型)和4 (CRF02_AG亚型),分别到另两个抑制剂。、预测提出了用模型3和4(数字是相同的4(一),4 (b),4 (c)和4 (d))。它结合bidentaetly金属辅因子的活性位点作为1 - 5,和1-4-type配体,烯醇的氧原子作为oxo-bridge两毫克^{2 +}阳离子。额外的抑制剂、是通过稳定铆合的fluorobenzyl环Cyt16 DNA的衬底。与文化、相似,弱电坐标毫克^{2 +}代数余子式bidentantly通过1 - 5类型1 - 3 -ketoenolate一半和偕的羧基氧原子,羧基氧原子作为oxo-bridge bicationic集群。几个不同的弱电绑定在模型3和4指略有不同的构象chlorofluorobenzyl一半。L731,988分子显示模型3和4中不同的绑定姿势。在模型3 (B亚型)L731,988坐标双齿1毫克^{2 +}阳离子的氧原子酮ketoenolate和羧酸盐的功能组,作为配体1 - 6型。第二个毫克^{2 +}羧酸盐阳离子只是协调的氧原子。在模型4 (CRF02_AG) L731,988抑制剂只显示一个协调到一个毫克^{2 +}阳离子(图4 (e)和4 (f))。

、关联的绑定姿势预测与观察到的x射线结构PFV intasome复杂(19,20.]。毫无疑问,第二催化Mg的存在^{2 +}阳离子,局部循环折叠,DNA衬底轴承是可能的驱动因素紧密绑定圣抑制剂的催化部位。Cherepanov完全证明了这一点,一系列INSTIs固定类似PFV intasome [19]。明显的晶体数据或静态模型来源于这些数据不是合适的方法来解释抑制剂的特异性识别目标。因此,考虑到相似的得分值对于一个给定的抑制剂和封闭的姿势,没有明显的不同可以评估之间的绑定的抑制剂的研究2毫克^{2 +} 从菌株B和CRF02_AG DNA复杂。

验证在网上预测的敏感性亚型B和CRF02_AG INs, INSTIs效率(、、弱电和L731,988)是由INs重组蛋白质在体外链转移试验在INSTI浓度的增加(见部分4)。所有的三个研究INSTIs,集成电路中无显著差异₅₀值对重组hiv - 1英寸从B和观察CRF02_AG菌株(表3)。集成电路₅₀、、弱电和L731,988 hiv - 1英寸从B和CRF02_AG菌株是41.8,93.4,855 nM和13.7 - -25.9,48.9 - -66.8,分别为193 - 291纳米。实验排名的三个化合物被滑翔得分函数预测正确。

对接的计算证明,(我)DNA复杂代表最好的目标研究了抑制剂,(ii) co-complexed vDNA部分形状抑制剂结合位点。进一步探索vDNA的角色,衬底被撤的vDNA复杂和抑制剂再次停靠在游离在褶皱的整体状态,模式5和6。的结合能、贬值在vDNA去除B和CR02_AG亚型在弱电和L731,988绑定分数的影响较小。

对接两菌株之间的分数几乎是类似的姿势显示一些变化,已经观察到在人群的形式。令人惊讶的是,AutoDock结果显示较低的分数、绑定两个模型5和6,而另外两种抑制剂具有约束力的更好的成绩,更接近同模型3和4。相比之下产生的分数抑制剂和亚型之间的滑移是相同的。螯合的毫克^{2 +}离子抑制剂仍保持,但是交互模式不同于这些预测模型3和4。事实上,在模型5 (B亚型)、螯合物第一个毫克^{2 +}阳离子通过oxadiazole环上的氮原子和氧原子的甲酰胺一半;第二个毫克^{2 +}由1 - 4协调的氧原子pyrimidinone片段。模型6、协调方式类似于观察模型4;然而,稳定堆积相互作用都消失了。绑定的大量的口袋和缺乏稳定protein-ligand和DNA-ligand交互可以解释这样的品种。在整体构象,因此,释放游离在人群的构象,没有出现报废汽车作为抑制剂、和一个合适的目标。L731,988出现弱粘结剂,实验证实了IC₅₀值。

分子建模方法被用来研究自然变化的影响显示通过CRF02_AG应变在体外酶的活动及其易感性INSTIs比B整合酶的共识。7月13日我们发现的结构模型的状态)和病毒DNA-bound(整体状态)整合酶表现出非常相似的折叠和三级结构为两个菌株进行了研究。的结构模型vDNA复杂的叠加。证实了这种相似性与链转移活性的变异在14个,112,125,134,136,206,283个职位。因此,自然发生的变化在hiv - 1亚型CRF02_AG——K14R V31I, L101I, T112V, T124A, T125A, G134N, I135V, K136T, V201I, t206, V234I, S283G,建议修改结构,不影响显著在体外DNA结合活性,3′加工或链转移反应。此外,对接结果显示绑定模式的三个研究抑制剂具有可比性和对接构象B和CRF02_AG菌株和这些INSTIs拥有相似的抑制活动B和CRF02_AG hiv - 1菌株。这些结果表明完全缺乏易感性的差异并确认之前报道的观察对hiv - 1 B和C亚型INs (12]。因此,与较低的基线过敏性重组/ G亚型病毒蛋白酶抑制剂(pi)和敏感性降低一些abacavir / G隔离,INSTIs可能提供一个很好的治疗方案治疗hiv - 1亚型CRF02_AG-infected患者(10]。

在所有三个目标分子定位同样keto-enol一半的取向鼓励协调两个金属辅因子的活性部位。此外,独立的方法,三个INSTIs显示一个更有利的绑定到vDNA复杂(整体状态)比游离酶(apo状态),在良好的协议与作用机理26]。相同的差异理论上的预测模式、绑定Loizidou[早期报道了27]。观察到的构象和结构转型的DNA结合导致一个重要的催化部位的折叠和构象变化循环进而支持绑定口袋容纳INSTIs的形成。弱电的绑定模式和L731,988几乎没有改变的清除病毒DNA。相反移除vDNA对接结果有很大的影响、,从而突出的角色vDNA、识别最有可能由于卤化苄一部分取代未配对的5′腺嘌呤和叠加Cyt16通过- - - - - -交互。尽管这样的相互作用被认为是参与所有的链转移抑制剂研究[19),我们的研究结果表明,弱电和L731,988绑定不同部分的、决定因素。

应该注意的是,轻微的差异观察结果之间的滑移和AutoDock分数,这可以归因于静电相互作用的影响,研究了分子系统。事实上滑翔使用高负电荷本地化的两个氧原子hydroxypyrimidinone、比AutoDock(−−1.22和0.5e而−−0.183和0.265e)。在AutoDock得分函数,用于弱电的羧酸盐的指控(2×−0.64e)和L731,988 (2×−0.62e)超过两个氧原子与嘧啶、的循环。来验证这个假设,我们重复对接弱电和L731,988使用费用的计算两个氧原子与嘧啶环、而不是那些Gasteiger交办的指控。两种抑制剂的新结合能增加从12.45和11.50−−−−7.95和7.80千卡/摩尔弱电和L731,988分别。因为这些原子电荷在结合能贡献高的原子坐标毫克^{2 +}离子,它们可能负责之间的差异发现理论结合能和实验IC₅₀值。实验基于IC排名的三个抑制剂₅₀报废汽车、> > L731,988,预测的滑翔在排名AutoDock预测的弱电> L731,988≥、。高负电荷的羧基氧原子弱电和L731,988可能障碍对整合酶抑制行为,如文化、高效,因为这些费用增加去溶剂化自由能,所以增加绑定处罚这些抑制剂。

研究调查在HIV - 1基因多态性的存在和频率跟踪treatment-native患者极为重要的病毒进化和全世界艾滋病毒感染的流行病学。相关关键问题多态性病毒酶活动的影响,对抑制剂的敏感性,和抑制剂电阻通路。没有准确的实验数据和/或描述vDNA复杂的结构本质上是困扰这些基本主题的探索。年初以来临床艾滋病治疗、在2007年,只有少数试图探针、绑定已报告从不同的逆转录病毒整合酶菌株。尤其是分子对接、与抑制剂在催化核心域结构5 citep作为病毒DNA模拟描述不同的绑定模式和亲和力、从B和C亚型(27]。绑定模式差异的几个化合物从B和C亚型也沟通(28]。

在这种情况下,我们结合理论(结构建模)和实验(生化)亚型CRF02_AG变化影响评估/与DNA相互作用或影响易感性INSTIs有助于理解多态性的分子和结构层面的影响。我们的实验显示,从亚型CRF02_AG有相似的酶活性从亚型B,和两个INs链转移抑制剂的敏感性是可比的。结果从分子建模和抑制剂对接协议在体外观察。

生化研究揭示了hiv - 1的影响自然多态性的易感性蛋白酶(PR)——其它逆转录酶抑制剂(29日]。最近的结构和生物物理的研究也表明,B和CRF01_AE菌株的序列多态性可以改变蛋白酶活动和公关抑制剂具有约束力30.]。在这种蛋白质,两个菌株之间的差异直接影响皮瓣的构象铰链区和蛋白酶核心区域酶功能起着至关重要的作用。

相比之下,hiv - 1整合酶的残留显示自然变化从B和CRF02_AG菌株都位于外的催化区域和外链转移抑制剂的结合位点。这种类型的多态性可能允许病毒保护整合酶结构和功能属性,在这项研究中观察到。

我们应用的方法可用于其它逆转录病毒substrains新兴的研究目前或将来出现为了评估和优化效率的小说特定的抗逆转录病毒药物。因此,我们的研究尤其有助于这一主题和密切与临床和therapeutically-significant hiv - 1整合酶多态性影响易感性问题向整合酶抑制剂?

3所示。结论

在hiv - 1亚型CRF02_AG自然发生的变化,如K14R V31I, L101I, T112V, T124A, T125A, G134N, I135V, K136T, V201I, t206, V234I, S283G,不影响尤其是整合酶结构,既不在体外酶活性、3′加工或链转移反应。对接结果认为抑制剂进入游离的模型显示,相当低的分数分别向pre整合对接DNA复杂。对接分数和抑制剂对确认生成的艾滋病毒的结构DNA复杂的适当的生物相关模型用于解释链转移抑制剂的抑制机理。所有这三个研究分子polydentate配体能够绕金属阳离子活性部位。对接的结果是完美的协议提出了INSTIs的作用机制。对接结果表明,模式绑定和对接构象的三个研究分子相同的hiv - 1从B和CRF02_AG菌株。建议的机制的整合酶抑制的基础上考虑不同的构象,释放,vDNA复杂适用于这两个菌株进行了研究。

4所示。方法

4.1。分子建模

所有的计算进行了在Linux站(核)运行Centos 5.4。在模型构造使用分析员包9 v8 [31日]。序列比对是使用ClustalW执行服务器(32,33)(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)。圣抑制剂的对接、文化、弱电和L731,988(计划1),在模型中使用两种算法,执行1 - 6滑翔(34)纳入薛定谔套件(薛定谔Inc .)和Autodock 4.2 [35]。数据生产PyMol [36]。

4.2。模型的hiv - 1 B和CRF02_AG菌株

为完整的三维模型,^{1 - 270}(未绑定,或者7月状态,分别地。DNA)包含一个毫克^{2 +}阳离子在每个生成的活性部位是同源性建模从晶体结构的孤立的双域。hiv - 1的两种结构,一个包含n端结构域(元)和催化核心域(CCD)^{1 - 210}PDB代码:1 k6y) (37),另一个包含CCD和c端域(CTD) (^{56 - 270}PDB代码:1 ex4) (38),被选为初始模板。这些结构代表多个hiv - 1亚型B的突变,突变是W131D / F139D / F185K 1 k6y C56S / W131D / F139 / F185K / C180S 1 ex4。结构叠加和CCD域(在^{56 - 210})1 ex4,确定在低分辨率(2.8)比1 k6y(2.4),被删除。无序残留271 - 288也省略了。WT hiv - 1英寸的序列B和CRF02_AG菌株,相差13氨基酸(K / R14、V / I31 L / I101, T / V112, T / A124, T / A125, G / N134 I / V135, K / T136, V / I201, T / S206, V / I234和S / G283),使用ClustalW与模板序列对齐。失踪的CCD-NTD链接器(47-55 aas)是由一个从头开始方法与分析员9 v8,基于离散优化蛋白质能量(涂料)得分函数(39]。100模型为每个在生成,从B和CRF02_AG菌株。折叠构象的循环^{140 - 149}一个形状规整的发夹结构(40基于数据库)是由一个loop-generating重建算法搜索(蛋白循环搜索)。毫克^{2 +}阳离子插入到活跃站点(D64、D116 E152)报道结构1闭[41)和最小的分子力学(毫米)限制使用CHARMM [42]。我们将把这些生成的模型作为模型1 (B株)和模型2 (CRF02_AG应变)。

4.3。模型的hiv - 1 B和CRF0_AG菌株与vDNA复杂

的3 d模型vDNA pre集成复杂(整体状态分别从B DNA)和CRF02_AG菌株产生的同源性建模后两步过程。最近出版的坐标PFV的晶体结构vDNA复杂的共晶、(PDB代码:3欧亚,分辨率为2.65)[19,20.)被用来作为模板。hiv - 1的序列比对的二聚体(B株)和PFV使用ClustalW执行。序列的身份在这两个INs是22%。然而,基于结构对齐的INs PFV和hiv - 1展示了高保护关键的结构元素和因此,PFV在x射线结构模型生成的hiv - 1提供了一个很好的模板。为了增加我们的模型的质量,NED域(残留1 - 50),只存在于PFV,被从相应的序列。然后,hiv - 1的结构域的序列和PFV INs分别是对齐的,考虑到二级结构的保护。获得的序列比对用于hiv - 1 intasome的同源性建模。interdomains链接器被使用从头开始循环模块分析员(43]。B亚型和CRF02_AG模型,距离限制适用于复制关键交互在早期的实验研究报道(37,44- - - - - -46]。100模型为每个在生成,从B和CRF02_AG菌株,与最低的能源被保留。我们将这些模型称为模型3 (B株)和4 (CRF02_AG应变)。5和6是由其他两个模型把vDNA从模型3和4。

4.4。改进的模型1 - 6和质量检查

氢原子被HBUILD设施添加CHARMM [42]。由此产生的模型略最小化而限制碳-α消除冲突。模型的立体化学质量评估与便携式ProCheck [47),这表明,超过97%的残留在所有模型在最有利的二面角角度,允许地区的拉玛钱德朗情节,显示高质量模型。

4.5。分子对接

最初的分子几何图形的弱电和文化、x射线结构30丫(、)和3 l2u PFV(弱电)vDNA复合物(19,20.]。生成的3 d结构复合L731,988 ChemBioOffice 2010 (48]。模型的抑制剂(计划1deprotonated形式)最小化了密度泛函理论(DFT) B3LYP ?我*方法实现Gaussian03程序(49]。抑制剂、,弱电,L731,988停靠在使用两种算法模型1 - 6,滑翔(34)和AutoDock 4.2 (35]。受体被认为是一个刚体,而配体被充分灵活。

在AutoDock 4.2中,图形用户界面(GUI)是用于抑制剂的制备和受体文件。网格地图的交互能量网格的各种原子类型建立了盒维数一个³集中在活性部位。人口规模的计算进行了150年,能源评估27000年一代又一代的最大数量,变异和交叉率分别为0.02和0.8。运行的数量设置为100,探索大量带来最高的亲和力和索利斯湿胎算法被用来放松最好的10%的构象。

薛定谔套件受体网格生成的滑翔4.5在一个封闭的盒子大小20集中在活性部位。抑制剂是停靠灵活这些并不是预先计算网格使用标准的精度(SP)得分函数。对于每个化合物,best-scored姿势是保存和分析。

4.6。在基因的克隆

在cDNA源自天真的hiv - 1亚型CRF02_AG感染病人。质粒pET15b——HIV-1subtype B (HBX2)是我们实验室的保护50]。放大的编码序列进行了与特定的引物在94°C 10分钟,然后28重复周期(94°C 30年代,55°C 45 s, 1分钟和72°C)其次是孵化10分钟的72°C。PCR产品对应于整个序列被纯化和结扎成pGEM-T简单向量(Promega)和测序(欧陆坊MWG操纵子)。然后在基因表达载体中插入pET-15b (Novagen)与濒死经历我和BamH消化后并通过测序验证。正向引物:5′-CATATGTTTTTAGATGGCATAGATAAAGCC-3′;反向引物对CRF02_AG 33 cr, 49 cr: 5′-GATCCTAATCCTCATCCTGTCTACCTGC-3′;向后CRF02_AG 52 cr Q148K底漆:5′-GATCCTAATCCTCATCCTGTCCACTTGC-3′;反向引物CRF02_AG 68 cr: 5′-GGATCCTAATCTTCATCCTGTCTACTTGC-3′。

4.7。表达和纯化

His-tagged INs生产大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3) -RIPL(安捷伦)和净化nondenaturing条件下(如前所述)(50,51]。

4.8。稳态荧光Anisotropy-Based化验

稳态荧光各向异性值记录在2000年灯塔仪器(WI Panvera,麦迪逊,美国),在一个细胞维持在25°C或37°C下恒温控制。anisotropy-based背后的原理分析发表在其他地方(52,53]。在25°C DNA结合蛋白测定进行了20分钟的缓冲区包含10毫米消息灵通的pH值6.8,1毫米二硫苏糖醇、12.5和7.5毫米氯化镁的存在nM-double链DNA衬底(21-mer oligodeoxynucleotide模仿U5病毒DNA端,fluorescein-labeled的3′末端GT)和100年,150年,200年和250 nM重组。在动力学研究中,稳态荧光anisotropy-based 3′加工活动试验进行的50岁,100年,200年和250年的重组蛋白质和12.5 nM双链DNA fluorescein-labeled衬底,在37°C 10、20、30、60、90、120和180分钟。

4.9。3′加工和链转移活性测定

在体外3′加工和链转移活动进行化验使用21/21-mer或21/19-mer双链oligodeoxynucleotides标有(- - - - - -³²P] ATP-respectively,如前所述51]。化验的持续时间是3小时,温度37°C,在缓冲区包含10毫米消息灵通的pH值6.8,1毫米二硫苏糖醇、12.5和7.5毫米氯化镁的存在双链DNA衬底和100 nM重组。动力学研究是由测试在体外3′加工活动的50岁,100年,150年和200海里重组蛋白,在37°C 10, 20、30、60、90年,分别为120和180分钟。

4.10。易感性INSTIs

易感性的INs INSTI决心通过测试体外链转移活动增加INSTI在DMSO浓度的存在。抑制药物被表示为一个部分产品(比例的控制没有药物)的活动。50%抑制浓度(IC₅₀),定义为药物的浓度,结果在50%抑制,从抑制曲线拟合计算与棱镜实验数据软件,版本5.0 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。

缩写

hiv - 1:	人类免疫缺陷病毒
vDNA:	病毒DNA
hDNA:	宿主DNA
:	整合酶
CRF02_AG:	循环重组形式
LTR:	长末端重复
PFV:	原型泡沫病毒
被忽视的热带病:	n端结构域
CCD:	催化核心领域
仪:	c端域
圣:	链转移
INSTI:	整合酶链转移剂
分析:	Diketo酸
、:	Raltegravir
弱电:	Elvitegravir
PI:	蛋白酶抑制剂
表示:	均方根偏差。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

x倪、美国Abdel-Azeim和e·莱恩了同样在这工作。肯尼迪。Mouscadet和L。Tchertanov构思和设计实验。x倪,s . Abdel-Azeim e·莱恩r . Arora, o . Osemwota进行实验。x倪、美国Abdel-Aziem和e·莱恩分析数据。a g。Marcelin和诉Calvez造成试剂/材料/分析工具。e·莱恩,肯尼迪。Mouscadet, l . Tchertanov写道。

资金

这项工作由面向高等师范学院,中心国家de la任职(CNRS),和SIDACTION。

确认

作者承认薛定谔证明许可证。