细菌毒素融合蛋白对口蹄疫病毒抗原引起粘膜免疫豚鼠鼻内接种时gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

肽的口蹄疫病毒VP1 G-H循环能够诱导中和抗体在某些物种被认为是相对贫穷的免疫原,特别是在粘膜表面。然而,鼻内抗原与相应的运载工具管理/佐剂诱导粘膜免疫反应,和细菌性肠毒素一直在这方面是有效的。在最近的研究中,两种不同的载体/辅助的方法被用来增强粘膜免疫FMDV OgydF4y2Ba_1gydF4y2BaBFS G-H循环抗原决定基,G-H循环是基因耦合gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaLT-B单元和coexpressed LTA2片段(LTA2B-GH),或无毒的假单胞菌外毒素(ntPE)融合到LTA2B-GH LT-A2增强受体靶向。只豚鼠,接种经与ntPE-LTA2B-GH LTA2B-GH诱导显著anti-G-H循环IgA抗体在鼻腔冲洗4和6周相比,卵白蛋白或G-H循环免疫动物。也只有这些群体表现出G-H loop-specific antigen-secreting鼻粘膜细胞。这些数据表明,当时的融合抗原LTA2B和ntPE-LTA2B有潜力作为运营商/佐剂诱导粘膜免疫反应对传染病。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

生成一个有效的黏膜免疫反应对外国蛋白质通常需要添加载体/辅助分子,其中许多是细菌外毒素,如霍乱毒素(CT), heat-labile肠毒素(LT)、百日咳毒素(PT),外毒素(PE)分泌gydF4y2Ba霍乱弧菌、大肠杆菌、百日咳博德特氏菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba铜绿假单胞菌,gydF4y2Ba分别。这些毒素具有ADP-ribosylating活动,及其无毒形式可作为黏膜佐剂载体,因为他们的能力与上皮细胞表面上的受体结合,从而促进他们交付到底层lymphoepithelial组织(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。此外,抗毒素反应是如此强大,他们产生强烈的免疫反应对外国分子同时出现在粘膜表面通过一个旁观者效应。它也表明,外源蛋白的共同有效的粘膜佐剂可以防止口服耐受的诱导gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。遗憾的是,toxin-based粘膜佐剂的广泛使用极大地限制了这些药物固有的毒性(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),需要更少的发展有效的“类毒素”。gydF4y2Ba

CT和LT,最广泛研究粘膜佐剂在动物模型到目前为止,属于ABgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba类的细菌毒素组成的一个受体结合pentameric B亚单位和一个亚基保持酶的活性。B亚基(LT-B)是103 -氨基酸蛋白质魔法变成一个55 kDa pentameric结构,负责绑定到各种真核细胞受体(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。LT-B被发现与多种功能,包括受体结合和CD8 +的诱导细胞凋亡的能力gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)(和偶尔CD4 +) T细胞。亚基(LT-A)共价连接到LT-B trypsin-sensitive循环和一个gydF4y2BaαgydF4y2Ba螺旋区域,连接两个片段(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。LT-A有两个亚基(A1和A2)由二硫键链接,其中球状A1亚基是保持酶的活性和c端A2单元锚定到pentameric B亚基(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。A1单元包含一个结合NAD ADP-ribosylation网站gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和ADP核糖转移GTP-binding蛋白质的α亚基参与信号转导。这导致激活腺苷酸环化酶和异常细胞内积累的营地,最终导致流体从细胞和电解液流出,和腹泻中观察到主机(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。CT和LT的A1单元还发现绑定ADP核糖基化因素(arf)参与ADP-ribosylating活动的增强(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。外国抗原的基因融合A2 AB的一部分gydF4y2Ba_5gydF4y2Ba肠毒素(CT和LT),在A1,催化亚基已被证明是有效的粘膜佐剂和载体蛋白。这种融合蛋白用于引起粘膜免疫反应对链球菌adhesin AgI通讯社的SBR / II [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba),淋球菌的transferring-binding蛋白质TbpA TbpB [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba],serine-richgydF4y2Ba痢疾阿米巴gydF4y2Ba蛋白(SREHP,融合maltose-binding蛋白(MBP)) (gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

体育是一个单件展品NAD的细菌外毒素gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba-diphthamide ADP-ribosyl转移酶的活动,和绑定的PE受体(gydF4y2BaαgydF4y2Ba2-macroglobulin受体/低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP1恰巧)/ CD91)启动受体介导内吞作用后其毒性作用的发挥gydF4y2Ba13gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。融合的一种灭活毒素(ntPE) V3环艾滋病毒已被证明诱导粘膜免疫反应gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba),这表明这种方法可以用于疫苗的设计针对粘膜病原体。先前的研究已经表明,鼻内管理口蹄疫病毒(FMDV) OgydF4y2Ba_1gydF4y2BaBFS G-H环肽不诱导保护性免疫反应在牛gydF4y2Ba19gydF4y2Ba];然而,ntPE-GH融合蛋白诱导anti-G-H血清免疫球蛋白抗体anti-ntPE血清免疫球蛋白和粘膜IgA抗体时给与猪(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba),这表明融合蛋白耦合G-H环肽能使有用的粘膜疫苗。gydF4y2Ba

这项工作的中央假说是一个抗原,如FMDV G-H循环,将诱发呼吸道粘膜免疫反应对抗原决定基当基因耦合的糖基LT-B(有毒LT-A1域被替换为粘膜佐剂ntPE)和交付给动物通过鼻腔的路线。这个假说是基于这样的观察:(1)达成共识G-H环肽(非肠道管理)诱导保护在猪病毒的挑战[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba),(2)粘膜免疫猪的鼻路线已被证明诱导系统性免疫球蛋白和鼻IgA抗体(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba),(3)G-H循环抗原,当耦合的粘膜佐剂ntPE,诱导一个适度的免疫反应对G-H循环抗原决定基当鼻内接种猪(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在目前的研究中,我们构建的嵌合蛋白质LTA2B-GH和ntPE-LTA2B-GH的编码序列插入FMDV OgydF4y2Ba_1gydF4y2BaBFS G-H循环LT-B的糖基上。插入G-H循环到LT-B允许显示五份抗原宿主免疫系统LT-B pentamerizes同时融合ntPE有毒A1的一部分将允许更多的受体的目标属性融合蛋白。融合蛋白都是评估的抗原显示G-H循环和pentamerization LT-B亚基。然后我们评估的粘膜免疫原性这两个无毒的嵌合蛋白质对FMDV G-H循环在几内亚猪,发现他们能够诱导抗原特异性分泌IgA免疫反应的免疫动物的呼吸道。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。质粒构建gydF4y2Ba

LT-A2 / LT-B(称为LTA2B)片段的质粒gydF4y2Ba被关闭的gydF4y2Ba(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)是PCR扩增并克隆到一个n端gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba标签包含表达载体,gydF4y2BapET-28 b (+)gydF4y2Ba(EMD Novagen Gibbstown NJ)限制性内切酶之间的网站gydF4y2BaBamH1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSal1gydF4y2Ba使用以下引物:LTA2B-BamH1-F。P: GCC (CGT TGCgydF4y2BaGGA移行细胞癌gydF4y2BaG GGT手枪TGT AAT插科打诨插科打诨和LTA2B——Sal1-R行动。P: GCG AGC注册会计师gydF4y2BaGTC广汽gydF4y2BaGTT TTT猫手枪TGC公司治理文化。这导致了质粒的生成gydF4y2BapET-LTA2BgydF4y2Ba。G-H循环序列从先前生成的ntPE-GH构造gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)是由PCR和subcloned放大gydF4y2BapET-LTA2BgydF4y2Ba的3′末端LTA2B基因限制性内切酶之间的网站gydF4y2BaSal1gydF4y2Ba和gydF4y2BaXho1gydF4y2Ba使用以下引物:GH-Sal1-F。P: GCC (CGT TGCgydF4y2BaGTC广汽gydF4y2Ba资本利得答AGT AGA AAC GCG GTG GH-Xho1-R。P: GCG AGC注册会计师gydF4y2BaCTC呕吐gydF4y2BaCAG TGT GCG AGC AAC TTT公司。这导致了质粒的生成gydF4y2BapET-LTA2B-GHgydF4y2Ba。从pIVEX-ntPE ntPEgydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)是PCR扩增并克隆到一个n端gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba标签包含表达载体,gydF4y2BapET-28 b (+),gydF4y2Ba限制性内切酶站点之间gydF4y2BaNde1gydF4y2Ba和gydF4y2BaHindIIIgydF4y2Ba使用以下引物:ntPE-Nde1-FP: GCC CGT TGCgydF4y2Ba猫ATGgydF4y2BaGCC GAG棉酚GCC TTC广汽CTC和ntPE-HindIII-RP: GCG AGC将军gydF4y2Ba亚美大陆煤层气有限公司总部gydF4y2Ba结论CAG GTC CTC GCG CGG CGG。这导致了质粒的生成gydF4y2BapET-ntPEgydF4y2Ba。LTA2B-GH从构造pET-LTA2BGH PCR扩增和sub-clonedgydF4y2BapET-ntPEgydF4y2Ba之间的ntPE基因3′末端限制性内切酶的网站gydF4y2BaHindIIIgydF4y2Ba和gydF4y2BaNot1gydF4y2Ba使用以下引物:LTA2BGH-HindIII-F。P: GCC CGT TGTgydF4y2Ba亚美大陆煤层气有限公司总部gydF4y2BaGGT手枪TGT AAT插科打诨插科打诨和LTA2BGH-Not1-R行动。P: GCG AGC注册会计师CgydF4y2BaGC GGC公司治理文化gydF4y2BaCAG TGT GCG AGC AAC TTT公司。这导致了质粒的生成gydF4y2BapET-ntPE-LTA2B-GHgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

2.2。聚合酶链反应gydF4y2Ba

对于上面的实验,50gydF4y2BaμgydF4y2BaL PCR反应混合物是由使用5% DMSO, 1gydF4y2BaμgydF4y2Ba每个引物,200gydF4y2BaμgydF4y2Ba每个核苷酸,100 ng DNA, 1 xgydF4y2Ba空斑形成单位gydF4y2Ba涡轮DNA聚合酶反应缓冲区,和2.5 UgydF4y2Ba空斑形成单位gydF4y2Ba涡轮DNA聚合酶(Stratagene,加州拉霍亚,美国)。PCR反应进行了如下:2分钟94°C,紧随其后的是30 94°C的周期为30秒,30秒65°C, 72°C 2分钟,最后跟着长在72°C扩展7分钟。gydF4y2Ba

2.3。融合蛋白的表达gydF4y2Ba

的结构,gydF4y2BapET-LTA2B-GHgydF4y2Ba和gydF4y2BapET-ntPE-LTA2B-GH,gydF4y2Ba变成了罗塞塔2 (DE3)镀pLysS细胞(Novagen)和50吗gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL卡那霉素和34gydF4y2BaμgydF4y2Ba包含溶原性肉汤g / mL氯霉素(磅)琼脂板上。阳性克隆培养在25毫升含有50磅媒体gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL卡那霉素和34gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL氯霉素16瓶孵化器人力资源在37°C。文化被转移到475毫升含有50磅媒体gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL卡那霉素和孵化为另一个4人力资源在一个瓶孵化器,直到光密度在280 nm (ODgydF4y2Ba_{280年gydF4y2Ba}达到0.5 - -0.6)的文化。后,蛋白质合成增加1毫米IPTG诱导,和文化是孵化瓶中4人力资源在37°C孵化器。细胞在2600×g离心10分钟,和细胞颗粒被储存在一夜之间−20°C。球被解冻,然后12毫升Cellytic B试剂gydF4y2Ba(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)gydF4y2Ba和20gydF4y2BaμgydF4y2BaL benzonase核酸酶gydF4y2Ba(Novagen)gydF4y2Ba样本被添加和漩涡,直到不再粘滞,然后在室温下孵化(RT) 10分钟。解决方案被转移到35毫升离心管,和包涵体颗粒状离心法在23360 g×10分钟使用Sorvall超级T21台式离心机。可溶性分数(上层清液)得救了,包涵体在6毫升resuspended Cellytic B,和300年gydF4y2BaμgydF4y2BaL 10毫克/毫升的溶菌酶解决方案gydF4y2Ba(σ)gydF4y2Ba随后补充道,漩涡,孵化RT 10分钟。孵化后,10毫升1:10 Cellytic B添加和离心机在16000 g×10分钟。上层清液被丢弃,包涵体是用一个额外的10毫升1:10 Cellytic b洗是重复三次,然后将尸体在10毫升的可溶性尿素缓冲区(8 M尿素在50 mM磷酸钠,0.3 M氯化钠缓冲区在pH值8.0)。gydF4y2Ba

2.4。纯化的融合蛋白gydF4y2Ba

他选择倪gydF4y2Ba^{+ 2gydF4y2Ba}树脂gydF4y2Ba(2.0毫升;σ)gydF4y2Ba离心机在15毫升猎鹰管在200 g×5分钟去除乙醇。树脂与13毫升dd H洗一次gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO和平衡使用13毫升的尿素缓冲区。与可溶性树脂然后孵化包涵体在RT 1小时之后在200×g离心5分钟,和上层的丢弃。13毫升的尿素树脂洗两次缓冲区和纯化蛋白筛选了通过添加10毫升的洗脱缓冲(10 M尿素,150毫米咪唑)和孵化瓶在RT为30分钟。gydF4y2Ba

2.5。sds - pagegydF4y2Ba

样本与2 x Laemmli混合样本缓冲区gydF4y2Ba(σ)gydF4y2Ba1:1的比例和煮10分钟在电泳前水浴4 - 20%的丙烯酰胺梯度凝胶Tris-HCL做好了准备gydF4y2Ba(BIO-RAD)gydF4y2Ba使用SDS-running缓冲区(25毫米三,192毫米甘氨酸,0.1% (w / v) SDS, pH值8.3)。凝胶是沾染了生物安全coomassie污渍gydF4y2Ba(BIO-RAD),gydF4y2Ba然后用蒸馏水使退色可视化蛋白质。gydF4y2Ba

2.6。免疫印迹gydF4y2Ba

蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜转移缓冲(25毫米三,192毫米甘氨酸,20%甲醇,pH值8.3)在RT使用Mini-Trans污点系统1小时gydF4y2Ba(美国加州Bio-Rad大力神,)gydF4y2Ba。1小时的膜被封锁在PBS的RT使用脱脂奶粉3%,补充0.05%渐变20 (PBST),洗3次,PBST和探测1:1000稀释的猪anti-G-H血清(超免疫抗血清免疫从猪FMDV O型共识G-H循环包含肽UBITh [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba为1小时)RT洗5次,PBST紧随其后。膜培养1小时在RT与辣根peroxidase-conjugated合山羊anti-pig免疫球蛋白gydF4y2Ba(美国德克萨斯州Bethyl实验室、蒙哥马利)gydF4y2Ba并与PBST洗了5次,之后。抗体绑定检测3、3′,5、5′-tetramethylbenzidine(三甲,基质包过氧化物酶,gydF4y2Ba向量的实验室,伯林盖姆,加州,美国gydF4y2Ba),直到足够的染色检测。gydF4y2Ba

2.7。GM1 ELISAgydF4y2Ba

96孔聚苯乙烯Immulon-4 HBX微量滴定板gydF4y2Ba(弗吉尼亚州Chantilly丹尼克斯技术)gydF4y2Ba涂有50gydF4y2BaμgydF4y2BaL (10gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL GM1 (monosialotetrahexosylgangliosidegydF4y2BaσgydF4y2Ba)或BSA(消极的控制),在涂料稀释缓冲(0.05 NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba缓冲区,pH值9.6)。盘子被紧紧地裹着保鲜膜gydF4y2Ba(美国威斯康星州梅纳沙市佩希内塑料包装)gydF4y2Ba在RT一夜之间,孵化,然后储存在4°C,直到他们被使用。当天分析,与200年盘子洗了三次gydF4y2BaμgydF4y2BaL缓冲洗(50毫米三,0.14 M氯化钠,渐变20 0.05%,pH值8.0)使用Bio-Tek elx - 405档板gydF4y2Ba(美国Vt Winooski)gydF4y2Ba并与100年孵化gydF4y2BaμgydF4y2BaL屏蔽解决方案(50毫米三,0.14 M氯化钠,1% BSA, pH值8.0)为1小时RT其次是洗涤三次,洗缓冲区。然后50gydF4y2BaμgydF4y2BaL的蛋白质,LTA2B-GH ntPE-LTA2B-GH,霍乱毒素B亚基(施),柠檬酸肽(53-mer肽组成的三个FMDV OgydF4y2Ba_1gydF4y2BaBFS病毒抗原表位,包括一个已知VP4辅助T细胞表位,VP1站点C和VP1网站抗原表位,“柠檬酸”是指抗原表位)的方向,和ntPE (20gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL)被添加到单独的井和孵化2小时的RT。洗的盘子洗了5次缓冲区,紧随其后的是添加1:1000稀释兔抗体霍乱毒素gydF4y2Ba(我Virostat)gydF4y2Ba1:5000稀释兔抗体假单胞菌外毒素AgydF4y2Ba(σ)gydF4y2Ba或1:500稀释猪G-H肽抗体共识,在不同的井,其次是孵化RT 1小时。盘子被洗5次洗涤缓冲和1:10000稀释的山羊antipig免疫球蛋白结合合gydF4y2Ba(Bethyl实验室)gydF4y2Ba或山羊antirabbit免疫球蛋白结合合gydF4y2Ba(Bethyl实验室)gydF4y2Ba添加和孵化RT为1小时。最后洗(5倍)进行清洗缓冲三甲衬底的紧随其后gydF4y2Ba美国马里兰州盖瑟斯堡(KPL Inc .,)gydF4y2Ba通过添加2 N H和停止gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba。最后得到OD在450 nm使用Bio-Tek el - 311板的读者gydF4y2Ba。gydF4y2Ba净anti-ntPE /柠檬酸肽/施反应为每个样本的计算是通过减去平均OD BSA-coated井的平均OD的特定antigen-incubated井。gydF4y2Ba

2.8。动物gydF4y2Ba

48,女,降生不久,Duncan-Hartley几内亚猪gydF4y2Ba(切姆斯福德,榆树希尔实验室质量,美国)gydF4y2Ba被随机分成八组六,对应表中描述的疫苗接种组吗gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。豚鼠被安置在环境控制的房间,和提供食物和水gydF4y2Ba随意gydF4y2Ba。所有动物进行了程序按照一个批准康涅狄格大学IACUC协议(没有。a07 - 025)。gydF4y2Ba

2.9。几内亚猪接种疫苗和程序gydF4y2Ba

几内亚猪麻醉使用雾化异氟烷gydF4y2Ba(百特医疗用品有限公司迪尔菲尔德,生病,美国)gydF4y2Ba根据体重,剂量计算。与100年组免疫gydF4y2BaμgydF4y2Ba克蛋白质免疫原通过鼻内(i.n。)或皮下(南)的路线,如表示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。免疫原测试包括卵清蛋白(控制),柠檬酸肽,LTA2B-GH, ntPE-LTA2B-GH。第一个四组(I-IV) i.n.接种而其他组(V-VIII)南卡罗来纳州接种MPL + TDM +水煤浆辅助系统gydF4y2Ba(σ)gydF4y2Ba1:1的比例。所有动物都影射在0天,i.n.接种动物提高了在周1,2,3与相对应的蛋白质组,南卡罗来纳州接种动物收到了升压剂只有在星期3(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。剂量的疫苗(LTA2B-GH除外)总量为200gydF4y2BaμgydF4y2Ba每豚鼠在100 LgydF4y2BaμgydF4y2BaL /鼻孔。LTA2B-GH的剂量服用一滴一滴地在400年的总量gydF4y2BaμgydF4y2Ba每豚鼠在200 LgydF4y2BaμgydF4y2BaL /鼻孔。从动物血清和鼻腔冲洗收集两周一次的间隔。鼻腔冲洗收集沉淀,然后吸气,50gydF4y2BaμgydF4y2BaL无菌PBS到每个鼻孔。血液通过心脏穿刺收集使用0.5运费到付。注射器和存储在heparin-treated管gydF4y2Ba(美国国际公司虹膜,韦斯特伍德,质量)gydF4y2Ba在RT凝血,然后离心法在1500 g×10分钟获得血清。动物在星期6在镇静,牺牲在intra-cardiac注入Euthazol(1毫克/公斤,gydF4y2BaVirbac啊Inc .,英尺。价值,美国德克萨斯州gydF4y2Ba尸体剖检和组织收集之前)。gydF4y2Ba

2.10。组织收集和处理gydF4y2Ba

脾脏和鼻粘膜收获从每组三个六个动物在验尸。这些组织在无菌水洗RPMI 1640 +谷酰胺gydF4y2Ba(CellGro Mediatech公司,位于弗吉尼亚州赫恩登,美国)gydF4y2Ba和转移到管包含完整的RPMI媒体(RPMI 1640 +谷酰胺+ 10%的边后卫+ 100gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL硫酸链霉素和100 U /毫升青霉素),放在冰。脾脏是分解使用10毫升注射器柱塞在皮氏培养皿中10毫升的完整的RPMI媒体,10毫米尼龙网、过滤和离心10分钟在4°C, 500×g。红细胞表面溶解,5毫升的ACK裂解缓冲NH(0.15米gydF4y2Ba_4gydF4y2BaKHCO Cl, 10毫米gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba、0.1毫米NaEDTA pH值7.4)添加到细胞颗粒,孵化在RT, 5分钟和离心10分钟在4°C, 500×g。5毫升的细胞颗粒当时resuspended RPMI完成。鼻粘膜组织是在无菌媒体洗了三次,然后转移到一个50毫升锥形烧瓶包含20毫升的RPMI / EDTA(完整的RPMI连同5毫米EDTA, pH值8),在室温下,轻轻地搅拌15分钟。EDTA处理/离心重复两三次,直到浮层出现明显。剩余EDTA当时被洗完全RPMI媒体。细胞接受了治疗RPMI /胶原酶与胶原酶2型(完整的RPMI 200 U /毫升(美国新泽西州卫氏生化公司,莱克伍德))与温和搅拌1小时在RT释放鼻粘膜淋巴细胞。瓶的内容然后无菌过滤10毫米尼龙屏幕,滤液是离心机在500 g×10分钟在4°C。细胞悬液清洗去除残留的胶原酶,最后一个球是冰冷的RPMI-10 resuspended 5毫升。脾脏和鼻黏膜淋巴细胞数台盼蓝染色后使用血细胞计数器。细胞被稀释10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/毫升完全RPMI举行冰一直使用。所有步骤都是在无菌条件下进行。gydF4y2Ba

2.11。柠檬酸肽/ LTA2B-GH ntPE-LTA2B-GH特定ELISAgydF4y2Ba

柠檬酸肽,LTA2B-GH ntPE-LTA2B-GH特定的免疫球蛋白,IgM, IgA抗体血清使用间接ELISA和鼻腔冲洗化验。96孔聚苯乙烯Immulon-4 HBX微量滴定板gydF4y2Ba(丹尼克斯技术)gydF4y2Ba涂有50gydF4y2BaμgydF4y2BaL (10gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL解决柠檬酸肽,LTA2B-GH, ntPE-LTA2B-GH或BSA(负控制)涂层缓冲区(0.05 NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba缓冲区,pH值9.6),紧紧地裹着保鲜膜gydF4y2Ba(佩希内塑料包装)gydF4y2Ba一夜之间,孵化RT然后储存在4°C,直到需要。与200年盘子洗了三次gydF4y2BaμgydF4y2BaL缓冲洗(50毫米三,0.14 M氯化钠,渐变20 0.05%,pH值8.0)使用Bio-Tek elx - 405档板。与100年盘子被孵化gydF4y2BaμgydF4y2BaL屏蔽解决方案(50毫米三,0.14 M氯化钠,1% BSA, pH值8.0)为1小时RT其次是洗涤三次,洗缓冲区。血清样本和鼻腔冲洗从周0、2、4和6在稀释1:50 - 1:4,分别在样本缓冲区(50毫米三,0.14 M氯化钠,1% BSA,渐变20 0.05%,pH值8.0)来确定血清免疫球蛋白和鼻腔洗IgA抗体。50gydF4y2BaμgydF4y2BaL(每个样本一式适用于微量滴定板柠檬酸肽,LTA2B-GH ntPE-LTA2B-GH和BSA-coated井。经过1小时的潜伏期在RT,洗的盘子都洗五次缓冲区,紧随其后的是山羊的antiguinea猪免疫球蛋白抗体结合合gydF4y2Ba(Bethyl实验室)gydF4y2Ba的稀释(1:5000年样本缓冲区)或兔子anti-guinea猪IgA抗体(1000年的稀释1:样本缓冲区),和培养1小时然后洗五次rt,盘子和洗缓冲之后,添加山羊antirabbit IgG抗体结合合gydF4y2Ba(Bethyl实验室),gydF4y2Ba稀释在1:10000年样本缓冲和孵化为1小时rt,最后洗了,其次是三甲衬底gydF4y2Ba美国马里兰州盖瑟斯堡(KPL Inc .,)gydF4y2Ba在RT为20分钟,添加2 N HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba停止解决终止反应。最后OD阅读是在450 nm el - 311 Bio-Tek板读者gydF4y2Ba(美国Vt Winooski)。gydF4y2Ba净anti-TCA肽/ LTA2B-GH ntPE-LTA2B-GH特定反应为每个样本的计算是通过减去平均OD BSA-coated井的平均OD的特定antigen-coated井。gydF4y2Ba

2.12。ELISPOTgydF4y2Ba

检测IgA免疫球蛋白和抗体分泌细胞,Multiscreen-IP (0.45gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)96 -孔板gydF4y2Ba(美国微孔,贝德福德,质量)gydF4y2Ba被使用。盘子是prewetted 200gydF4y2BaμgydF4y2Ba信用证的70%乙醇,用无菌PBST冲洗。盘子被涂有以下蛋白质:柠檬酸肽,LTA2B-GH ntPE-LTA2B-GH和BSA控制悬浮在无菌涂层缓冲区,和50gydF4y2BaμgydF4y2Ba信用证也跟着孵化一夜之间在4°C。板块与无菌PBST(200然后洗两次gydF4y2BaμgydF4y2BaL /)后把盘子与无菌rt,盘子被屏蔽屏蔽解决方案(100gydF4y2BaμgydF4y2BaL / RT的1小时)后用无菌PBST洗板一次,200年gydF4y2BaμgydF4y2Ba信用证。10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞在200年被暂停gydF4y2BaμgydF4y2BaL RPMI 1640和添加到指定的井和孵化有限公司5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba孵化器在37°C 14 - 16小时。盘子然后洗五次PBST (200gydF4y2BaμgydF4y2Ba信用证),紧随其后的是新增的主要检测抗体(goat-anti-guinea猪免疫球蛋白g合1:5000或兔子antiguinea猪IgA在1:5000稀释样品缓冲),50gydF4y2BaμgydF4y2Ba每口井的L和孵化2小时在rt Rabbit-anti-guinea猪IgA-coated与洗盘子都洗五次缓冲区,紧随其后的是山羊的antirabbit IgG抗体结合合(gydF4y2BaBethyl实验室,gydF4y2Ba稀释1:10000年样品缓冲,在RT)培养1小时。与PBST盘子然后洗五次,三甲基质添加开发板使用3:2的比例股票解决双氧水三甲gydF4y2Ba(向量实验室Inc .)。gydF4y2Ba斑点数手动使用Lecia CME显微镜gydF4y2Ba(Lecia微系统公司位于德国)gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。生成、表达式和抗原性LTA2B-GH ntPE-LTA2B-GHgydF4y2Ba

在这项研究中,我们生成,表达和纯化的融合蛋白LTA2B-GH ntPE-LTA2B-GH(包含粘膜佐剂ntPE和LTA2B) coexpressed FMDV的VP1 G-H循环O血清型gydF4y2Ba_1gydF4y2BaBFS模型引出的黏膜免疫反应的抗原豚鼠(数字gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba)。所有序列插入表达质粒被确认通过PCR筛选殖民地的存在ntPE(1890个基点),LTA2B(513个基点),G-H(75个基点),和LTA2B-GH(588个基点(图)gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba)。融合蛋白都是高度表达gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21 (DE3) pLysS包涵体IPTG诱导后,就是明证厚乐队在丙烯酰胺凝胶(数据没有显示)。G-H循环内的融合蛋白的抗原性LTA2B-GH和ntPE-LTA2B-GH证实了免疫印迹使用超免疫抗血清免疫从猪FMDV共识G-H环肽(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。正如预期的那样,G-H循环具体多克隆抗体识别LTA2B-GH和ntPE-LTA2B-GH(图gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba)。在沸腾的SDS, B亚基LTA2B-GH互相分离,导致一个大约15 kDa的主要乐队(单体的形式)。ntPE-LTA2B-GH透露两个主要预期78 kDa的乐队(LTA2-ntPE)和15 kDa (LTA2B-GH单体)大小的片段。gydF4y2Ba

3.2。GM1 ELISAgydF4y2Ba

GM1 ELISA进行评估绑定能力LT-B-containing融合蛋白的神经节苷脂(结构如图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(一)和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(b))。柠檬酸肽和ntPE没有检测到anti-GH循环抗体作为GM1他们没有绑定机制。相反,LTA2B-GH与anti-CTB anti-G-H抗体,免疫反应性的确认LTA2B-GH正确折叠和pentamerized。尽管ntPE-LTA2B-GH不是活性anti-CTB anti-G-H抗体,并与anti-ntPE抗体反应,说明融合蛋白(ntPE-LTA2B-GH) GM1结合(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(c)),表面上的融合蛋白的正确折叠LTA2B-GH地区。gydF4y2Ba

3.3。抗体反应G-H环肽gydF4y2Ba

纯化LTA2B-GH & ntPE-LTA2B-GH融合蛋白、卵清蛋白和柠檬酸肽i.n.或南卡罗来纳州管理豚鼠如材料和方法(表所述gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。最早的血清anti-G-H免疫球蛋白反应可以通过ELISA检测观察动物在第2周南卡罗来纳州注射了柠檬酸肽(图gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba在星期4)和柠檬酸肽i.n.免疫动物(图gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba)。收到了柠檬酸的动物肽南卡罗来纳州产生显著antipeptide免疫球蛋白反应在星期2,4,6,和动物收到了柠檬酸肽鼻内产生显著anti-peptide免疫球蛋白反应在星期4,相比其他治疗组。gydF4y2Ba

没有anti-G-H免疫反应组收到LTA2B-GH或者ntPE-TA2B-GH皮下注射(图gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba)。然而,集团收到LTA2B-GH i.n.诱导anti-G-H血清免疫球蛋白在周4和6。这一趋势也出现在集团与ntPE-LTA2B-GH鼻内接种虽然结果未达到统计上的显著水平。gydF4y2Ba

Anti-G-H IgA抗体在鼻腔冲洗明显在周4和6豚鼠接受ntPE-LTA2B-GH或者LTA2B-GH i.n。(图gydF4y2Ba3 (c)gydF4y2Ba)。然而,集团获得了柠檬酸肽鼻anti-G-H免疫反应水平不显著,表明adjuvanticity(在这种情况下,来自融合蛋白)是引起粘膜免疫反应的关键当时FMDV G-H循环抗原。没有检测抗原引起检测IgA抗体反应在动物的鼻粘膜免疫皮下注射(图gydF4y2Ba3 (d)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.4。Antibody-Secreting细胞(对asc)在脾脏和鼻粘膜gydF4y2Ba

在牺牲,淋巴细胞纯化从脾和鼻粘膜从每组3 6动物列举有关酶联免疫斑点。isotype-specific ASC的在收到了柠檬酸肽组,LTA2B-GH, ntPE-LTA2B-GH南卡罗来纳州。,approximately 10–15 spots/million of anti-TCA peptide IgG lymphocytes were observed in the spleen. In addition, only the groups that received LTA2B-GH and ntPE-LTA2B-GH had an observable number of anti-TCA peptide IgG ASC’s in the nasal mucosa (Figure4(一)gydF4y2Ba),这表明载体蛋白和/或辅助的存在是必要的,这种肽抗体诱导的呼吸道组织。此外,只有团体接受LTA2B-GH和ntPE-LTA2B-GH i.n. IgA ASC产生特定的柠檬酸肽鼻黏膜接种动物(图gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba),再次表明adjuvanticity融合蛋白产生粘膜免疫反应至关重要。没有检测到anti-TCA肽的脾脏淋巴细胞反应可以测量任何i.n.免疫动物。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

这项工作的总体目标是开发有效的呼吸道的粘膜佐剂动物,诱导免疫预防疾病的终极目标,限制病毒复制,防止慢性亚临床感染的建立(即载体的动物)。这里我们提供证据表明基于LTA2B-GH目标融合蛋白或ntPE-LTA2B-GH抒发粘膜体液免疫反应对一个重要FMDV VP1中和表位在几内亚猪。这些融合蛋白被证明是非常有效的黏膜免疫原诱导当地抗原抗体形成,包括anti-G-H循环IgA鼻清洗样品。gydF4y2Ba

尽管引起粘膜免疫反应的优势保护动物免受传染病,在这个领域的成功是有限的由于诱导抗体滴度低,瞬态需要多个剂量的免疫反应的抗原,诱导的免疫反应,延迟和低效的建立记忆反应。此外,粘膜免疫反应的刺激不可行的抗原往往是低效的,在某些情况下可能导致免疫耐受(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。尽管如此,它是建立共同服用辅助的分子如细菌毒素CT, LT, PT和PE分泌gydF4y2Ba霍乱弧菌、大肠杆菌、百日咳博德特氏菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba铜绿假单胞菌,gydF4y2Ba分别可以诱导粘膜免疫反应和防止黏膜耐受的诱导gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。此外,无毒的肠毒素基因的融合(运营商)抗原已成功应用于多个病原体的疫苗接种策略(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba27gydF4y2Ba),OgydF4y2Ba_1gydF4y2BaG-H循环融合CT-B甚至被证明保护从FMDV乳儿感染小鼠模型(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。我们的数据是按照这些研究而扩大融合蛋白的受体结合曲目之外先前设计的嵌合体。这增加了潜在的物种数量的任何一个免疫原可能是有效的同时进一步提高呼吸道的粘膜免疫接种动物。gydF4y2Ba

我们假设当FMDV G-H循环耦合LT-B亚基的糖基,总共5份将显示在一个目标分子,LT的B亚基形成一个五聚物。同时,鉴于G-H循环只有一端基因融合(LTA2B-GH),它可能不会引起任何构象限制抗原和佐剂和现在会正确的多个副本的抗原的免疫系统。事实上,功效是证明i.n.接种组接受ntPE-LTA2B-GH或者LTA2B-GH(但不是柠檬酸肽)的抗原分泌IgA生产。别人已经成功地使用类似的疫苗/辅助方法,但随着替代融合的肠毒素抗原。基金经理人等人化学融合了gydF4y2Ba间日疟原虫gydF4y2Ba动合子表面蛋白,Pvs25 CT-B的n端和生成疫苗构建诱导免疫反应,阻止寄生虫传播(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。在另一项研究中,adhesin基因gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba被融合到A2亚基的CT (adhesin-CTA2B)。这种疫苗构建增强IgA免疫球蛋白生产和保护许多老鼠感染(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。虽然有很高的成功与其他肠毒素/抗原融合疫苗,我们考虑另一种方法交付的抗原,即G-H循环VP1基因融合FMDV的糖基LTA2B和取代有毒A1域ntPE佐剂的n端A2段(ntPE-LTA2B-GH)。表达LTA2B-GH和ntPE允许在同一个质粒的形成holotoxin-like嵌合体,这样adjuvanticity和载体的性质LT-B ntPE可以被利用。同时,鉴于LT结合更大的多样性神经节苷脂比其他细菌毒素受体,很可能这个嵌合蛋白的目标属性(包括ntPE-LTA2B-GH或LTA2B-GH)免疫原性品质优越了nonchimeric融合蛋白(虽然这个假设不是实证研究工作)。这是支持的数据表明ntPE-LTA2B-GH诱导大量的anti-G-H IgA抗体仅在鼻腔洗比LTA2B-GH样本,从而表明ntPE连同LTA2B的使用一个额外的效果与G-H循环抗原诱导免疫,可能通过瞄准APC表面CD91通过绑定的礼物。gydF4y2Ba

纯化从脾淋巴细胞与抗原和鼻粘膜是重振和组的动物收到LTA2B-GH和ntPE-LTA2B-GH i.n.最有力的粘膜免疫球蛋白和IgA的响应。这些结果支持我们的中心假设融合蛋白当时的粘膜佐剂抗原能够产生粘膜免疫反应;不幸的是,在豚鼠血清中和试验执行从第6周FMDV表示,只有集团获得了柠檬酸肽南卡罗来纳州中和滴度很高(数据没有显示)。可能有三种可能的原因:(a) G-H循环是共轭的糖基LT-B不得让免疫细胞中和表位(可能是由于位阻可能发生结果的复杂特性,融合蛋白),(b)的表示G-H循环量不足,或(c)融合蛋白实际上获得耐受性G-H循环抗原的动物。豚鼠包括100的免疫机制gydF4y2BaμgydF4y2Bag的每个柠檬酸肽、ntPE-LTA2B-GH或LTA2B-GH,值得注意的是只有G-H循环的比例gydF4y2BaμgydF4y2Bag和20gydF4y2BaμgydF4y2Ba分别于ntPE-LTA2B-GH LTA2B-GH, g。ntPE-LTA2B-GH剂量的增加和LTA2B-GH可能产生一种更健壮的免疫反应,但这并没有检查在这个研究。gydF4y2Ba

总之,我们已经表明,粘膜嵌合的应用融合蛋白刺激生产antipeptide特定血清免疫球蛋白和鼻IgA免疫反应。目前尚不清楚如何ntPE-LTA2B-GH和LTA2B-GH诱导免疫反应观察到在这些研究中,是否通过促进交付5份G-H循环或通过增强免疫应答的添加剂影响这些佐剂,或两者的结合。总的来说,这些结果符合研究表明基因的融合与粘膜抗原载体/诱导粘膜免疫佐剂是一种有效的方法当时抗原。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

作者要感谢康涅狄格大学动物保健人员与畜牧业的援助。这项工作是由美国农业部(ARS)合作协议58-1940-5-520到康州大学卓越中心的疫苗研究。表达任何意见、发现、结论或建议本出版的作者(年代),不一定反映美国农业部的观点。gydF4y2Ba

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