全内反射荧光显微镜成像辛德比斯病毒感染早期步骤

摘要

辛德比斯病毒(Sindbis virus, SINV)是一种甲病毒，具有广泛的宿主范围，已被广泛用作重组基因转导、dna疫苗生产和溶瘤肿瘤治疗的载体。SINV进入宿主细胞的机制尚不完全清楚。在本文中，我们使用全内反射荧光显微镜(TIRFM)下的单病毒跟踪技术来研究SINV在细胞表面的附着。生物素化的病毒粒子被标记为量子点，保留了病毒活力和传染性。通过延时成像，我们发现SINV在宿主细胞表面表现出异质性动力学。对SINV的动力学分析表明，它是一个两步吸附反应。此外，GFP-Rab5和SINV的双色TIRFM提示病毒是靶向于内吞后的早期核内体。这些发现表明量子点标记在研究SINV感染的早期步骤和行为方面是有用的。

1.介绍

辛德比斯病毒(SINV)是一种阿尔法病毒，是托加病毒家族的成员，该家族还包括塞姆利基森林病毒和罗斯河病毒[1］．它于1952年首次从埃及辛德比斯地区的蚊子中分离出来[2］．经解码的SINV基因组显示了一个11.7 kb大小的单链RNA [3.］．进入细胞后，病毒RNA链作为信使RNA翻译四个对病毒复制至关重要的非结构基因。在感染后期，结构基因由亚基因组RNA翻译和合成。由此产生的病毒颗粒包含基因组RNA的核衣壳和衣壳蛋白，被包膜蛋白E1/E2包裹，形成并作为成熟病毒脱芽[4，5］．参与Sinv进入宿主细胞的受体仍然表征差。这种受体之一是67kD高亲和力层粘连蛋白受体（LR），已被证明已介导BHK细胞的SinV感染[6，7］．此外，有报道称硫酸肝素是细胞表面的主要成分，直接参与培养细胞的SINV感染[6，8］．在SINV感染的早期阶段，关于病毒在宿主细胞表面的附着和运动知之甚少。

SINV长期以来被用作研究脑炎的实验模型，因为它导致新生小鼠脑脊髓炎[9］．此外，由于SINV具有广泛的宿主范围，并能提供高效的基因表达，基于该病毒的载体已被开发用于疫苗生产和基因治疗目的[10，11］．在癌症疗法中，Sinv已被测试为溶解试剂的潜在潜在的试剂。已经表明，来自野生型SINV的SINV菌株（TOTO1101）是有效的靶向和杀死卵巢，结肠，前列腺和肝癌患者的肿瘤细胞，导致动物模型中的肿瘤消退[12，13］．

近年来，基于量子点(Qdot-)的荧光标记越来越多地应用于细胞事件成像，包括单分子跟踪和活细胞成像[14- - - - - -16］．量子点是一种具有广泛激发和发射光谱的半导体纳米晶体。量子点的一个优点是它抗光漂白，允许长时间暴露在激发光下。在本研究中，我们用生物素标记SINV，并将病毒与Qdot 605偶联。通过单病毒跟踪，我们能够分析单个SINV在感染初期的行为和动态，这显示了一个两步，受体介导的细胞附着过程。

2.材料和方法

2.1。细胞培养和SINV制备

在补充10％FBS和抗生素的MEM中培养BHK-21细胞。将细胞保持在潮湿的37℃培养箱中，5％CO₂．为了构建表达绿色荧光蛋白(GFP)的sinvgfp -GFP，我们首先将GFP cDNA(来自于pS65T-C1, Clonetech)克隆到由pH3 ' 2J1修饰而成的穿梭载体pH2J1Y中(由美国俄克拉荷马州大学李广普博士提供)。质粒pH2J1Y中含有含有Kpn I、Sal I、EcoR V、Hind III和Nhe I等多个克隆位点的连接子，该连接子插入pH3’2J1的Xba I和Bam H1位点之间。Nhe I和Bam H1将编码GFP的cDNA切断，并在相同位点连接到pH2J1Y上。将含有GFP cDNA的pH2J1Y的Apa I- xho I片段亚克隆到SINV载体pToto/3 ' 2J中。为了构建SINV-C ' -YFP，将62-106个氨基酸序列替换为EYFP，通过PCR诱变，将替换后的衣壳蛋白侧翼的Sph I和Mlu I位点导入到pToto/3 ' 2J中。以pEYFP-C1为模板，PCR扩增Sph I和Mlu I位点的EYFP。利用Xho i线性化质粒模板的sp6 RNA聚合酶转录得到的帽状RNA转染BHK21细胞，获得重组SINV。在感染30小时后收集培养上清获得病毒储备，等量物在−80°C保存直到使用。用结晶紫染色法在BHK21单分子膜上进行空斑实验测定病毒滴度。

2．2．生物素酰化的SINV

在无血清MEM中收集sinvgfp，用生理盐水(1:1)稀释至~4 × 10⁸pfu/mL，用生物素在室温或冰上标记。简单地说，将病毒与10 mM的原液nhs - peg4生物素(29 Å间隔臂，Pierce)在PBS (pH 8.0)中混合，最终浓度为300μ室温下保温30分钟。加入甘氨酸0.1 M，室温孵育15 min，终止反应。为了在冰上进行生物素化，将SINV与如上所述的nhs - peg4生物素在冰上孵育90分钟。加入甘氨酸，室温孵育20分钟，终止反应。在这两种标记条件下，我们没有注意到生物素化效率和由此产生的生物素化SINV的感染性有任何显著差异。为了对标记的SINV进行western blot分析，将SINV的等份放入含有1% SDS、10 mM EDTA、10 mM DTT、15%甘油、20 mM Tris-HCl、pH 6.8和0.01%溴苯酚蓝的样品缓冲液中，在100℃下加热3分钟。用SDS-PAGE分离SINV蛋白，转移到硝化纤维素膜上。碱性磷酸酶结合的链霉亲和素(1:5000,Sigma)被用来可视化生物素化的SINV包膜蛋白。

2．3.SINV感染，荧光显微镜和图像分析

生物素化SINV用于感染BHK-21细胞的MOI (multiplicity of infection)为5-20。将病毒与细胞在4°C孵育1小时。PBS洗涤去除未结合病毒后，用链霉亲和素偶联Qdot 605 (Invitrogen)孵育60分钟，用冷PBS洗涤3次。细胞用3.7%甲醛在PBS中室温固定30分钟。采集荧光图像并进行数字化分析。活细胞实验中，在冰或4°C条件下感染1小时，然后转移到35°C条件下显微镜观察。

对于TIRFM，我们使用的是配备60X (TIRF目标加热到37°C。细胞在自制的玻璃底皿中培养，并在附带5% CO的环境控制室(奥林巴斯，美国)中保持在35°C₂．采用20 mW 488 nm激光源激励和500 nm长通二向色分束器实现TIRF照明。用525/20 nm的发射滤光片观察GFP/YFP，用600/40 nm的发射滤光片观察Qdot 605。排放过滤器由Lambda 10 (Sutter Instrument, Novato, CA, USA)高速过滤轮控制。图像由CCD相机(Quantix 57, Photometrics，图森，亚利桑那州，美国)气冷至−25°C拍摄。摄像机由IPlab 3.9.4 (Scanalytics, Fairfax, Va, USA)控制，并使用IPlab软件进行分析。为了表达GFP-Rab5，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)和pGFP-Rab5 (Dr. Guangpu Li, University of Oklahoma Health Sciences Center)转染BHK-21细胞。转染24-48小时后，在TIRFM下对表达GFP-Rab5的细胞进行成像。

3.结果

3．1.用Qdot 605标记SINV

SINV首先通过29Å PEG结合到生物素上。为了达到接近100%的SINV标记，过量的nhs生物素在300μM被用于反应中。这对于确保观察到的感染确实是由生物素化的SINV引起的，而不是由天然和未修饰的病毒引起的是必要的。然而，接合反应降低了4×10病毒的感染效价⁸到10⁶-10年⁷空斑形成单位/毫升。这种降低主要是由于nhs -生物素的过度化学修饰，当nhs -生物素的浓度降低时，对病毒效价的影响较小(数据未显示)。Western blot分析显示，E1/E2包膜蛋白均被标记(图)1(一))．此外，过量的交联导致部分E1/E2蛋白表观分子量略高(图)1(一))．当生物素- sinv与Qdot 605(一个直径为5-12 nm的中型量子点)预孵育时，病毒-Qdot结合物仍然活跃地感染bk -21细胞，感染活性略有下降(<2倍)。然而，如果我们在4°C下用SINV预孵育1小时，然后加入Qdot，则传染性的降低是最小的。在荧光显微镜下，qdot标记的SINV与宿主细胞特异性结合明显(图)1 (b))．为了确定Qdot-SINV是否能够进入细胞并进行病毒复制，我们跟踪了病毒载体编码的重组GFP的表达。在第一轮感染完成后14小时，BHK-21细胞进行GFP和Qdot 605荧光评分。随机选取的细胞检测显示>70%表达GFP ()对Qdot 605也有积极影响(图1（c）)，提示qdot标记的SINV能够进入细胞并继续复制和表达病毒基因组。

3．2．qdot标记SINV在BHK细胞表面的动态

为了研究SINV在宿主细胞质膜上的动态，我们采用延时显微镜实时记录病毒在TIRF下的运动。为了同步病毒附着和抑制病毒进入，我们在4°C或冰上进行了孵化反应。这可能会在表面附着阶段抑制SINV。然后将细胞培养转移到35°C环境控制室进行显微镜观察。我们首先记录了SINV-C ' -YFP的运动，它有一个44个氨基酸结构域的衣壳蛋白被EYFP取代。该病毒与由pToto/3 ' 2J产生的野生型病毒具有相同的传染性(数据未显示)。如图所示2（a），病毒以随机的方式在0到600nm /秒的速率下迅速移动。我们能够根据运动速度识别两种类型的病毒受体关联。一个是简短的，瞬态的，这是通过病毒的快速运动而举例说明的。其他类型的病毒受体相互作用似乎是坚固的附着，伴随着病毒的固定（图2（a）)．当我们跟踪用QDOT 605标记的SINV时，病毒还表现出两种细胞关联作为SINV-C'-YFP。附着的qdot-sinv的运动出现类似于Sinv-c'-yfp的运动，最大速率为〜500nm /秒（图2 (b))．SINV以随机的轨迹快速移动。病毒与细胞表面之间存在频繁的结合和分离。大多数互动都是短暂而短暂的。当病毒牢固地附着在细胞表面并几乎静止不动时，完全的病毒附着变得明显(图)2 (b))．这一发现表明量子点对病毒与受体相互作用的性质没有显著影响。为了进一步研究qdot标记SINV在细胞表面附着过程中的行为，我们收集了多个细胞()，并以每单元2秒的帧率记录100帧。如图所示2 (c)，我们观察到4种典型的SINV在细胞表面的运动。近60%的病毒颗粒几乎是不移动的，这表明它们可能是非特异性地与受体结合，或者它们可能因Qdot标记而功能受损。其余40%的SINV粒子沿膜表现出不均匀的侧向运动。而一些(23%)被限制在一个小范围内(<0.25μM.²)，其他人(17%)已经超过了几个μ米的距离。SINV的移动速度也是不均匀的，范围从0到500 nm / s(图)2)．病毒似乎经常偏爱某些地方，并会在附近移动。此外，一旦病毒停留在某个特定地点，移动速度将显著放缓(图)2)．这些结果表明了动机SINV的两步连接过程。第一步涉及高度移动受体，并且第二步涉及受体/病毒的固定，也许在病毒内化之前（图2)．

3．3.Cell Entry后跟踪SINV

SINV已被证明在受体结合后发生网格蛋白依赖的内吞作用[17］．然而，病毒在内吞反应后的命运仍有待完全阐明。通过追踪用Qdot 605标记的单个SINV粒子，我们可以确定SINV是通过包含rab5的早期核内体运输的。用qdot标记的SINV感染表达GFP-Rab5的BHK细胞，在35℃TIRF条件下追踪病毒。利用TIRFM优越的光学切片能力，我们可以根据其在TIRF下与Rab5在同一光学平面上的存在来识别内化的SINV。如图所示3.， SINV被内化后靶向到含有rab5的早期核内体。SINV与Rab5的共定位持续了15 ~ 60秒，说明早期核内体向晚期核内体快速成熟。有趣的是，大约40%的SINV没有与GFP-Rab5共域(数据未显示)。

4.讨论

量子点已经被广泛应用，包括可视化人类肝脏中的丙型肝炎病毒感染[18]，追踪单个SV40病毒[19，实时成像HER2在肿瘤细胞上的变化[20.］．利用基于qdot的单病毒跟踪，我们能够开始剖析SINV感染的早期事件。我们已经证明，在生产性感染过程中，SINV利用两步结合反应实现与其受体的高亲和力结合。第一个结合反应导致结合的病毒在宿主细胞表面高度移动和动态。这种结合通常不会导致病毒内化，可能持续几秒钟到几分钟。第二步是高亲和力的结合和附着，伴随着病毒流动性的急剧下降。病毒固定化可能是病毒内吞作用前的必要步骤。内化后，Qdot-SINV似乎通过包含Rab5的早期核内体转运(图)3.)，这与之前关于塞姆利基森林病毒的报告一致[21］．然而，大约40%的Qdot荧光没有与Rab5-GFP共定位(数据未显示)。没有GFP-Rab5共定位的Qdot-SINV数量如此之多的一种可能性是，它们涉及rab5阴性核内体结构域，类似于报道的Semliki Forest病毒[21］．另外，由于Qdot的高稳定性和强荧光，很难记录低水平的Rab5-GFP荧光，特别是在长时间曝光(>2分钟)后。因此，Qdot-SINV与rab5阴性室之间的关系还有待进一步研究。

量子点的一个优点是它们高度抗光漂白。这使得感兴趣的样品可以长时间的激发，在某些情况下需要几分钟到几小时的观察。在我们使用20 mW 488 nm激光器的经验中，Qdot 605在TIR连续照明3分钟后仍保持了近100%的荧光强度。相比之下，EYFP在激发30秒后荧光发射显著降低，3分钟后>强度下降90%。因此，对SINV-C ' -YFP的追踪时间限制在2分钟以内，使病毒内化后的研究变得困难。利用qdot标记的SINV，我们可以跟踪病毒长达一个小时，这极大地扩展了病毒感染过程的数据收集。量子点的另一个好处是它们有广泛的激发光谱，这允许多个荧光团同时激发。如图所示3.，我们能够执行双TIRF成像使用一个单一的激励源。

量子点的限制是它们相对大的尺寸，范围为10至20nm。当与SINV的E1 / E2包膜蛋白如E1 / E2包络蛋白缀合时，它们可能会干扰蛋白质的正常功能。最大的病毒感染性损失是由于初始的生物素化反应。由于过量的生物素化，一些病毒似乎是无活性的。有趣的是，链霉抗生物素蛋白-QDOT 605的结合对SinV感染具有较小的不良影响，通过在SINV附着到细胞表面后通过添加QDOT进一步改善。对Sinv QDOT结合的相对良性的障碍效果表明，平均直径为5-12nm，QDOT 605没有显着影响SINV的感染性。我们相信这很可能是因为QDOT 605主要以1：1的比例为SINV。然而，可以进一步优化缀合过程的条件以最小化阻碍，这将使基于量子点的跟踪成为研究病毒感染的分子细节的更广泛使用的工具。

致谢

作者感谢奥克拉荷马大学健康科学中心李广普博士提供的pToto/3 ' 2J质粒和pGFP-Rab5载体。这项工作得到了俄克拉荷马州科学技术进步中心(HR07-056)和美国肉瘤基金会的资助。

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