AV 病毒学的进步 1687 - 8647 1687 - 8639 Hindawi出版公司 535206年 10.1155 / 2011/535206 535206年 研究文章 成像辛德毕斯病毒感染的早期步骤全内反射荧光显微镜 顾 的你们 杨 圆睁 刘 Yuechueng 巴纳吉 Amiya K。 病理学系 俄克拉荷马大学健康科学中心 邮政信箱26901 俄克拉荷马城 好73190年 美国 ouhsc.edu 2011年 23 11 2011年 2011年 11 07年 2011年 07年 09年 2011年 08年 09年 2011年 2011年 版权©2011你顾et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

辛德毕斯病毒(SINV)是一种甲病毒具有广泛的宿主范围,已被广泛用作向量重组基因转导,dna疫苗生产,溶瘤细胞的癌症疗法。SINV进入宿主细胞的机制尚未完全了解。在本文中,我们使用单一病毒跟踪下全内反射荧光显微镜(TIRFM)调查SINV对细胞表面。用量子点标记生物素化的病毒颗粒,保留病毒生存能力和传染性。延时成像,我们表明,SINV展出异构动态表面的宿主细胞。分析SINV能动性表现出两步反应的依恋。此外,双颜色TIRFM GFP-Rab5和SINV表明病毒是针对早期的内吞作用后核内体。这些发现证明量子点标记的效用研究SINV感染的早期步骤和行为。

 1。介绍

辛德毕斯病毒(SINV)是一种α病毒和宽外袍病毒家族的成员还包括Semliki森林和罗斯河病毒( 1]。它在1952年首次分离从蚊子辛德毕斯地区发现在埃及( 2]。解码SINV基因组显示11.7 kb大小的以单链RNA ( 3]。在细胞,病毒RNA链作为信使RNA翻译四nonstructure基因病毒复制所必需的。在感染后期,结构基因是翻译和subgenomic RNA的合成。由此产生的病毒颗粒含有核衣壳的基因组RNA和蛋白质衣壳,与膜蛋白E1 / E2打包,形成和成熟病毒出芽 4, 5]。的受体参与SINV进入宿主细胞特征仍然不佳。这种受体之一是67 kD的高亲和性层粘连蛋白受体(LR),它已被证明调解SINV博鸿泰细胞的感染( 6, 7]。此外,据报道,硫酸乙酰肝素,细胞表面的主要成分,是直接参与SINV培养细胞的感染 6, 8]。所知甚少关于病毒的附件和运动在宿主细胞表面SINV感染的早期阶段。

SINV一直作为实验模型,研究小鼠脑炎,因为它导致新生儿脑脊髓炎( 9]。此外,由于SINV具有广泛的宿主范围,可以提供高效的基因表达,向量基于病毒已经开发生产疫苗和基因治疗的目的 10, 11]。在癌症治疗中,SINV一直作为一个潜在的溶瘤细胞的试剂进行测试。已经表明,SINV应变(Toto1101)来自于野生型SINV是有效的攻击和杀害卵巢肿瘤细胞、结肠癌、前列腺癌、肝癌病人,导致肿瘤回归在动物模型( 12, 13]。

近年来,量子点(Qdot)基于荧光标记已经成为越来越多地用于包括单分子成像的细胞事件跟踪和live-cell成像( 14- - - - - - 16]。Qdots半导体纳米晶体有广泛的激发和发射光谱。Qdot的一个优点是它的耐光漂白,允许长时间暴露于激发光。在最近的研究中,我们用生物素标记SINV和共轭病毒Qdot 605。使用单个病毒跟踪,我们可以剖析个人的行为和动态SINV在感染的初始阶段,显示出两步,受体介导细胞连接的过程。

 2。材料和方法 2.1。细胞培养和SINV准备

BHK-21细胞培养在MEM补充10%的边后卫和抗生素。这些细胞被维护在一个湿润37°C孵化器有限公司为5%2。建设SINV-GFP表达绿色荧光蛋白(GFP), GFP cDNA(从pS65T-C1 Clonetech)第一只克隆到一个穿梭载体pH2J1Y修改从pH3′2 j - 1(请Guangpu Li博士提供的俄克拉荷马大学好,美国)。质粒pH2J1Y包含附加多个克隆站点的链接器,Kpn我,萨尔,EcoR V,后三世,我新人道,插入Xba我和Bam H1网站之间的pH3′2 j - 1。的互补脱氧核糖核酸编码绿色荧光蛋白是由新人道我和Bam H1和结扎切除pH2J1Y在相同的网站。Apa I-Xho我pH2J1Y窝藏GFP的cDNA片段subcloned进SINV向量pToto / 3′2 j。构建SINV-C′-YFP, 62 - 106年的衣壳蛋白的氨基酸序列是EYFP取代,一个反光镜锁定Sph我和我网站侧翼取代衣壳序列引入pToto / 3′2 j PCR诱变。EYFP Sph我和我放大了PCR克隆网站使用反光镜锁定pEYFP-C1作为模板。重组SINV由BHK21细胞转染使用限制来自sp6 RNA聚合酶RNA转录Xho I-linearized质粒模板。病毒股获得的收获文化感染和整除后上层清液30人力资源存储在−80°C到使用。在BHK21单层膜上病毒滴度测定空斑实验用结晶紫染色。

 2.2。生物素酰化的SINV

SINV-GFP收集在无血清MEM稀释的盐水(1:1)~ 4×108空斑形成单位/毫升,在室温下用生物素标记或冰。简单地说,病毒与10毫米混合证券NHS-PEG4-Biotin(29间隔臂,皮尔斯)PBS (pH值8.0)在300年最终浓度 μ在室温下M为30分钟。通过添加甘氨酸反应终止0.1米和孵化在室温下15分钟。对生物素酰化冰,SINV孵化了NHS-PEG4-Biotin如上所述90分钟在冰上。反应终止了甘氨酸和进一步孵化在室温20分钟。我们没有注意到任何显著差异的效率产生的生物素化的生物素酰化和传染性SINV两个标签的条件下生产。标记的免疫印迹分析SINV,整除SINV被加热在100°C 3分钟示例包含1% SDS的缓冲区,EDTA 10毫米,10毫米德勤,15%的甘油,20毫米Tris-HCl, pH值6.8,0.01%溴酚蓝。SINV蛋白sds - page和转移到硝化纤维膜中分离了出来。碱性phosphatase-conjugated链霉亲和素(1:5000年,σ)被用来可视化生物素化的SINV信封蛋白质。

 2.3。SINV感染、荧光显微镜和图像分析

生物素化的SINV用于感染BHK-21细胞5 - 20的莫伊(感染复数)。病毒在4°C细胞孵育1小时。洗后用PBS去除游离病毒,这些细胞被进一步孵化streptavidin-conjugated Qdot 605(表达载体)60分钟,洗3次冷PBS。PBS formaldhyde 3.7%的细胞被固定在室温下30分钟。荧光图像获取和数字化进行分析。活细胞实验中,感染了冰或在4°C 1小时前转向显微镜的35°C室。

TIRFM,我们使用了一个奥林巴斯IX71配备一个60 x ( n 。 一个 。 = 1.45 )TIRF客观加热到37°C。细胞在培养皿中一个自制的玻璃底和维持在35°C的环境控制箱(美国奥林巴斯)补充公司为5%2。TIRF照明是通过使用一个20 mW激发波长488纳米的激光源和长传球二向色分束器(500海里)。GFP / YFP被发射滤波器的525/20 nm, Qdot 605被发射滤波器的600/40 nm。排放过滤器控制λ10(萨特乐器,诺瓦托、钙、美国)高速滤光轮。与CCD相机图像捕获(Quantix 57,光度,图森,亚利桑那州,美国)风冷−25°C。相机是由IPlab 3.9.4(美国弗吉尼亚州Fairfax Scanalytics,)和分析IPlab软件。GFP-Rab5表达式,BHK-21细胞转染使用Lipofectamine 2000(表达载体)和pGFP-Rab5 (Guangpu Li博士俄克拉荷马大学健康科学中心)。细胞表达GFP-Rab5成像在TIRFM转染后24 - 48小时之内。

 3所示。结果 3.1。标签SINV Qdot 605

SINV首次结合生物素联系通过29个挂钩的手臂。为了达到近100% SINV标签,过量的NHS-biotin 300 μM是用于反应。这是必要的,以确保确实观察到感染的生物素化的SINV,不是由本地和un-modified病毒。共轭反应,减少了感染病毒的效价4×108到106-10年7空斑形成单位/毫升。这样减少主要是由于过度化学改性以来NHS-biotin病毒效价时影响较小的浓度NHS-biotin减少(数据没有显示)。免疫印迹分析表明,两个E1和E2信封蛋白质标记(图 1(一))。此外,过度交联导致一些E1和E2蛋白转向表观分子量较高(图 1(一))。biotin-SINV preincubated Qdot 605时,一个中型的量子点为5 - nm直径、virus-Qdot共轭仍积极与小减少感染感染BHK-21细胞活动(< 2折)。然而,如果我们与SINV preincubated细胞1小时在4°C,然后添加Qdot,减少传染性变得最小。特定的绑定到宿主细胞Qdot-labeled SINV明显受到荧光显微镜(图 1 (b))。确定Qdot-SINV能够进入细胞和病毒复制,我们跟着重组GFP的表达由病毒编码向量。BHK-21细胞GFP和Qdot得分605荧光14小时后感染,感染的第一轮完成后。检查随机选择的细胞显示> 70%细胞表达绿色荧光蛋白( n = 500年 605(图)也被Qdot阳性 1 (c)),这表明,Qdot-labeled SINV能够进入细胞并继续复制和表达病毒基因组。

生物素酰化和SINV Qdot标签。SINV被贴上NHS PEG4-biotin节中描述 2。(一)免疫印迹分析,生物素化的SINV使用alkaline-phosphatase-conjugated链霉亲和素E1和E2膜蛋白显示有效的标签(*)。线路1:控制标记SINV和2:生物素化的SINV。分子量标记(kD)标记。605 (b)生物素化的SINV贴上Qdot专门绑定目标细胞。箭头表示Qdot-labeled SINV。酒吧= 25 μm。(c)生物素化的SINV贴上Qdot 605活跃感染靶细胞表达绿色荧光蛋白。图像被感染后14个小时。箭头指示Qdot信号。酒吧= 25 μm。

 3.2。动态Qdot-Labeled SINV博鸿泰细胞表面

研究动力学SINV对宿主细胞的等离子体膜,我们使用延时显微镜实时记录病毒的运动TIRF之下。为了同步病毒吸附和抑制病毒侵入,我们进行了孵化反应在4°C或冰。这可能会逮捕SINV表面依恋阶段。细胞培养被转移到一个35°C的环境控制显微镜室。我们第一次记录的运动SINV-C′-YFP, 44-amino-acid域的衣壳蛋白EYFP所取代。这种病毒被证实保留相同的传染性野生型病毒产生pToto / 3′2 j(数据没有显示)。如图 2(一个)随机的方式,病毒迅速移动速度从0到600海里/秒。我们能够区分两种类型的病毒受体协会基于运动的速度。一个是短暂,以快速运动的病毒。另一种类型的病毒受体相互作用似乎是公司附件,伴随着病毒的固定(图 2(一个))。当我们跟踪SINV贴上Qdot 605年,病毒也表现出两种类型的细胞协会SINV-C′-YFP。附加的运动Qdot-SINV出现类似SINV-C′-YFP,最大速度的~ 500 nm /秒(图 2 (b))。SINV移动迅速的随机轨迹。有频繁的关联和病毒和细胞表面之间的分裂。大多数出现短暂的交互。完整病毒附件变得明显时,病毒是坚定地绑定到细胞表面,成为近固定(图 2 (b))。这一发现表明,Qdot没有显著影响病毒受体相互作用的性质。做进一步调查的行为Qdot-labeled SINV在细胞表面的附件,我们收集了多个单元的图像( n = 200年 )和记录100帧为每个细胞每帧速率2秒。如图 2 (c)我们观察到4 SINV在细胞表面的典型动作。近60%的病毒粒子几乎是不动的,这表明他们可能是非绑定到受体或可能从Qdot标签功能受损。另40%的SINV粒子显示异构沿着膜横向运动。虽然一些(23%)被关在一个小区域(< 0.25 μ米2),其他(17%)超越数 μ米的距离。SINV运动的速度也是异类,范围从0到500纳米(图 2)。看来病毒往往偏爱某些网站和将在附近。此外,运动将大大减缓病毒一旦选定了一个特定的网站(图 2)。这些结果提出了两步SINV依恋的过程等。第一步涉及高度移动的受体,第二步涉及受体的固定/病毒,病毒之前也许内化(图 2)。

单粒子跟踪SINV病毒绑定到细胞表面。伪彩色图像显示SINV附件涉及到绑定一个两步的过程。(一)SINV-C′-YFP(箭头)跟踪TIRF模式下130秒。其运动速度测量手动帧。装箱图片表明病毒没有可测量的运动。(b)跟踪SINV贴上Qdot 605。(c)四种代表性的轨迹Qdot-labeled博鸿泰SINV运动等离子体膜。 一个:不动; b:移动,但在小范围(< 0.5 μ米直径); c:通过长距离移动(> 1 μ米); d:通过介质移动距离(0.5 - 1 μ米)。酒吧= 10 μm。

 3.3。细胞后跟踪SINV条目

SINV已被证明接受clathrin-dependent内吞作用受体结合后( 17]。然而,病毒的命运后内吞作用的反应还有待充分描述。粒子通过跟踪单个SINV贴上Qdot 605年,我们能够确定SINV是通过Rab5-containing早期核内体。博鸿泰细胞表达GFP-Rab5感染了Qdot-labeled SINV,病毒在35°C下TIRF跟踪。通过TIRFM的优越的光学切片功能的优势,我们能够识别一个内化SINV基于其在相同的光学平面Rab5 TIRF之下。如图 3早期,SINV针对Rab5-containing内化后核内体。了的SINV Rab5持续了15到60秒,这表明核内体早期到后期核内体的快速成熟。有趣的是,大约40%的SINV没有colocalize GFP-Rab5(数据没有显示)。

双颜色TIRFM SINV和内吞作用后Rab-5。SINV病毒进入细胞后跟踪(红色)。大约90秒之后,它与GFP-Rab5(绿色)。协会持续了~ 60秒前GFP-Rab5分离和SINV更深的进入细胞。时间在几秒钟内标签。箭头指示Rab5协会。最后的图像显示了一个叠加复合细胞的照片。

 4所示。讨论

量子点被用于广泛的应用程序包括可视化的丙型肝炎病毒感染人类的肝脏( 18),追踪单SV40病毒( 19),和实时成像HER2在肿瘤细胞 20.]。使用Qdot-based单个病毒跟踪,我们可以开始解剖事件涉及SINV早期感染。我们已经证明,在多产的感染,SINV采用两步反应绑定到实现的高亲和性结合受体。第一次绑定的反应导致了高度移动和动态绑定病毒宿主细胞表面。这个绑定通常没有导致病毒内化和可能持续从秒到几分钟。第二步是高亲和性绑定和附件,它是伴随着大幅减少病毒的流动性。病毒的固定病毒内吞作用之前可能是一个必要的一步。内化后,Qdot-SINV似乎是通过早期核内体包含Rab5(图 3),这与先前的报道是一致的Semliki森林病毒( 21]。然而,大约40%的Qdot荧光没有colocalize Rab5-GFP(数据没有显示)。一种可能性等大量Qdot-SINV没有GFP-Rab5 co-localization是他们参与Rab5-negative内体领域,类似报道Semliki森林病毒( 21]。另外,由于Qdot高度稳定和强烈的荧光,很难记录Rab5-GFP荧光水平低,特别是在长时间曝光(> 2分钟)。因此,协会的Qdot-SINV Rab5-negative舱还有待进一步研究。

对量子点的一个优势是,他们是高度耐光漂白。这允许长时间样品的激发兴趣,在一些实例需要几分钟至几小时的观察。在我们的经验中使用20 mW波长488纳米的激光,605年Qdot保留近100% 3分钟后荧光强度连续照明下行动。相比之下,EYFP显示显著减少后的荧光发射只有30秒的激发和失去了> 3分钟后90%的强度。因此,跟踪SINV-C′-YFP仅限于< 2分钟,很难学习内化后的病毒。与Qdot-labeled SINV,我们能够按照病毒长达一个小时,大大扩展了数据收集在病毒感染过程。量子点的另一个好处是,他们有广泛的激发光谱,它允许同时多个荧光团的激发。如图 3,我们能够执行双重TIRF成像使用单一激励源。

量子点是他们的限制相对较大的大小,范围从10到20海里。当共轭E1和E2信封蛋白质等生物分子SINV,他们可能会干扰正常的功能蛋白质。病毒的传染性最大的损失是由于最初的生物素酰化反应。看来有些病毒失效是由于过度的生物素酰化。有趣的是,605年streptavidin-Qdot绑定SINV感染,减少了不良影响后进一步提高通过添加Qdot SINV附件到细胞表面。相对良性的阻碍影响Qdot绑定SINV表明,平均5 - nm直径,Qdot 605没有显著影响SINV的传染性。我们认为这可能是由于这一事实Qdot 605绑定SINV大多在1:1的比例。然而,接合过程的条件可以进一步优化以减少阻碍,这将使quantum-dot-based跟踪更广泛使用的工具为研究病毒感染的分子细节。

 确认

作者感谢李Guangpu博士(俄克拉荷马大学健康科学中心)提供pToto / 3′2 j质粒和pGFP-Rab5向量。这项工作是支持由俄克拉荷马中心科技促进会(hr07 - 056)和美国肉瘤的基础。

 施特劳斯 j . H。 施特劳斯 e . G。 再:基因表达、复制和进化论 微生物学检查 1994年 58 3 491年 562年 2 - s2.0 - 0028088152 泰勒 r·M。 Hurlbut h·S。 工作 t·H。 金斯敦 j . R。 Frothingham t E。 辛德毕斯病毒:一个刚被公认arthropodtransmitted病毒 美国热带医学和卫生杂志》上 1955年 4 5 844年 862年 2 - s2.0 - 0000045697 施特劳斯 e . G。 大米 c . M。 施特劳斯 j . H。 完整的核苷酸序列辛德毕斯病毒的基因组RNA 病毒学 1984年 133年 1 92年 110年 2 - s2.0 - 0021319456 Lemm j . A。 大米 c . M。 非结构化的角色多蛋白和乳沟产品在调节辛德毕斯病毒RNA复制和转录 病毒学杂志 1993年 67年 4 1916年 1926年 2 - s2.0 - 0027475009 Shirako Y。 施特劳斯 j . H。 辛德毕斯病毒RNA复制的调节:uncleaved P123 nsP4函数负链RNA合成,而从P123裂解产品需要有效的正链RNA合成 病毒学杂志 1994年 68年 3 1874年 1885年 2 - s2.0 - 0027979138 Klimstra w·B。 每年都会 k·D。 约翰斯顿 r·E。 适应博鸿泰辛德毕斯病毒的细胞选择使用硫酸乙酰肝素受体作为一个附件 病毒学杂志 1998年 72年 9 7357年 7366年 2 - s2.0 - 0031869503 王 k . S。 库恩 r . J。 施特劳斯 e . G。 欧 年代。 施特劳斯 j . H。 高亲和性层粘连蛋白受体是辛德毕斯病毒在哺乳动物细胞的受体 病毒学杂志 1992年 66年 8 4992年 5001年 2 - s2.0 - 0026628752 伯恩斯 答:P。 格里芬 d E。 绑定辛德毕斯病毒细胞表面硫酸乙酰肝素 病毒学杂志 1998年 72年 9 7349年 7356年 2 - s2.0 - 0031849754 拉斯帝格 年代。 杰克逊 a . C。 哈恩 c·S。 格里芬 d E。 施特劳斯 e . G。 施特劳斯 j . H。 老鼠辛德毕斯病毒神经毒性的分子基础 病毒学杂志 1988年 62年 7 2329年 2336年 2 - s2.0 - 0023886294 吊杆 s . C。 杨 a . L。 莫里斯 s . L。 疫苗接种与辛德毕斯virus-based表达抗原DNA疫苗85 b诱发保护性免疫对抗结核分枝杆菌 感染和免疫 2005年 73年 11 7727年 7735年 2 - s2.0 - 27744442684 10.1128 / iai.73.11.7727 - 7735.2005 黄 h . V。 辛德毕斯病毒载体在动物细胞表达 当前生物技术的观点 1996年 7 5 531年 535年 2 - s2.0 - 0030272123 10.1016 / s0958 - 1669 (96) 80057 - 7 李 C。 顾 Y。 安德雷德 D。 刘 Y。 大肠癌细胞辛德毕斯病毒感染的易感性 实验治疗学和肿瘤学杂志》上 2009年 8 2 167年 175年 2 - s2.0 - 74049119455 曾 j . C。 莱文 B。 Hurtado 一个。 绮 H。 德卡斯特罗 i . P。 吉梅内斯 M。 Shamamian P。 金 R。 诺维克 r P。 浅色 一个。 Meruelo D。 辛德毕斯病毒载体系统肿瘤攻击和杀害 自然生物技术 2004年 22 1 70年 77年 2 - s2.0 - 0346725931 10.1038 / nbt917 纳尔逊 s R。 阿里 m . Y。 Trybus k . M。 Warshaw d . M。 随机漫步的前进的,量子dot-labeled肌凝蛋白Va分子COS-7肌动蛋白皮质内的细胞 生物物理期刊 2009年 97年 2 509年 518年 2 - s2.0 - 68949125193 10.1016 / j.bpj.2009.04.052 Pinaud F。 Michalet X。 Bentolila l。 -蔡 j . M。 Doose 年代。 李 J·J。 艾耶 G。 维斯 年代。 与量子点荧光成像技术的进步bio-probes 生物材料 2006年 27 9 1679年 1687年 2 - s2.0 - 28744446857 10.1016 / j.biomaterials.2005.11.018 米歇尔 E。 Giannone G。 ·曲克 D。 Thoumine O。 Neurexin / neuroligin交互动力学特征通过计算单个细胞表面附着的量子点 生物物理期刊 2009年 97年 2 480年 489年 2 - s2.0 - 68949144878 10.1016 / j.bpj.2009.04.044 DeTulleo l 科切豪斯 T。 网格蛋白的内吞作用的病毒感染的途径 EMBO杂志 1998年 17 16 4585年 4593年 2 - s2.0 - 0032541402 10.1093 / emboj / 17.16.4585 梁 Y。 Shilagard T。 肖 s Y。 斯奈德 N。 刘 D。 Cicalese博士率领 l 维斯 H。 巴尔加斯 G。 柠檬 s M。 可视化丙型肝炎病毒感染人类肝脏通过双光子显微镜 胃肠病学 2009年 137年 4 1448年 1458年 2 - s2.0 - 70349423481 10.1053 / j.gastro.2009.07.050 Kukura P。 大口水壶 H。 穆勒 C。 Renn 一个。 Helenius 一个。 Sandoghdar V。 高速纳米跟踪位置和姿态的一个病毒 自然方法 2009年 6 12 923年 927年 2 - s2.0 - 73349130473 10.1038 / nmeth.1395 的大作 H。 Higuchi H。 Wanatabe t M。 Ohuchi N。 体内的实时跟踪单个量子点与单克隆抗体anti-HER2共轭肿瘤的老鼠 癌症研究 2007年 67年 3 1138年 1144年 2 - s2.0 - 33847018888 10.1158 / 0008 - 5472. - 06 - 1185 Vonderheit 一个。 Helenius 一个。 Rab7 associates早期核内体调解排序和运输Semliki森林病毒核内体 公共科学图书馆生物学 2005年 3 7 1225年 1238年 2 - s2.0 - 22744447453 10.1371 / journal.pbio.0030233