文摘

人为的hiv - 1 enhancer-binding肽延长连续9个精氨酸残基的糖和核本地化n端信号SV40大T抗原。64 -残留产生的合成肽被发现绑定到两个hiv - 1长末端重复的增强剂,穿过等离子体膜和人类细胞的核膜,和抑制hiv - 1 enhancer-controlled绿色荧光蛋白报告基因的表达。此外,由这个肽抑制hiv - 1复制HIV-1-infected CEM-GFP细胞所揭示的hiv - 1 p24 ELISA和实时rt - pcr的hiv - 1 RNA。快速吸收这个细胞内稳定和抑制肽进入细胞意味着这种肽可能有可能削弱hiv - 1复制在活的有机体内。

1。介绍

hiv - 1感染的治疗已经取得了相当大的进展。然而,当前所有治疗方法一直受到病毒抗性突变,不受欢迎的副作用,和高处理成本1]。

为抑制hiv - 1的复制,因此,额外的概念粒子组装,逃脱了。

干扰hiv - 1感染的一种方法在早期是阻止病毒进入。Enfuvirtide,合成肽已经在临床使用相应的守恒extramembranous序列643 - 678的hiv - 1包膜糖蛋白gp41,发现防止gp41必要的构象变化与CD4 hiv - 1融合+细胞(2,3]。其他方法包括建设一个高度殖民大肠杆菌(大肠杆菌)HIV - 1菌株分泌gp41-hemolysin阻止艾滋病毒与靶细胞融合(4),使用一个跨链二硫化bond-stabilized三聚物的45-residue融合肽(5,6)抑制大量艾滋病毒分离株的融合与靶细胞的抑制HIV - 1感染的CD4细胞+T细胞通过微生物HSP70 (7]。

同样,人类单克隆5 h / I1-BMV-D5单链可变区片段(scFv抗体)选自phage-displayed库已被证明与氨基七个重复区域gp41从而抑制融合中间体的形成在体外和多样化的临床分离株的复制的hiv - 1 (8]。与猴在猕猴,防止阴道挑战人类免疫缺陷病毒是通过阴道分娩交付virus-cell融合抑制剂;此外,两种小分子抑制剂结合病毒和细胞gp120 CCR5,分别,防止gp120受体结合和53-residue肽含有c端七个重复区域gp41抑制了gp41-mediated virus-cell融合(9]。

然而,hiv - 1颗粒只有弱交互融合抑制剂仍将能够进入靶细胞(10]。这需要其他策略来抑制病毒复制后,病毒已经入侵目标细胞。这些包括高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)治疗(1),胞内表达反义基因打靶的hiv - 1信封(11)和三Sp1的sequence-specific针对网站的5′有序的末端重复(LTR)的hiv - 1工程锌指12]。在目前的工作中,我们设计了一个64年的残留蛋白质穿过等离子体和核细胞膜,认识到两个高度保守的NF -κB结合位点(增强剂)的5′ltr的hiv - 1和hiv - 1作为一个强有力的抑制剂在感染细胞的复制。

这个合成肽(R64,图64 -残渣1)中,从N - C -末端,核的定位信号SV40大T抗原识别螺旋434噬菌体的抑制因子(残留28日至36)在两端的两份带正电的抑制因子序列37至44岁和9个精氨酸残基(参数9)质膜传导(13]。434抑制因子的识别螺旋,因为两个增强子的核苷酸序列5′ltr地区hiv - 1 repressor-binding序列完全相同的434运营商,和短版R64缺少参数9(14]或参数9和NLS序列(R42 [14,15])已经显示绑定到合成增强地区的hiv - 1 LTR DNA,从而取代p50 NF -亚基κB两个结合位点的LTR和抑制hiv - 1 enhancer-driven转录(14,15]。

(一)
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图1
相关肽和DNA序列。(一)42-residue hiv - 1 enhancer-binding肽(R42)来自434年的dna结合域抑制因子。识别螺旋(a)、(b)和(c)是强调。(b) 64 -残渣hiv - 1 enhancer-binding肽通过扩展的R42核SV40大T抗原的定位信号和nona-arginine (NLS和参数9强调)。(c) 62 -残渣hiv - 1 enhancer-binding肽通过扩展R42的n端两偶核定位信号的无毛(强调)拥抱蛋白质转导domain-5 (PTD-5,斜体)。(d) 20-residue控制肽只包含NLS SV40大T抗原和参数9两个甘氨酸残基(NLS和参数9强调)。(e) 70 - bp hiv - 1 LTR DNA组成职位137−−68。两个相同的NF -κB-binding序列(增强)展露无遗。DNA (f) 51-bp竞争对手缺乏两个增强剂,否则它在很大程度上是相同的70 - bp hiv - 1 LTR DNA (e)所示。

尽管他们潜在的免疫原性,治疗性多肽可能发挥重要作用如图所示的应用程序在治疗前列腺癌的小鼠(16),在hiv - 1感染的预防2,3],霍奇金病的诱导tumor-gene——(WT1)特殊技能与合成回归人类癌症细胞毒性T淋巴细胞(17]。由于共价链接oligoarginine和相关序列有效调解膜传导的多肽18,19],R64和类似肽可能是非常有用的在一个组合对hiv - 1感染的治疗目标NF -κB-binding hiv - 1的网站增强剂(20.]。

2。材料和方法

2.1。多肽的合成和纯化

20到64残留长肽固相法合成了(22,23在应用生物系统公司430多肽合成仪使用Fmoc化学和制造商的指示。去和乳沟树脂后,他们在安捷伦1100液相色谱纯化系统配备一个autosampler,二极管阵列检测器和一个Interchim Uptisphere C18柱(250×4.6毫米)。肽与溶剂筛选了梯度从0.1%三氟乙酸(组织)乙腈0.075%的组织。肽的纯度证明了离子喷雾质谱在MALDI-TOF力量光谱仪及其浓度由定量氨基酸分析Biochrom 20个氨基酸分析仪。

所有合成oligodeoxyribonucleotides买来MicroSynth (Balgach、瑞士)。

2.2。乐队将化验R64-HIV LTR交互

化验后标准程序(21,25]。结合反应,表现在一式三份相同的结果,包含R64(图1 (b)),合成5′端32P-labeled 70 -碱基对(bp) oligodeoxyribonucleotide(图1 (e))封闭两NF -κB-binding序列(增强剂,突显出残留),合成51-bp竞争者DNA(图1 (f))在20μL磷酸盐缓冲剂,pH值7.4 [26]。孵化后30分钟在37°C,样本10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。干燥后,分析了凝胶的放射性phosphoimaging(图2)。


图2
竞争乐队转变化验R64之间的相互作用32P-labeled hiv - 1 LTR DNA(图1 (e))的存在越来越多的DNA标记的竞争对手(图1 (f))。样品(20μL)在50 mM磷酸盐缓冲剂孵化,pH值7.4,在37°C(30分钟21),然后提交到聚丙烯酰胺凝胶电泳在250 V三33毫米,0.75毫米EDTA,调整使用硼酸pH值8.2。R64;通道1 - 4 (8 pmol每个);竞争对手DNA;通道1到4 (1、4.25、8.5,17 pmol resp);DNA标记enhancer-containing DNA(目标);通道1到5 (200 fmol每个)。
2.3。足迹鉴定R64-HIV-1 Enhancer-Binding特异性

艾滋病毒LTR DNA合成(序列图所示3)由-118年到-67年包括两个增强区域(图3垂直酒吧)。标准的足迹程序(27)是修改如下。R64添加到标签截断hiv - 1 LTR DNA和提交的混合凝胶电泳。的乐队R64-DNA复杂的和免费的DNA被切除,和sterically N-7鸟嘌呤碱基的位置在凝胶片用硫酸二甲酯甲基化(28]。洗脱后的凝胶片DNA裂解哌啶(甲基化网站的10%24),形成的碎片被解决通过凝胶电泳缓冲包含90毫米Tris-borate, pH值8.3,25毫米EDTA。干凝胶分析phospho-imaging(图3)。同时,标记DNA的测序的方法之一,吉尔伯特24)允许本地化R64的结合位点。碳足迹分析进行了两次;获得的模式是很好的协议。


图3
碳足迹分析的特异性R64-HIV-1增强器绑定。两个增强子序列的垂直的酒吧。通道1到5包含1 pmol每个标签的hiv - 1 LTR DNA(职位-118年至-67年),曾被硫酸二甲酯甲基化和裂解哌啶道2 - 5。车道3到5包含R64(50、100年和200年pmol resp。)和竞争对手的DNA (200 pmol /车道)。巷6 G / Maxam-Gilbert测序的乐队(24)的hiv - 1 LTR DNA。G *, hyporeactive G基地。
2.4。hiv - 1 LTR-Controlled在体外转录R64的缺失和存在

OVEC-LTR,质粒用于测试R64在无细胞的活性在体外转录,包含两个NF -κB和三个特异性蛋白1 (Sp1)结合位点(职位-110年至-45年)的hiv - 1 LTR和β球蛋白报告基因(14,29日]。控制,质粒Sp1-OVEC只包含Sp1结合位点和缺乏的前19个碱基对β球蛋白基因(29日]。使用等量的两个质粒(100 ng)和先前描述的协议后14]。RNA提取、净化(30.],S1核酸酶消化在存在标签93 -残渣oligodeoxyribonucleotide [29日,31日](对应位置−18 + 75的编码链β球蛋白的报告基因OVEC-LTR)其次是变性凝胶电泳的消化和phospho-imaging凝胶(图4)。的在体外转录实验进行了一式三份,几乎相同的结果。


图4
凝胶电泳分析R64的影响在体外海拉细胞中转录OVEC-LTR和Sp1-OVEC核提取物(OVEC-LTR:目标质粒含有两个增强剂的hiv - 1 LTR序列和一个β球蛋白报告基因;Sp1-OVEC:控制质粒缺乏增强子序列和第一个19的英国石油公司β球蛋白报告基因)。转录实验包含两个质粒,100 ng,越来越多的R64进行描述(14]。每个实验总容积为25μl .成绩单与标记合成杂化93 - mer DNA, -18 + 75的对应位置β球蛋白报告基因,然后用核酸酶治疗S1。凝胶电泳的结果摘要提交Tris-borate (89 mM, pH值7.5),EDTA(2毫米),尿素(7米)。这种凝胶显示获得的未消化的RNA / DNA混合动力车。巷1:Sp1-OVEC;道2到6:OVEC-LTR + Sp1-OVEC的0,16岁,32岁,分别为65和97.5 pmol R64。
2.5。分析R64的胞内定位

CHO-K1细胞(~ 105含不同浓度的细胞)R64孵化在37°C 24 h。细胞然后收获处理低盐裂解缓冲(包含20毫米氯化钾)在4°C 5分钟。胞质提取离心获得的。颗粒与高盐溶解孵化缓冲区(包含1.2氯化钾)在4°C 5分钟,用近2分钟给核提取。两种提取物进行了分析标准电泳(32和免疫印迹33),发现R64 colorimetrically添加多克隆兔anti-R42抗体后,孵化与山羊anti-rabbit IgG-conjugated碱性磷酸酶,氯化和添加nitrotetrazolium蓝色的p-toluidine盐5-bromo-4-chloro-3-indolyl磷酸盐基质(σ)13,34)(图5)。实验研究的细胞内定位R64执行两次了几乎相同的结果。


图5
免疫印迹的胞质及核提取物R64-containing CHO-K1细胞。R64检测使用兔子anti-R42抗血清,碱性phosphatase-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白,和磷酸磷酸酶底物5-bromo-4-chloro-3-indolyl。巷1:分子质量标记;巷2:合成R64(计算分子质量7611 Da;500 ng应用);车道3和7:核和胞质细胞提取控制;1.3核和胞质提取细胞孵化μM R64(车道4和8),1.7μM R64(车道5和9),2.3μ分别M R64(车道6和10)。
2.6。孵化的R64(图1 (b))和R42(图1(一))与Phorbol-12-Myristate-13-Acetate (PMA)刺激CEM-GFP细胞

CEM-GFP细胞(35)包含一个质粒编码绿色荧光蛋白(GFP)报告基因在hiv - 1 LTR控制之下。hiv - 1和hiv - 1 PMA刺激通过激活NF - enhancer-linked转录κB导致高水平的表达绿色荧光蛋白(36,37]。CEM-GFP细胞保持在2毫升rpmi - 1640中补充了100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素,200毫米谷酰胺,24毫米碳酸氢钠,heat-inactivated 10%胎牛血清(技术)24-well培养板24 h。然后PMA (200 ng / mL)和越来越多的肽R64 R42添加每口井的观察和荧光的变化在一个尼康Diaphot 300使用485纳米荧光显微镜激发滤光片和535海里排放过滤器(图6)。


图6
CEM-GFP细胞的荧光显微镜。(一)如果细胞;0.32 (b) CEM-GFP细胞刺激μ在37°C M PMA 16 h;(c, d, e) CEM-GFP细胞刺激与0.32μM PMA的4μ米,8μM, 12μM R42分别在37°C 6 h;(f, g, h)治疗CEM-GFP细胞为0.32μ2.6 M PMA的存在μ5.25米,μM和7.9μM R64分别为6小时37°C的数量大幅减少细胞表达绿色荧光蛋白基因;箭头指向代表的细胞GFP基因沉默。

48小时后,细胞growth-inhibitory肽的影响和PMA评估使用3 - 4,5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)试验38]。

2.7。孵化的肽R64、R62 R42,甜HIV-1-Infected CEM-GFP细胞

R62不同于R64只有在细胞膜信号转导的安排;R62(图1 (c))包含两个核本地化信号(NLS)和等离子体膜蛋白转导域公司(PTD)在肽链的n端。甜(图1 (d)),20-residue控制肽,由R64 NLS和输配电序列,连接两个甘氨酸残基。

hiv - 1股准备从人类文化H9 lymphoblastoid细胞(NIH艾滋病研究和参考试剂程序)保存在完全培养基(rpmi - 1640补充2毫米谷酰胺,24毫米碳酸氢钠,heat-inactivated 10%胎牛血清(技术))和慢性感染hiv - 1菌株3 B (hiv - 1希望)。HIV-1-containing上层清液过滤是0.2μm过滤器,整除,储存在−70°C到使用。

人类CEM-GFP细胞在一个指数增长阶段之前在50毫升颗粒状锥形管(Falcon)给~ 9 。 6 × 1 0 6 每管细胞。

股票的hiv - 1希望获得从人类H9 T细胞的上清液稀释1:5完全培养基,浓度之前确定给连续的艾滋病毒复制(数据未显示)。CEM-GFP细胞颗粒与1 ml孵化稀释hiv - 1轻轻地resuspended整除。孵化后37°C 2 h,病毒被过剩,以及与rpmi - 1640细胞被彻底清洗介质。

细胞悬浮在48毫升的完全培养基的浓度 2 × 1 0 5 细胞每毫升,2毫升整除HIV-1-infected或mock-infected细胞转移到24-well猎鹰细胞培养板包含 4 × 1 0 5 细胞每口井。肽R64 R62 R42,甜被添加在复制到井最终浓度为0,0.1,0.25,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,7μM,分别。

在不同的时间点,hiv - 1 p24核心蛋白在胞外文化的上层清液井是由定量ELISA如前所述10]。简单,重复的上层清液(25μL)的文化HIV-1-infected, peptide-treated CEM-GFP细胞稀释1:6与缓冲,然后添加到微型板块鼠单克隆抗体anti-p24井预镀。其次是添加生物素化的人类多克隆抗体和孵化streptavidin-horseradish anti-p24过氧化物酶共轭。额外的结合位点streptavidin-horseradish过氧化物酶,由治疗的井biotinyl-tyramide [40),反应streptavidin-horseradish稀溶液的过氧化物酶作为推荐的制造商。最后,o-phenylene二胺基质添加和由此产生的黄色测量spectrophotometrically 490海里。p24量化是通过比较样品的吸光度与浓度标准曲线得到p24 0.17 pg / mL - 10 ng / mL。

确定hiv - 1 RNA水平文化上层清液,实时定量rt - pcr gag地区特定的hiv - 1进行描述(411)使用μL通过文化的上层清液源于HIV-1-infected, peptide-treated CEM-GFP细胞,或1μL RNA的hiv - 1的标准稀释系列从上层的获得希望来华的人类H9 lymphoblastoid细胞和校准使用Amplicor(罗氏)定量rt - pcr检测。

经过八天的孵化与肽HIV-1-infected细胞,可能peptide-derived细胞毒性效应评估使用MTT测定[38与以下修改)。感染CEM-GFP存在与否的细胞生长肽resuspended,重复100年μL整除转移到一个96 - ELISA板(Nunc)和10μL的肝癌和5毫克/毫升PBS溶液添加到每个。四个小时的潜伏期后,100年μL溶解溶液(10% SDS, 0.5% Triton x - 100, 0.01 M盐酸)添加/和板进一步孵化一夜之间在37°C。最后吸收测量的ELISA板读者(TecScan)与背景减法在630 nm 570海里。

3所示。结果与讨论

我们先前已经表明,42-residue肽来源于434年噬菌体的dna结合域阻遏绑定专门增强地区的hiv - 1长末端重复和压抑在体外hiv - 1的转录enhancer-containing质粒(14]。在目前的工作我们已经证明,肽是活跃在HIV-1-infected细胞后被蛋白质转导域扩展跨质膜和核本地化信号进入细胞核。最好的结果肽R64(图1 (b))。

3.1。DNA结合特异性R64和R62两个hiv - 1 LTR NF -κB结合位点

绑定R64特异性和R62由竞争决定乐队转变和足迹化验。乐队转变化验的R64(图2)表明,在实验条件选择,一个大约100倍摩尔超过竞争对手DNA(图1 (f))是需要取代的肽enhancer-containing hiv - 1 LTR目标DNA(图1 (e))。

乐队转变化验的结果表现在R62非常相似(数据没有显示)。

足迹分析是一个过程(42]protein-DNA复合物和自由DNA是首先由乐队转移电泳,然后处理DNA-cleaving试剂在凝胶矩阵。由此产生的DNA片段被筛选了凝胶电泳凝胶和解决。在目前的工作,electrophoretically分离的乐队R64-HIV-1 LTR DNA复杂和免费hiv - 1 LTR DNA切除凝胶和乐队的DNA处理硫酸二甲酯,筛选了凝胶片,然后用哌啶(孵化24,28]。通过电泳分离获得的DNA片段测序凝胶(图3)。结果表明,两种NF - G基地κB结合位点(增强剂,以垂直酒吧)的hiv - 1 LTR在很大程度上受甲基化在R64(图3道3到5)表明R64像R4226),可能与NF -竞争κ对hiv - 1 B增强器绑定,从而抑制enhancer-controlled转录。这证实了以下实验。

3.2。在体外转录抑制

海拉细胞中核提取物,R64抑制hiv - 1的报告基因的转录enhancer-containing质粒(OVEC-LTR)更强比这个基因的转录控制缺乏hiv - 1的质粒剂地区(Sp1-OVEC) [14,29日)(图4道5和6),R62 R64大体一致,除了一个氨基端两偶核本地化信号(43)包含蛋白质转导域(图1 (c)),没有特定的抑制hiv - 1 enhancer-controlled转录比R64尽管它降低净正电荷(25 +和+ 28日数据未显示)。

3.3。分析R64的胞内定位

R64被证明存在于胞质和核提取R64-incubated CHO-K1细胞后用双抗体检测电泳和免疫印迹提取(图5)。R64时检测其浓度在孵化混合物(~ 105细胞/ 3毫升介质)高于1.3μm . R64的分钟增加核提取物是从1.7μ米至2.3μM R64孵化混合物(图5道5和6)表明,核内蛋白导入“受体”(44)几乎是饱和为1.7μM R64孵化的混合物,细胞内过剩R64仍在细胞溶质(图5道9和10)。

3.4。R64抑制hiv - 1 PMA-Stimulated Enhancer-Controlled转录

R64后显示出现在的核提取R64-incubated CHO-K1细胞(图5),它是测试这种肽是否活跃于完整CEM-GFP细胞(35含有一个hiv - 1 LTR-controlled GFP报告基因的表达被刺激,通过激活NF -κhiv - 1 B, TNF -α,interleukin-1、脂多糖和PMA (36,37,45]。

CEM-GFP细胞(大约105细胞2毫升介质/)孵化了PMA (200 ng),模仿hiv - 1感染,越来越多(20到60μ分别R42 g)和R64。荧光显微法表明,在实验条件下应用,PMA刺激GFP基因表达强烈(数字6(一)和6(b))。添加R42缺乏质膜传导和核的定位信号R64很少(如果有的话)有影响的荧光PMA-stimulated CEM-GFP细胞浓度的6μ(数据6(c),6(d)和6(e))。然而,R64扑灭这些细胞的荧光几乎完全浓度约为4μ(数据6(f),6(g)和6(h)),因为它能够进入细胞核和抑制hiv - 1 enhancer-controlled GFP报告基因的表达。

细胞毒性的PMA和增加浓度的R42 R64并没有观察到使用MTT测定[38]。

3.5。R64抑制hiv - 1在CEM-GFP细胞复制

R64抑制感染的hiv - 1复制CEM-GFP细胞浓度的方式量化分析如图所示的hiv - 1 p24和hiv - 1的呕吐RNA。

(描述的hiv - 1 p24 ELISA进行10]。在图7,获得的结果与R64 R62(图1 (c)),R42(图1(一)),和甜(图1 (d),包括只有核和质膜的转导信号R64)进行了比较。在鹿的存在明显的p24生产μM R64(图7(一))开始大约6天之后添加肽除了包含3.5和7的样本μhiv - 1 M R64分别,p24仍接近于零的水平。p24在鹿的生产μM R62 R42和甜(数字7 (b),7 (c)和7 (d))开始统一后大约5天的孵化,然后由这些玫瑰对数没有有效抑制肽。

(一)
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图7
评估文化上层的艾滋病毒感染的hiv - 1 p24水平CEM-GFP细胞在八天的孵化与肽浓度增加R64 (a), R62 (b), R42 (c)和甜(d)在感染后第一天开始。两个独立的图中显示结果在体外感染试验平均值±标准差。

实时rt - pcr实验(41)表明,hiv - 1 RNA复制的数量每毫升上层清液感染细胞下降了近三个数量级的7μM R64(图9(一个)),但仍然不断高7的存在μM R62 R42(数字或甜的感染实验9 (b),9 (c)和9 (d))。在R64最大浓度,hiv - 1复制抑制超过300倍。

图9也表明生长的抑制程度HIV-1-infected CEM-GFP在存在R64, R62,分别R42和甜。MTT试验用于此目的的措施新陈代谢活跃,可行的细胞。20%的最大抑制R64的存在(图中观察到9(一个))表明,80%的细胞新陈代谢仍活跃和可行的。的损失只有20%的这些细胞的代谢能力不能超过300倍的抑制hiv - 1的复制与R64观察。

R62,这不同于R64只有在序列和安排核本地化和质膜传导信号,没有抗病毒活性HIV-1-infected CEM-GFP细胞。从早期的研究我们知道R42无法通过质膜,因此在这些化验是不活跃的。甜大概到达细胞核但没有enhancer-binding特异性序列。

在数据8和10,通过使用CalcuSyn 1.1 (Biosoft)软件包[39],median-effect情节来自量效曲线为R64获得抗逆转录病毒复合使用median-effect方程: = / , ( 1 ) 在哪里 的剂量, 是50%所需的剂量效应, 是影响分数的剂量, 是影响分数吗 是一个剂量的sigmoidicity系数曲线。median-effect剂量( )是用于描述有效剂量(ED的50%50),在这种情况下,这个ED50对应于集成电路50(50%抑制浓度)的药物需要阻止艾滋病毒50%的正常水平复制体外。


图8
50%的有效剂量测定肽R64基于R64 hiv - 1浓度p24水平。使用CalcuSyn 1.1软件包(Biosoft) [39],median-effect阴谋是来源于在感染后的第8天使用获得的量效曲线方程: / = ( / ) 在哪里 的剂量, 是50%所需的剂量效应, 是影响分数的剂量, 是影响分数, 是一个系数sigmoidicity的量效曲线,然后呢 是相关系数( = 0 。 4 9 3 μ米, = 0 。 6 8 4 9 , = − 0 。 9 8 1 )。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图9
评估hiv - 1 RNA水平(□)和细胞growth-inhibitory活动(●)CEM-GFP文化上层清液的细胞在感染hiv - 1后第八天,孵化肽浓度增加R64 (a), R62 (b), R42 (c)和甜(d)。肽被添加在感染后的第一天,其浓度范围从0.1μM - 7μm .抑制增长使用MTT试验评估。两个独立的图中显示结果在体外感染试验平均值±标准差。

图10
50%的有效剂量测定肽R64基于R64浓度hiv - 1 RNA水平。使用CalcuSyn 1.1软件包(Biosoft) [39],median-effect阴谋是来源于在感染后的第8天使用获得的量效曲线方程: / = ( / ) 在哪里 的剂量, 是50%所需的剂量效应, 是影响分数的剂量, 是影响分数, 是一个系数sigmoidicity的量效曲线,然后呢 是相关系数( = 0 。 5 8 8 μ米, = 0 。 8 2 4 9 , = − 1 。 3 2 0 )。

R64肽的滴定HIV-1-infected CEM-GFP细胞分析p24实时rt - pcr、ELISA和一个管抑制R64 50%浓度在0.588和0.493之间μM,分别。

总之,基于以前的工作(14,15,18,26),我们设计了一种肽(R64,图64 -残渣1 (b))包含一个中心hiv - 1增强器识别螺旋和终端核本地化和质膜转导信号。这个肽绑定到两个hiv - 1和NF -增强剂,因此竞争κB, hiv - 1的主要催化剂复制(46,47]。与R64 CHO-K1细胞孵化后,肽可以本地化的这些细胞的胞质及核。CEM-GFP细胞,抑制hiv - 1的enhancer-driven表达GFP基因后PMA刺激和抑制病毒转录和复制后hiv - 1感染浓度的方式。最有可能的是,R64流离失所的NF -κ从两个结合位点在hiv - 1 B LTR尽管NF -的存在κ在许多细胞基因(B结合位点48]。一个人工肽(R62,图62 -残渣1 (c)),包含两个膜传导信号的n端但与R64否则完全相同,也绑定到hiv - 1 LTR增强器区域。然而,它是活跃的只有读在体外转录分析,不抑制hiv - 1感染细胞的复制。

在人类疾病治疗肽具有重要的应用,如预防hiv - 1感染[2,3),诱导肿瘤特异性细胞毒性t淋巴球[17),治疗性疫苗(49]。R64似乎完成的一些需求作为一个治疗性多肽:西方墨迹的胞质及核提取物R64-incubated CHO-K1细胞(图5)没有显示出碎片,表明肽的稳定性对胞内蛋白水解降解;R64病毒复制减少了几乎三个数量级,没有细胞毒性的浓度7μ米的媒介HIV-1-infected CEM-GFP细胞(图9);和吸收R64进入细胞(图似乎快6),降低了这种肽的免疫原性潜力。

缩写

hiv - 1: 人类免疫缺陷病毒1型
LTR: 长末端重复
R42: 人工42-residue hiv - 1 enhancer-binding肽
NLS: 核定位信号
输配电: 蛋白质转导域
绿色荧光蛋白: 绿色荧光蛋白
NF -κB: 核转录因子κB
Sp1: 特异性蛋白1
PMA: Phorbol-12-myristate-13-acetate
麻省理工: 3 - 4,5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴离子。
英国石油公司: 碱基对。

确认

本文作者奉献的记忆r·b·梅里菲尔德教授发明了多肽固相合成的研究进展。他们感谢z . Tomasik博士实验援助,w·沙夫纳教授OVEC质粒,f博士Bootz准备anti-R42抗血清,和苏黎世的坎顿和Mesta基金会的慷慨的财政支持。