人冠状病毒冠状病毒，NL63和冠状病毒-HKU1住院小儿急性呼吸道感染在北京，中国

摘要

人类冠状病毒(HCoVs) HCoV-NL63和HCoV-HKU1是最近发现的两种广泛传播并与急性呼吸道感染(ARI)相关的冠状病毒。我们在北京儿童医院2008年5月至2010年3月收集的<7.75岁ARI患者标本中检测到HCoV-NL63和HCoV-HKU1。382个标本中，32个标本(8.4%)和57个标本(14.9%)分别经实时RT-PCR检测HCoV-NL63和HCoV-HKU1阳性。使用Luminex xTAG RVP快速试剂盒显示，同时感染呼吸道合胞病毒和副流感病毒3的患者在两种病毒感染的患者中都很常见。在hcov - hku1感染患者中，主要临床症状为咳嗽、发热和咳痰。在hcov - nl63感染患者中，他们是咳嗽、发烧和流鼻涕。系统发育研究表明，HCoV-HKU1核蛋白基因相对于NCBI参考序列较为保守，而HCoV-NL63的1ab基因变异较多。

1.介绍

在2003年SARS冠状病毒引起的严重急性呼吸系统综合症爆发之前，人类冠状病毒(HCoVs)并没有被认为是有害的呼吸系统病原体。SARS的爆发重新引起了人们对该病毒家族的兴趣，并导致了另外两种hcov的鉴定，即HCoV-NL63和HCoV-HKU1。HCoV-NL63是I类冠状病毒的一员，2004年在荷兰的一名患有细支气管炎的儿童中首次发现[1]。HCoV-HKU1，一种II类病毒，于2005年在香港一名患有慢性肺部疾病的成人身上发现[2]。现在认识到，这两种病毒有在全球范围内流通，与人类呼吸道感染有关。在中国，几个小组已经证明冠状病毒，NL63和冠状病毒-HKU1的存在作为婴幼儿的潜在的呼吸道病原体和老人[3.- - - - - -5]。然而，关于它们的流行病学和遗传特征，在中国大陆缺乏更精确的数据。在这项研究中,我们筛选HCoV-NL63和HCoV-HKU1在儿童急性呼吸道感染承认北京儿童医院为了更好地理解季节性,这些病毒的流行病学和遗传多样性在城市人口超过2200万。

2。材料和方法

2.1。临床标本

从诊断为肺炎或支气管肺炎且体温高于38°C的住院儿童中总共收集了382例鼻咽吸液(NPAs)。这些儿童于2008年5月至2010年3月(23个月)住进北京儿童医院。所有参与研究的儿童的父母均同意标本采集和检测。这些儿童的年龄中位数为1.1岁(1个月至7.75岁)。在测试前，NPAs被收集到病毒传输介质中，并在- 70℃保存。

2.2。RNA提取和cDNA合成

使用QIAamp MinElute Virus Spin kits (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada)按照制造商的说明提取核酸。cDNA由10个碱基合成μ使用随机六聚体引物(中国大连TaKaRa公司)和上标II逆转录酶(美国加州卡尔斯巴德Invitrogen公司)进行RNA洗脱。

2.3。实时RT-PCR试验

针对两种病毒的N和1ab基因保守区域，开发了两种实时RT-PCR检测方法并同时使用。HCoV-NL63引物和探针序列如下:

NL63-N前引物5 ' -AGGACCTTAAATTCAGACAACGTTCT-3 ';反向引物5 ' - gattacgtttgcgattaccaagt -3 ' [6];TaqMan探针5′-FAM-TAACAGTTTTAGCACCTTCCTTAGCAACCCAAACA-TAMRA-3′。NL63-1ab正向引物5 ' -TGTTGTAGTAGGTGGTTGTGTAACATCT-3 ';反向引物5′-AATTTTTGTGCACCAGTATCAAGTTT-3′;TaqMan探针5 ' - fam - caattgttagtgagaaaatttctgttgga - tamra -3 '7]。

HCoV-HKU1的引物和探针如下:

HKU-1-N正向引物5'-AGTTCCCATTGCTTTCGGAGTA-3';反向引物5'-CCGGCTGTGTCTATACCAATATCC-3';TaqMan的MGB探针，5'-FAM-CCCCTTCTGAAGCAA-MGB-3'[8];hh -1-1ab前引物5 ' - ccattacaagataagagaacaaac -3 ';反向引物5′-TATGTGTGGCGGTTGCTATTATGT-3′;TaqMan探针5 ' -FAM-TTGCATCACCACTGCTAGTACCACCAGG-TAMRA-3 '9]。

为了评估实时RT-PCR检测的敏感性，将N和1ab基因的扩增子分别克隆到pET-9a (QIAGEN)和pGEM-T Easy (Promega Corporation, USA)载体上，然后进行测序体外转录使用T7 RiboMAX表达大尺度RNA生产系统(Promega)。N和1ab基因测定的标准曲线采用连续对数稀释(从10开始)¹到10⁷转录的RNA片段的副本）。检测每个实时RT PCR测定的下限为100个拷贝/ 20 μ的变异系数(CVs)在0.45到1.02%之间()和中间测定CVs在0.68和2.24%之间。

2.4。HCoV-NL63和HCoV-HKU1在临床标本中的检测

样品用于使用的TaqMan RNA到CT 1步盒（Applied Biosystems，USA）和ABI PRISM 7000的TaqMan机（Applied Biosystems公司，USA通过实时RT-PCR冠状-NL63或冠状-HKU1的存在测试)。10⁴N基因拷贝和1ab基因转录本在每次试验中作为阳性对照。扩增条件为48℃15min, 94℃15s 40个循环，60℃15s。对于每个病毒，当C_T所产生的值小于38，认为该标本为阳性。当C_Tvalue were relatively high (38 ≤ C_T<40)，标本被重新检测了两次，如果C_T任何复检的值小于40。

2.5。检测常见呼吸道病毒

所有HCoV-NL63-和hcov - hku1阳性样本均在美国加州Hercules Biorad公司的Biorad Bio-Plex 200悬浮阵列系统上使用luminex xTAG RVP快速测试(luminex Trading, Shanghai, China)检测其他呼吸道病毒。

2.6。系统发育分析

Fifteen sequences (251 nucleotides (nt)) of the HCoV-NL63 replicase polyprotein 1ab gene and five sequences (951 nt) of the HCoV-HKU1 nucleoprotein (N) gene were derived from positive samples using conventional PCR and sequencing and subjected to phylogenetic analysis. Genbank sequences with the highest identity (lowest expect (E) value) in blastn searching were used as references for this analysis, together with common type strain HCoV sequences. Nt sequences AY597011.2, AY56787.2 and DQ415910.1 were used as references for the HCoV-NL63 analysis. Sequences AY567487.2, AY518894.1, DQ445911.1, GU068568.1, DQ846901.1, and EF081296.1 were applied in the HCoV-HKU1 analysis. AF304460, representing the sequence of HCoV-229E, was also included. Multiple sequence alignment was performed with clustalW. Phylogenetic trees were constructed using Neighbor-Joining. Bootstrap values were calculated on 1000 replicates of the aligned data sets.

3.结果

3.1。发病率和临床症状与冠状病毒，NL63和冠状病毒-HKU1感染住院儿童

382例标本中，HCoV-NL63阳性32例(8.4%)，HCoV-HKU1阳性57例(14.9%)。表中总结了这些感染患者的检测和临床资料1。大多数感染HCoV-NL63(65.6%)或HCoV-HKU1(77.2%)的患者在调查时年龄小于1岁。这两种病毒在男性中都更常见(见表)1)。这两种病毒最常见的4种临床症状是咳嗽、发热、流鼻涕和咳痰。然而，在hcov - hku1感染患者中，咳痰是更常见的症状(54.4比25.0%)。不管感染病毒是HCoV-NL63还是HCoV-HKU1，超过80%的儿童入院诊断为肺炎和支气管肺炎。

3.2。冠状病毒，NL63的流行病学和冠状病毒-HKU1感染

从2008年5月到2010年3月底，HCoV-NL63和HCoV-HKU1的季节性分布相似，在从患有呼吸道感染的儿童中采集的样本数量下降时，HCoV-NL63和HCoV-HKU1的活性增强(图2)1)。两种病毒发病高峰发生在2009年的夏天，但不是在2008年，2009年的秋季和冬季也检测到冠状增加-NL63感染，而相比之下，2008年的时候只有病例少数在冬季得到了承认。相似的分布发生了冠状-HKU1。

3.3。HCoV-NL63和HCoV-HKU1与其他呼吸道病毒共感染

使用Luminex公司XTAG RVP快速系统冠状病毒阳性标本的测试显示，许多人与其他常见呼吸道病毒混合感染（表2)，尤其是呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感病毒3型。还发现了涉及多个HCoVs的共感染(表2)2)。57例(14.0%)hcov - hku1阳性患者中只有13例，32例(25%)hcov - nl63阳性患者中只有8例对其他呼吸道病毒检测呈阴性。

3.4。HCoV-NL63和HCoV-HKU1菌株的系统发育分析

系统发育分析结果如图所示2。基于N基因分析，冠状病毒-HKU1菌株与参照菌株序列AY597011.1聚类在一起（图2(一个))，但从临床资料和用于分析的对照品中获得的序列数量较低。当分析1ab (replicase)序列时，15株HCoV-NL63在树上分布更广(图)图2（b）)。尽管PCR显示为HCoV-NL63株，但BJET72与分析中使用的任何参考NL63基因都不相关。其他14株集群分成至少3不同的单元组,一个相关EF081296.1 DQ846901.1,最初发现于美国和中国在2007年,第二个接近AY518894.1,发现基因型菌株在荷兰,和第三个接近GU068568,也发现2007年在中国。可能的证据，亚聚类在组2序列可以看到。

4.讨论

HCoV-NL63和HCoV-HKU1感染在呼吸道感染患儿中已有较好的记录，但这些新近发现的病毒的流行病学和临床病程在中国尚未完全阐明。我们的数据表明，HCoV-NL63和HCoV-HKU1在北京住院儿童中存在，并导致显著的发病率。有几个小组报告说，这些病毒可以在急性呼吸道感染患者中检测到[10]，包括居住在香港的中国儿童和成人[3.,4]。我们发现，在23个月期间收集的呼吸样本中，HCoV-NL63和HCoV-HKU1分别存在8.4%和14.9%。这宗个案的检出率较香港及其他国家早前的报告为高[11- - - - - -16]，可能是由于针对N和1AB基因的实时RT-PCR技术的提高的检测灵敏度。

在温带地区，大多数HCoV-NL63感染似乎发生在冬季和早春，包括在加拿大[6,17和法国[18]。在香港，在2002年的春季和夏季检测最冠状病毒，NL63感染，在初夏和秋季的2004- 2005年，并在2005 - 2007年秋季[19]。在本研究中，HCoV-NL63感染在2009年的夏季、秋季和冬季达到高峰，但在2008年的任何时候几乎没有活动。类似地，在温带气候国家，包括美国和意大利，hcov - hku1阳性标本经常在冬季和春季发现[20.- - - - - -22]。我们的数据表明，温带地区HCoV-NL63和HCoV-HKU1的季节性循环与热带地区不同。它是有价值的注意到2008年冬季至2009年春季收集的急性呼吸道感染患者标本比研究期间的其他任何时候都要多，但这两种病毒的感染率在这段时间内相对较低。

HCoV-NL63和HCoV-HKU1是RNA病毒，具有高度的遗传多样性，但亚洲国家对HCoV-NL63分离株序列变异性的研究有限。我们的N基因测序显示，在北京流行的HCoV-HKU1菌株是基因型A病毒，尽管分析的数量很少。HCoV-NL63病毒的1ab基因表现出多样性。然而，还需要对其他基因进行进一步测序，以评估北京地区HCoV-NL63的总体遗传多样性，并确认这些病毒的基因型特异性分配，因为这取决于分析的基因序列[23]。

对多种呼吸道病毒的研究表明，虽然HCoVs发生单次感染，但RSV和副流感病毒3的共感染在HCoV-HKU1-和hcov - nl63阳性患者中都很常见。这使得明确冠状病毒在儿童肺炎或支气管肺炎中的作用变得困难。未来的研究使用实时RT-PCR和连续几年的样本收集将有助于进一步了解这些呼吸道疾病的病原在中国。

致谢

作者感谢澳大利亚北墨尔本维多利亚传染病参考实验室的Chris Birch和Julian Druce在准备论文时给予的帮助。本研究部分由中国国家863计划(2007AA02Z464, 2007AA02Z463)资助，由中澳卫生和艾滋病基金项目(项目编号:(EID07)中国疾病预防控制中心，中国传染病大项目(2009ZX10004-101, 202, 2008ZX10004-001, 002和004)，基因工程和分子病毒学国家重点实验室研究资助。崔丽金、张晨等对本文也有贡献。

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