AV 病毒学的进步 1687 - 8647 1687 - 8639 Hindawi出版公司 129134年 10.1155 / 2011/129134 129134年 研究文章 人类冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1住院急性呼吸道感染患儿在北京,中国 崔 李进 1 张 陈 1 张 停 1 陆 Rou-Jian 1 谢 Zheng-De 2 张 Ling-Lin 2 刘 Chuan-Yan 2 周 Wei-Min 1 阮 李 1 马 Xue-Jun 1 棕褐色 文 1 Rottier Peter j . M。 1 分子病毒学国家重点实验室和基因工程 国家研究所的病毒性疾病控制和预防 中国疾病预防控制中心,北京102206 中国 2 病毒学实验室 北京儿童医院 北京100045年 中国 2011年 29日 06 2011年 2011年 01 12 2010年 01 06 2011年 11 06 2011年 2011年 版权©2011崔李进et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

人类冠状病毒(HCoVs) HCoV-NL63 HCoV-HKU1两个最近发现的冠状病毒广泛传播,与急性呼吸道感染(ARI)相关联。我们发现HCoV-NL63和HCoV-HKU1标本收集从2008年5月到2010年3月从ARI患者年龄< 7.75岁参加北京儿童医院。32(8.4%)和382年57例(14.9%)标本阳性HCoV-NL63 HCoV-HKU1,分别由实时rt - pcr。使用Luminex xTAG RVP快速工具显示,合并感染呼吸道合胞体病毒和副流感病毒3病毒是常见的患者感染了病毒类型。HCoV-HKU1-infected病人的主要临床症状是咳嗽、发烧、咳痰。在HCoV-NL63-infected病人咳嗽、发烧和鼻液溢。系统发育研究表明HCoV-HKU1核蛋白基因相对守恒与NCBI的参考序列相比,虽然HCoV-NL63显示更多的1 ab基因变异。

 1。介绍

之前造成的严重急性呼吸系统综合症爆发SARS冠状病毒是在2003年,人类冠状病毒(HCoVs)没有被认为是有害的呼吸道病原体。SARS的爆发新的兴趣这种病毒家族和鉴定了两个额外的HCoVs, HCoV-NL63 HCoV-HKU1。HCoV-NL63,组的一员我冠状病毒,在毛细支气管炎患儿首次发现于2004年在荷兰( 1]。HCoV-HKU1,一群二世病毒,被发现在一个成年人患有慢性肺疾病(2005年在香港 2]。现在认识到这两种病毒在世界范围内流通,与人类的呼吸道感染。在中国,几组展示了HCoV-NL63和HCoV-HKU1的存在潜在的婴儿和老年人呼吸道病原体( 3- - - - - - 5]。然而,更精确的关于他们的流行病学数据,和遗传特点是缺乏在中国大陆。在这项研究中,我们筛选HCoV-NL63和HCoV-HKU1在儿童急性呼吸道感染承认北京儿童医院为了更好地理解季节性,这些病毒的流行病学和遗传多样性在城市人口超过2200万。

 2。材料和方法 2.1。临床标本

共有382个鼻咽吸入物(npa)收集住院儿童肺炎的诊断或支气管肺炎和体温高于38°C。孩子们承认北京儿童医院2008年5月至2010年3月(23个月以来的时期)。所有儿童的父母提供知情同意参与这项研究的样本收集和测试。孩子们平均年龄为1.1岁(范围1月7.75年)。npa收集到病毒传输介质和存储在测试之前−70°C。

 2.2。RNA提取和互补脱氧核糖核酸的合成

病毒核酸提取使用QIAamp MinElute旋转工具(加拿大安大略省米西索加试剂盒,)根据制造商的指示。10的互补脱氧核糖核酸合成 μL的RNA洗出液使用随机六聚物引物(豆类大连,中国)和逆转录酶标二世(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德表达载体)。

 2.3。实时rt - pcr检测

两个实时rt - pcr检测针对N的保守区域和1 ab基因的病毒都是并行开发和使用。HCoV-NL63的引物和探针序列如下:

NL63-N正向引物5′-AGGACCTTAAATTCAGACAACGTTCT-3′;反向引物5′-GATTACGTTTGCGATTACCAAGACT-3′( 6] ;TaqMan探针5′-FAM-TAACAGTTTTAGCACCTTCCTTAGCAACCCAAACA-TAMRA-3′。NL63-1ab正向引物5′-TGTTGTAGTAGGTGGTTGTGTAACATCT-3′;反向引物5′-AATTTTTGTGCACCAGTATCAAGTTT-3′;TaqMan探针5′-FAM-CAATTGTTAGTGAGAAAATTTCTGTTATGGA-TAMRA 3′( 7]。

的引物和探针HCoV-HKU1如下:

HKU-1-N正向引物5′-AGTTCCCATTGCTTTCGGAGTA-3′;反向引物5′-CCGGCTGTGTCTATACCAATATCC-3′;TaqMan-MGB探针5′-FAM-CCCCTTCTGAAGCAA-MGB-3′( 8];HKU-1-1ab正向引物5′- CCATTACAAGCCATAAGAGAACAAAC-3′;反向引物5′-TATGTGTGGCGGTTGCTATTATGT-3′;TaqMan探针5′-FAM-TTGCATCACCACTGCTAGTACCACCAGG-TAMRA-3′( 9]。

评估实时rt - pcr检测的敏感性,扩增子的N和1 ab基因克隆到pET-9a(试剂盒)和pGEM-T容易(Promega公司(美国)向量,分别紧随其后 在体外转录使用T7 RiboMAX RNA表达大规模生产系统(Promega)。标准曲线的N和1 ab基因化验使用串行日志稀释了(从101到107副本)转录的RNA片段。每个实时RT PCR的检测下限分析100份/ 20 μL, intra-assay变异系数1.02%和0.45之间(CVs) ( n = 3 )和interassay CVs在2.24%和0.68之间。

 2.4。检测HCoV-NL63和HCoV-HKU1在临床标本

标本检测存在HCoV-NL63或HCoV-HKU1实时rt - pcr使用TaqMan RNA-to-CT互译工具包(美国应用生物系统公司)和ABI 7000棱镜TaqMan机(美国应用生物系统公司)。104N基因和1的副本ab基因转录被用作积极在每次运行控制。放大条件48°C,持续15分钟,其次是40 94°C的周期为15秒和60°C 15秒。对于每一个病毒,当CT生成价值低于38岁的标本被认为是积极的。当CT价值是相对较高(38≤CT <40),样品重新测试两次,被认为是积极的,如果CT价值的重新测试还不到40岁。

 2.5。常见呼吸道病毒的检测

所有HCoV-NL63——HCoV-HKU1-positive样本检测其他呼吸道病毒使用luminex xTAG RVP快速测试(luminex交易,中国上海)Biorad Bio-Plex 200(美国加州Biorad,大力神)悬浮阵列系统。

 2.6。系统发育分析

15个序列(251个核苷酸(nt))的HCoV-NL63复制酶多蛋白1 ab基因和五个序列(951元)HCoV-HKU1核蛋白(N)基因来自积极的样本使用常规PCR和测序并进行系统发育分析。基因库身份最高的序列(最低期望(E)值)在blastn搜索被用作参考这一分析,结合常见菌株HCoV序列。Nt序列AY597011.2, AY56787.2 DQ415910.1被用作参考HCoV-NL63分析。序列AY567487.2、AY518894.1 DQ445911.1、GU068568.1 DQ846901.1, EF081296.1 HCoV-HKU1分析应用。AF304460,代表hcov - 229 e的顺序,也包括在内。多重序列比对与clustalW执行。系统发育树构建使用Neighbor-Joining。引导值计算1000复制的对齐的数据集。

 3所示。结果 3.1。发病率和临床症状与HCoV-NL63和HCoV-HKU1感染住院的孩子

检测的382份标本中,32个(8.4%)呈阳性HCoV-NL63 HCoV-HKU1和57例(14.9%)阳性。测试和这些感染患者的临床资料总结了表 1。大多数病人感染HCoV-NL63(65.6%)或HCoV-HKU1(77.2%)小于1岁的时候调查。两种病毒在男性(表更频繁地检测到 1)。两种病毒的4最常见的临床症状是咳嗽、发烧、鼻涕,咳痰。然而,咳痰是HCoV-HKU1-infected更频繁的症状患者(54.4 25.0%)。承认诊断在超过80%的儿童肺炎,支气管肺炎,不论是否感染病毒HCoV-NL63或HCoV-HKU1。

HCoV-NL63和HCoV-HKU1检测儿童急性呼吸道感染382年在北京,中国,2008年5月至2010年3月。年龄,性别,和临床细节列出那些病毒呈阳性。

参数 不。事件中发现382名儿童
测试(%)
NL63 ( n = 32 ) HKU1 ( n = 57 )
年龄(个月)
≤12 21日(65.63) 44 (77.19)
12 - 10 (31.25) 13 (22.81)
36 - 93 1 (3.13) 0
性别
男性 21日(65.63) 43 (75.4)
女 11 (34.37) 14 (24.6)
临床症状
咳嗽 31 (96.89) 56 (98.25)
发烧 24 (75.00) 36 (63.16)
鼻液溢 9 (28.13) 18 (31.58)
吐痰 8 (25.00) 31 (54.39)
呼吸困难 4 (12.50) 8 (14.04)
鼻塞 2 (6.25) 9 (15.79)
喉咙痛 3 (9.38) 2 (3.51)
喘息着说 0 2 (3.51)
承认诊断
支气管肺炎 10 (31.25) 18 (31.58)
肺炎 16 (50.00) 29 (50.88)
支气管炎 4 (12.50) 5 (8.77)
支气管周炎 1 (3.13) 3 (5.26)
不确定性 1 (3.13) 2 (3.51)
3.2。HCoV-NL63和HCoV-HKU1感染的流行病学

HCoV-NL63的季节性分布和HCoV-HKU1从2008年5月到2010年3月底相似,提高活动发生的时候从呼吸道感染患儿采集的样本数量是下降(图 1)。峰值的两种病毒发生在2009年夏天,而不是2008年。增加HCoV-NL63感染也在2009年的秋天和冬天,发现与2008年只有少数病例在冬天。HCoV-HKU1发生了类似的分布。

时间分布HCoV-NL63和HCoV-HKU1感染住院儿童2008年5月至2010年3月。(a)所收集的标本的数量从承认儿童急性呼吸道感染到北京儿童医院;(b)阳性标本的数量和百分比积极为HCoV-NL63月;(c)阳性标本的数量和百分比积极为HCoV-HKU1月。

 3.3。与其他呼吸道病毒合并感染HCoV-NL63和HCoV-HKU1

测试HCoV-positive样品使用Luminex xTAG RVP快速系统显示,许多与其他常见呼吸道病毒(表合并 2),特别是呼吸道合胞体病毒(RSV)和副流感病毒3型病毒。合并感染涉及多个HCoVs也发现(表 2)。只有13 57 (14.0%)HCoV-HKU1-positive 32例(25%)的患者和8 HCoV-NL63-positive病人其他呼吸道病毒检测呈阴性。

与其他呼吸道病毒合并感染HCoV-positive样本。

呼吸道病毒 不。其他呼吸道病毒合并感染
HCoV-HKU1积极, n (%) n = 57 HCoV-NL63积极(%) n = 32
HCoV-HKU1 57 (100.00) 11 (34.38)
HCoV-NL63 11 (19.30) 32 (100.00)
HCoV-OC43 2 (3.51) 2 (6.25)
hcov - 229 e 1 (1.75) 0 (0.00)
甲型流感 4 (7.02) 4 (12.50)
RSV 19 (33.33) 9 (28.13)
副流感病毒1 4 (7.02) 2 (6.25)
副流感病毒2 0 (0.00) 0 (0.00)
副流感病毒3 15 (26.32) 6 (18.75)
副流感病毒4 0 (0.00) 1 (3.13)
腺病毒 0 (0.00) 3 (9.38)
人类metapneumovirus (hMPV) 7 (12.28) 5 (15.63)
没有一个* 13 (14.04) 8 (25.00)

*没有其他病毒被发现在这个测试。

 3.4。系统发育分析HCoV-NL63 HCoV-HKU1菌株

系统发育分析的结果在图所示 2。基于N基因分析,HCoV-HKU1菌株与参考株序列AY597011.1聚集在一起(图 2(一个)的数量),尽管序列来自临床分析中使用的材料和控制很低。的15株HCoV-NL63更广泛分布在树上当1 ab(复制酶序列分析(图) 2 (b))。虽然是一个HCoV-NL63应变通过PCR, BJET72没有与任何参考NL63基因用于分析。其他14株集群分成至少3不同的单元组,一个相关EF081296.1 DQ846901.1,最初发现于美国和中国在2007年,第二个接近AY518894.1,发现基因型菌株在荷兰,和第三个接近GU068568,也发现2007年在中国。可能的证据subclustering组2中可以看到序列。

nt序列的系统发育分析HCoV-HKU1 (a)和HCoV-NL63 (b)。N基因放大的正样本收集在2008年11月和2009年10月之间。树被使用Neighbor-Joining方法构造。当地HCoV菌株由指定BJ表示,从2009年。引导值表示。

 4所示。讨论

感染HCoV-NL63 HCoV-HKU1已经有据可查的儿童呼吸道感染,尽管这些最近的流行病学和临床过程识别病毒在中国尚未完全阐明。我们的数据表明,HCoV-NL63并HCoV-HKU1存在于孩子在北京住院,导致重大的发病率。几组报道,这些病毒能被探测到的患者的急性呼吸道感染( 10),包括在中国的儿童和成人在香港生活( 3, 4]。我们发现HCoV-NL63和HCoV-HKU1出现在8.4%和14.9%,分别呼吸道样本收集了23个月以来的时间。这个检出率高于先前的报道来自香港和其他国家( 11- - - - - - 16),可能由于增加检测灵敏度的实时rt - pcr技术针对N和1 ab基因。

在温带气候,大多数HCoV-NL63感染似乎发生在冬季和早春,包括在加拿大 6, 17)和法国( 18]。在香港,大多数HCoV-NL63感染被发现在2002年春季和夏季,夏季和秋季初的2004 - 2005年和2005 - 2007年的秋天( 19]。在目前的研究中,HCoV-NL63感染高峰在夏天,秋天,和2009年的冬天,但是在2008年几乎没有活动在任何时间。同样,HCoV-HKU1-positive标本被发现经常在冬天春天季节温带气候的国家,包括美国和意大利( 20.- - - - - - 22]。我们的数据表明,季节性循环HCoV-NL63和HCoV-HKU1温带地区是不同的,发生在热带地区。它是 有价值的注意更多的ARI患者采集了标本在冬季的2008年至2009年春月的比其他任何时候都在研究过程中,但这两种病毒的感染率相对较低。

RNA病毒,HCoV-NL63和HCoV-HKU1高度的遗传多样性,尽管研究序列变异性HCoV-NL63隔离在亚洲国家是有限的。N基因测序表明HCoV-HKU1压力循环在北京基因型病毒,尽管数字分析是小。1 ab基因HCoV-NL63病毒显示更多的多样性。然而,需要进一步的其他基因的测序,使评估的总体遗传多样性HCoV-NL63在北京和确认genotype-specific分配这些病毒,因为这取决于基因序列分析( 23]。

多种呼吸道病毒的研究表明,尽管单一感染HCoVs发生,合并感染与RSV病毒,副流感病毒3 HCoV-HKU1——和HCoV-NL63-positive患者中很常见。这使得很难阐明冠状病毒的作用在儿童肺炎或支气管肺炎。未来的研究使用实时rt - pcr和样品收集在连续数年将有助于提供进一步洞察这些病原微生物的呼吸系统疾病。

 确认

作者感谢Chris桦树和朱利安Druce维多利亚传染病参考实验室,北墨尔本,澳大利亚,准备论文时为他们的援助。本研究支持中国国家863计划的一部分(2007 aa02z464 2007 aa02z463),通过提供的一笔赠款资助设施中澳卫生与艾滋病项目(项目编号EID07)由中国疾病控制和预防中心以及中国规模庞大的传染病(2009 zx10004 - 101、202、2008 zx10004 - 001、002和004)和格兰特研究为基因工程和分子病毒学国家重点实验室。李进崔,陈张同样贡献本文。

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