Tsc2Haploinsufficiency有限影响胎儿大脑细胞因子水平在妊娠免疫激活

文摘

TSC特异表达/ mTOR信号可能发挥致病的作用形式的自闭症症候群的,如自闭症与结节性硬化症,一种遗传性疾病引起的杂合的TSC1或TSC2突变。环境风险因素,如妊娠病毒性感染,可能,在某些情况下,还有助于自闭症及相关神经精神障碍的发病机制。我们最近发现一个杂合的Tsc2突变和保利我:C模型的孕产妇免疫激活(MIA)交互式地扰乱胎儿发育和成年小鼠的社会行为,表明这些因素聚集在共享的途径。TSC / mTOR信号调制的免疫反应中起着重要的作用,提高的可能性,米娅是造成的损害更大Tsc2^{+ /−}比野生型胎儿因为加剧了免疫应答的突变体。这里,细胞因子抗体阵列是用来测量相对胎儿大脑中的细胞因子含量,在米娅和胎盘。细胞因子诱导的妊娠聚我:C但是没有明显的调节作用Tsc2haploinsufficiency。数据表明细胞因子暴露在米娅是可比的Tsc2haploinsufficient和野生型控制胎儿,这表明下游分子和细胞过程可能占的互动效应Tsc2haploinsufficiency和米娅。

1。介绍

mTOR特异表达信号和改变蛋白质合成是成为常见的主题在自闭症的生物学1- - - - - -3]。简而言之,杂合的突变TSC1或TSC2基因导致结节性硬化症,一种多系统疾病,与自闭症有关在20 - 60%的情况下(4- - - - - -6]。此外,突变基因上游监管者PTEN和NF1的编码,以及下游效应器eIF4E,与孤独症(7- - - - - -9]。此外,脆性X综合征,一个单基因疾病,调节mRNA翻译是摄动(1),是与自闭症有关11]。这些数据都突出了mTOR途径和蛋白质合成自闭症障碍的发病机理的一个重要主题。

除了遗传因素外,环境风险因素也可能导致自闭症谱系障碍的发病机制。至少有一些产前病毒感染提升神经精神疾病的风险(如自闭症和精神分裂症)的后代(10,12- - - - - -16]。此外,越来越多的文献表明存在炎症或免疫变化的大脑至少一个子集的个人影响自闭症(17- - - - - -21),这表明免疫激活/炎症过程可能发挥作用(主要和/或次要)孤独症的发病机理的某些情况下。

孕期病毒感染已经被注入小鼠建模聚我:C (19),合成双链RNA,诱发免疫反应通过toll样受体的激活3。妊娠期聚我:C在小鼠和大鼠注射引起行为,发展中后代的神经化学和结构异常(19,22,23),这是符合孕产妇在妊娠期间免疫激活的观念可以改变适当的神经发育,因此,导致行为后果的后代一代。

杂合的Tsc2突变与保利我:C语言范式的孕产妇免疫激活(MIA)显示,小鼠显著交互效应,表明合作对妊娠影响生存和产后行为特征(24]:少比野生型(WT)幼崽崽出生聚我:C注入水坝,而幼崽和WT幼崽出生vehicle-injected母亲没有差别。此外,成年小鼠暴露于妊娠聚我:C和Tsc2haploinsufficiency显示缺乏社会探索性行为,而不是这种情况仅在动物暴露于这些因素之一。

妊娠免疫激活可能会扰乱正常的大脑发育至少部分原因是细胞因子之间的串扰和发展中中枢神经系统(19,22,25- - - - - -27]。TSC / mTOR信号调节免疫和炎症过程28,29日),因此,它是可能的加剧了免疫反应突变体胎儿占妊娠聚我的更严重的后果:C背景。为了解决这个问题的可能性,胎儿和WT控制胎儿妊娠期暴露于聚我:C或生理盐水和细胞因子反应测定在胎盘和胎儿和WT控制大脑。

2。材料和方法

2.1。老鼠

老鼠产生如前所述[24]。总之,以生成和WT后代妊娠期暴露于聚我:C或生理盐水,男性育种者(C57BL6 / Ncrl遗传背景)和C57BL6 / J野生型雌性交配。一夜之间交配后,女性阴道栓被指定为E0饲养者,single-housed,,安静的,除了每周笼子里的变化。E12.5,怀孕女性收到一个腹腔内注射20毫克/公斤聚我:C(σ)或车辆(见下文)。多聚肌苷酸盐和钾聚我提供:C构成的总重量10%的盐。保利的剂量是根据实际的重量我:C本身。多聚肌苷酸溶解在0.9%无菌生理盐水和10的体积μ注射L / g。关于动物福利是当地和联邦法规。

2.2。组织提取

两个小时或6.5小时后聚我:C,怀孕的女性与异氟烷麻醉,被斩首。子宫在冰冷的磷酸盐提取并简要地洗。随后,胎儿大脑和新鲜胎盘被孤立在解剖显微镜下冰冷的磷酸盐。组织是flash冷冻和储存在−80°C到处理细胞因子抗体阵列。

2.3。细胞因子抗体阵列

细胞因子抗体阵列(RayBio老鼠细胞因子抗体阵列3和RayBio老鼠细胞因子抗体阵列2)使用根据制造商的指示。总之,组织细胞溶解后的细胞裂解缓冲提供添加蛋白酶抑制剂(σ,P8340),均质,离心机在5000 g 10分钟(4°C)和上层清液是孤立的。蛋白质浓度建立了BCA化验。接下来,包含125的体积μg蛋白来自每个样本和合用组(WT /生理盐水、WT /聚我:C,/生理盐水,/聚我:C;材料4动物不同窝池为每个实验每组;6.5 h时间点,只能从以下组织分析:胎儿大脑WT /生理盐水、WT /聚我:C/聚我:C)。至少混合溶解产物被稀释10倍1 x阻塞缓冲总量为2.5毫升。阻塞后一步,数组膜被孵化池溶解产物在一夜之间在4°C。接下来,膜被洗3次2毫升洗缓冲我5分钟每个其次是第二清洗步骤清洗缓冲(2×5分钟;室温)。数组膜被孵化在biotin-conjugated抗体解决方案2 h在室温下后跟洗涤步骤清洗缓冲我(3×5分钟)和二(2×5分钟)。接下来,膜在HRP-conjugated孵化链霉亲和素(1:1000)在室温下2 h。洗后(清洗缓冲我,3×5分钟;洗第二缓冲,2×5分钟),数组膜在ECL-plus孵化和9400年台风成像扫描仪。图像分析在ImageQuant 5.2。 Array membranes contained a total of 62 or 32 different cytokine antibody probes (RayBio Mouse Cytokine Antibody Array 3 and RayBio Mouse Cytokine Antibody Array 2, resp.), in addition to positive controls and negative controls. Fluorescent intensities were measured for cytokine probes and positive and negative controls. After subtraction of background, data for cytokine probes were normalized to the average fluorescence intensity of the positive controls. All data are expressed as percentage of the corresponding value of the WT/saline group and are based on duplicate measurements for each cytokine probe (shown as mean +/− SEM).

2.4。统计数据

为了比较相对丰度在基因型和细胞因子治疗组,进行了多因素方差分析(与主题之间基因型和/或治疗因子和/或细胞因子作为受试因素)中描述的主要文本。

3所示。结果

评估如果胎儿Tsc2haploinsufficiency修改妊娠期母体免疫激活时细胞因子的反应模式(22),怀孕C57BL6 / J雌性老鼠受到一个保利我:C注入(20毫克/公斤,i.p。)或生理盐水在E12.5控制。胎儿大脑和胎盘组织中提取2 h或6.5 h后注入和细胞因子的相对丰度在这些组织评估使用细胞因子抗体阵列。

在胎盘组织(6.5 h后聚我:C),聚我:C引起一个健壮的增加一些细胞因子,包括促炎细胞因子il - 6(图1)。整体比较细胞因子资料由三方与基因型方差分析和治疗主题之间因子和细胞因子作为受试因素产生的主要影响聚我:C治疗()。附加分析单个细胞因子的水平(使用双向方差分析与主题之间基因型和治疗因素)显示g - csf的明显增加,il - 6, IL12 p40 / p70 KC, MCP-1, MIP-2,和胎盘的样本聚我咆哮:C治疗动物(图1)。保利我:C-induced胎盘细胞因子水平相似和WT样本(图1)。

多聚肌苷酸对细胞因子的影响在胎儿整个大脑比在胎盘提取物更温和:2 h后聚我:C,一些细胞因子的水平似乎减少了治疗组与生理盐水对照组(数字2(一个)和2 (b))。整体比较细胞因子配置文件(通过三方方差分析与基因型和治疗主题之间因子和细胞因子作为受试因素)显示无意义的趋势影响聚我:C (),而没有基因型的影响(),没有基因型x治疗交互()。探索性数据分析侧重于个别细胞因子(使用双向方差分析与主题之间基因型和治疗因素)暴露了显著改变分子数在聚丰度我:C组(数字2(一个)和2 (b)),比如Fas配体、fractalkine IL-3, il - 4, IL-5, lymphotactin, MCP-5, csf,米格,MIP-1alpha, TARC,泰克,tnf, VCAM-1。然而,这些分析显示很少的影响Tsc2haploinsufficiency胎儿细胞因子水平(数据2(一个)和2 (b))。

6.5 h后聚我:C,细胞因子似乎是,总体而言,适度升高聚我:C胎儿大脑相对于控制,尽管这一发现没有达到统计学意义(数字3(一个)和3 (b);双向方差分析、WT /盐与聚我:C,治疗像试因素:主题之间因子和细胞因子治疗,效果)。Tsc2haploinsufficiency似乎并没有调节细胞因子的反应引起的妊娠聚我:C在任何明显的方式(数字3(一个)和3 (b);双向方差分析、WT /聚我:C和/聚我:C基因型主题之间因子和细胞因子如试因素:基因型的影响,;测量x基因型互动,)。

综上所述,这些初步数据表明,胎儿大脑细胞因子变化丰富在米娅明显低于胎盘变化,研究表明细胞因子反应在米娅杂合的影响并不显著Tsc2突变。

4所示。讨论

在先前的研究中,我们发现了一个互动的影响Tsc2haploinsufficiency和妊娠期聚我:C在胎儿发育和成年小鼠的行为特征(24]:少比WT幼崽出生聚我:C-injected母亲,虽然vehicle-treated母亲的基因型比例平衡,建议,一起的胎儿吸收,妊娠期聚我:C引发了优惠取消胎儿在子宫内。幸存的保利我:C-exposed动物,但不/生理盐水和WT /聚我:C小鼠,显示不正常社会方法行为当在成年后测试(24]。总的来说,这些数据表明聚我:有关妊娠免疫激活和Tsc2haploinsufficiency交互扰乱胎儿发育。

妊娠免疫激活可能,至少在某种程度上,干扰正常的不利影响胎儿发育,因为发展的有机体的细胞因子(19,22,25- - - - - -27]。TSC-related细胞信号调节免疫和炎症过程28,29日),因此可以想象,一个加剧了免疫反应胎儿大脑妊娠聚我:C有助于互动的影响Tsc2haploinsufficiency和孕产妇免疫激活。

保利我现在分析:C-triggered细胞因子反应表明和WT胎儿大脑暴露在定性、定量相似的细胞因子反应在midgestational聚我:C管理。细胞因子抗体阵列显示明显增加大量的特定细胞因子在胎盘6.5 h聚我:C,代表安装母体免疫激活的证据由保利我:C。多聚肌苷酸引起胎儿大脑中的一个复杂的细胞因子水平的改变,由一个初始阶段,降低细胞因子丰富(2 h后聚我:C)和适当的后续阶段组织细胞因子水平升高(6.5 h后聚我:C),这是符合之前的数据表明,胎儿在母体的免疫激活大脑细胞因子反应是一个复杂的各种参数的函数,如时间聚后我:C注入和胎龄(30.]。在胎儿细胞因子水平相似和WT大脑,这表明genotype-dependent接触细胞因子的差异不太可能占的互动效应Tsc2haploinsufficiency和妊娠免疫激活24]。

TSC / mTOR信号不仅调节免疫反应,但也是一个下游信号传导中介的许多细胞因子和其他因素引起的聚我:C,还有待探索如果TSC-related改变细胞信号的下游细胞因子/其他聚我:C-induced因素导致的genotype-dependent影响聚我:C (24]。此外,也有可能的破坏性影响Tsc2haploinsufficiency和妊娠免疫激活聚集在某些发育过程正在进行聚的时候我:C注入(E12.5)。例如,妊娠期聚我:C和TSC基因突变干扰和破坏神经发生,成神经细胞迁移,和适当的皮质分层(31日- - - - - -33),在E12.5发展中中枢神经系统的重要功能。因此,妊娠免疫激活和Tsc2haploinsufficiency可能显示对这些流程和交互协同作用导致的表型降水否则阈下的神经生物学变化。

5。结论

目前的研究显示类似的细胞因子诱导概要文件Tsc2突变和WT控制大脑的上下文中midgestational免疫激活模式。这些发现表明,加剧了细胞因子反应Tsc2突变体不太可能占的互动效应Tsc2haploinsufficiency免疫激活和孕产妇中确定一项研究[24]。如果未来的实验将地址Tsc2haploinsufficiency和妊娠免疫激活可能交互融合细胞因子诱导的细胞信号和/或共同破坏midgestational神经发育过程中,神经发生和/或细胞迁移等。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

引用

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