肾细胞癌原发肿瘤组织中的微生物可能与静脉癌栓PD-L1的表达有关

抽象

目标。为了执行概念微生物评估和PD-L1表达在透明细胞肾细胞癌（CC-RCC）具有相关联的肿瘤血栓（TT）仿形的证明。方法. IRB批准后，6例患者接受了根治性肾切除术（RN）和静脉肿瘤血栓切除术（VTT）。我们从正常的邻近组织、肿瘤组织和血栓组织采集新鲜组织标本。我们利用RNA测序获得PD-L1表达谱并进行微生物组分析。使用学生的t型-使用SPSS v25进行检验、卡方检验和spearman秩相关分析。结果。我们注意到癌栓是几乎不存在不同的菌群。很大比例的表皮葡萄球菌检测和未知的，如果这是一个外科手术后或污染物;然而，人们注意到更多的血栓比其他组织。相比于血栓或正常相邻组织微生物多样性曲线是最丰富的原发肿瘤。在肿瘤血栓到正常背景组织检查PD-L1的差异表达，并指出三个六名受试者的具有高于2倍的阈值。这三个类似的主题有国外微生物是口腔微生物的典型居民。结论. 肾肿瘤比正常的邻近组织有更多不同的微生物。明确细胞性肾癌伴肿瘤血栓患者的口腔内微生物组分鉴定为PD-L1抑制的血栓反应提供了一个潜在的生物标记物。

一。介绍

美国预计每年将有超过62000例新的肾细胞癌（RCC）被诊断出来[1个]。RCC可以开发通常被称为肿瘤血栓血管内静脉浸润，伸入下腔静脉中的肾癌病例的大约4-10％[2个]。不幸的是，5年生存率可以根据转移的存在或不存在的范围从32至69％[三–5个]。如果肾血栓肿瘤不及时治疗，有近87％的患者会5个月[中位数内死亡肾癌6个]. 肿瘤血栓水平可能不会直接影响疾病特异性生存率，但是血栓的解剖水平会显著影响手术的复杂性[7个]. 因此，需要一种新的靶向治疗肿瘤血栓的方法。

报告表明，新辅助化疗加酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）不能减少肿瘤血栓，以提高手术发病率[八,9个]。免疫疗法很快被纳入晚期肾癌协议进行多次试验正在进行[10个]. 精确医学的概念是用特定的治疗方法针对单个肿瘤，但需要肿瘤组织和特定靶点的知识[11个]. 例如，PD-L1表达谱可以预测抗PD-L1治疗的反应[德意志北方银行]我们已经证明原发性肿瘤和肿瘤血栓有不同的PD-L1表达，肾脏原发性肿瘤活检不太可能预测肿瘤血栓的PD-L1表达谱[13个]。我们推测这种免疫功能是肿瘤微环境中。基于类型的活肿瘤内的细菌，它们可以通过与癌症的免疫保护协助促进肾癌的血管内生长。

此外，细菌制造多种化合物，这些化合物可能影响影响影响表观遗传信号传导的微环境。一些研究小组发现，肠道微生物群已经发展成与PD-1和PD-L1的相互作用[14个]. 在这项同意证明研究中，我们研究了肾肿瘤组织中与肿瘤血栓特异性PD-L1表达谱相关的各种微生物组分的相关性，以确定肿瘤血管内扩张的机制以及潜在的生物标记物来指导治疗。

2.方法

2.1条。人口

六名病人进行鉴定癌栓和之前的手术治疗及血栓同意。没有患者接受新辅助化疗。我们使用标准协议收集保存前瞻性组织快速冷冻处理。所述组织包括正常相邻肾实质，肿瘤，和血栓。此外，我们的病理学家进行标准处理按照护理标准。我们获得并记录，包括人口统计学，手术和临床结果数据。

2.2条。RNA序列

We performed sequencing with an Illumina HiSeq 3000 system using 100 bp paired-end protocol following the manufacturer’s protocol to attain mRNAs of all samples. After we obtained short sequence reads, we aligned them to the UCSC human genome build hg19 using TopHat2 [15个]. 使用HTSeq count计算所有样本中每个基因的计数来处理来自alignment的bam文件[16个]。

2.3条。生物信息学与统计分析

使用Trimmomatic对原始配对末端RNA序列的质量（目标错误率 <0.25%）、Illumina接合器序列和最小长度（95 bp）进行首次筛选。Bowtie2对NCBI RefSeq数据库进行了搜索，包括真菌、真核生物、细菌、古细菌和病毒成员[17岁,18岁]. 病理范围扩大到包括分类分配的全基因组覆盖率估计[19个,20个]. 在通过图谱读取评估总基因组特定覆盖率之后，那些平均基因组覆盖率低于0.1%的微生物成员被排除在考虑范围之外。此外，对PhiX-174控制基因组和Cutibacterium杆菌被确定为污染的代表，并在下游统计分析之前清除。成对的t型-测试和配对Mann–WhitneyU型试验来评估的分类丰利益集团之间的百分比差异有统计学意义。的程序性死亡配体1（PD-L1）的表达谱截止是在相邻的正常肾组织的两倍的变化。我们利用学生t型-连续变量检验和分类变量的Fisher精确检验。

三。结果

3.1。人口统计学

六例存在癌栓和肿瘤血栓后行肾切除。我们显示表病人的人口统计1个. 所有有pT3和不同程度肿瘤血栓的肿瘤都存在。在这个小群体中，大多数病人都是西班牙裔。无术中或术后死亡。我们还显示了与正常的邻近背景表达相比，肿瘤血栓中相应的PD-L1表达，以及原发性肾肿瘤中相应的口服微生物群的存在。

3.2条。微生物组分析

我们共分析了6名患者的18份样本。在我们的分类图谱中，53.5%的读操作被映射到参考微生物基因组。我们删除了PhiX和Cutibacterium杆菌作为已知的主要污染物进行分析之前。图中瀑布图显示了每个样品中检测到的微生物成分的概况1个. 我们排除了Cutibacterium杆菌因为它在每个样本中都有很高的代表性，所以我们可以更清楚地显示组织中识别的其他物种。

α多样性发现（图2个）注意在三个位置（正常，相邻肿瘤和血栓组间统计学显著的差异; ）。我们分析了这两种的结果> 1％的细菌丰度和> 5％的细菌丰度，既注意与样本之间的最高分集的肿瘤。我们注意到肿瘤内的微生物多样性是最大的。我们具体确定黄体微球菌,核梭杆菌,无乳链球菌，和白喉棒状杆菌是肿瘤标本中更丰富，相比于正常肾相邻和肿瘤血栓。具体地注意到传统上分配到口腔微生物的微生物，感兴趣口腔微生物成员将显示在图三。我们注意到高单个肿瘤样本核梭杆菌（患者1330），谁也有肿瘤血栓内的最高PD-L1表达。我们确定了三个受试者与位于其被指出有肿瘤血栓中高PD-L1表达在肿瘤内口服微生物聚集体。

3.3。PD-L1的表达

检查肿瘤相比相邻使用从正常相邻PD-L1表达两倍变化或更高截止正常，我们注意到3肿瘤（ID＃0,7，和8）在肿瘤是高PD-L1表达的血栓提5.3-，4.9-和2.7倍的差别，分别为（图三）。我们比较在有或无口腔微生物复合物的存在下，倍数变化差异，并注意到血栓特别是关于PD-L1表达统计学差异（T型-测试， ）。总的来说，所有3个口腔微生物群聚集在肿瘤内的受试者都被发现在肿瘤血栓内有高的PD-L1表达（费舍尔精确，单尾t型-试验； ）。

四。讨论

我们发现肿瘤血栓内的微生物组分检出率较低，肾癌组织内的微生物多样性较高。我们发现原发性肾癌中不协调的口腔微生物群与肾癌血管内传播成分中PD-L1的表达有关。如果得到证实，这一发现不仅可以作为肾癌肿瘤血栓患者PD-L1的生物标记物，而且可以为肿瘤血栓的形成和微环境的研究提供线索。我们的样本量小，不允许进行广泛的分析或因果推断，但确实提供了一个新的潜在的生物标志物，以探索在更大的人口。肾肿瘤的血管内部分不是典型的活检，可能是侵袭性的，这就是我们关注肿瘤内微生物群的原因。原发性肾肿瘤组织可以活检，但存在遗传异质性，是临床试验中有关精确药物和分层肾活检准确性的争议之一[21岁–23个]。

肠道微生物群已被证明影响酪氨酸激酶治疗肾癌[24个]。然而，也有目前正在进行肾癌的临床试验免疫抑制剂关卡的不断变化的风景线。在其他癌症一些研究报告反应率可以通过肠道微生物的相互作用[改变14个,25个–27个]。我们没有研究肠道微生物;然而，以往的研究表明，肠道微生物可能对免疫治疗的影响。我们的调查集中在肿瘤内鉴定微生物。由于胃肠道细菌的肿瘤微环境中存在，我们推测可能存在的环境内发生的免疫串扰。我们不要以为细菌引起肾癌，但非居民细菌的迁移可以在肿瘤微环境中积累很有意思。这些细菌与免疫系统的相互作用可以提供深入了解如何癌症和或微生物群能抑制免疫细胞功能以创建环境有利于肾癌的血管内传播。

居民口腔菌群的肿瘤内的识别是不是唯一的肾癌。在聚集体如考虑口服病原体核梭杆菌,Parvimonas MICRA，和消化链球菌性口炎结直肠癌含量很高[28个]. 特别地，具核体外结肠直肠癌细胞诱导CCL20蛋白的表达和刺激的巨噬细胞活化和迁移[29个]。梭杆菌是的膀胱癌患者的尿液中也发现，被认为是可能的protumorigenic病原体[30个]。作者证实26％（n个 = 11/42) bladder cancer tissues had核梭杆菌肿瘤内。在我们的样本中，我们确定了两个病人梭杆菌及癌栓内均具有PD-L1的超过2倍的表达。我们假设口服居民微生物增强了生活在恶劣的环境和交互与宿主的免疫系统比其他生物的能力较好。该通信可以提高某些癌栓患者的免疫特权。

目前研究的局限性包括样本量少，无法提供确凿证据证明肾肿瘤中存在肿瘤血栓和不协调的口腔微生物群。我们的组织样本直接取自手术时切除的肿瘤，并进行速冻。因此，为了扩展我们作为生物标记物的假设，我们需要从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品中证实这些发现。我们的初步数据需要更大样本量的PDL-1染色来证实。为了确保病理学家和材料的安全，我们试图公布我们的初步发现，并获得更大样本量的资金，包括PD-L1免疫组织化学和RNA序列分析。我们提出一个概念验证研究，以指导未来的微生物组织研究。理想情况下，为了确认PD-L1的应答率，在PD-L1随机临床试验之前获得的活检可以提供关于我们发现的影响的初步数据。

五，结论

我们已经描述了原发性肾癌肿瘤中口腔微生物群聚集的存在与肿瘤微环境的潜在相互作用之间的关系。我们认为肾癌癌栓中可能存在与PD-L1表达谱的相互作用，需要进一步研究。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从相应的作者处获得。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

这项研究得到了罗杰L.和劳拉D.泽勒基金会以及UT健康圣安东尼奥癌症中心的支持（P30 CA054174）。

工具书类

1. R、 L.Siegel、K.D.Miller和A.Jemal，“癌症统计，2017年”CA：一个癌症临床医生杂志卷。67，没有。1，第7-30，2017。查看位置：发布者网站|谷歌学术
2. A、 Q.Haddad，C.G.Wood，E.J.Abel等人，“肾细胞癌切除术后肿瘤预后，下腔静脉血栓延伸至肝静脉上方：当代多中心队列研究”泌尿外科杂志，第192卷，第4期，第1050-1056页，2014年。查看位置：发布者网站|谷歌学术
3. G. Ciancio，M.马诺哈兰，D. Katkoori，R.德洛斯桑托斯和M. S.索洛韦，“在接受根治性肾切除和下腔静脉血栓患者的长期生存：单中心的经验，”欧洲泌尿学卷。57，没有。4，第667-672，2010。查看位置：发布者网站|谷歌学术
4. L.隆德，J.雅各布森，M.Nørgaard等人，“合并症对肾癌的预后影响，2095至06年：丹麦人口为基础的研究”。泌尿外科杂志，第182卷，第1期，第35-40页，2009年。查看位置：发布者网站|谷歌学术
5. B、 Wagner，J.-J.Patard，A.Méjean等人，“肾静脉和下腔静脉参与肾细胞癌的预后价值，”欧洲泌尿学，第55卷，第2期，第452-460页，2009年。查看位置：发布者网站|谷歌学术
6. A、 C.Reese，J.M.Whitson和M.V.Meng，“未经治疗的肾细胞癌伴静脉癌栓的自然史，”泌尿肿瘤：研讨会和原始调查，第31卷，第7期，第1305-1309页，2013年。查看位置：发布者网站|谷歌学术
7. D、 G.Skinner、T.R.Pritchett、G.Lieskovsky、S.D.Boyd和Q.R.Stiles，“肾细胞癌累及腔静脉：外科切除术可提供有意义的长期生存。”外科学年鉴卷。210，没有。3，第387-394，1989。查看位置：发布者网站|谷歌学术
8. 五十、 D.Borregales，M.Adibi，A.Z.Thomas，C.G.Wood和J.A.Karam，“新辅助治疗在局部晚期肾癌治疗中的作用”泌尿外科治疗进展，第8卷，第2期，第130-141页，2016年。查看位置：发布者网站|谷歌学术
9. N. G.成本，S. E.德拉克洛瓦小，J. P.梦之等人，“分子靶向疗法对肾细胞癌腔静脉瘤栓的水平的影响，”欧洲泌尿学，第59卷，第6期，第912-918页，2011年。查看位置：发布者网站|谷歌学术
10. A.罗德里格斯维达，T. E.赫特森，J. Bellmunt和M. H. Strijbos，“用于转移性肾细胞癌的新的治疗方案，”ESMO打开卷。2，没有。2，文章ID e000185，2017。查看位置：发布者网站|谷歌学术
11. Y、 Riazalhosseini和M.Lathrop，“肾癌基因组中的精确药物”自然回顾肾脏病学卷。12，没有。11，第655-666，2016。查看位置：发布者网站|谷歌学术
12. A、 Prat，A.Navarro，L.Pare等人，“PD-1阻断后非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌和黑色素瘤的免疫相关基因表达谱”癌症研究卷。77，没有。13，第3540-3550，2017。查看位置：发布者网站|谷歌学术
13. M. A.利斯，Y.陈，R. Rodriguez等人，“与静脉瘤栓肾细胞癌的免疫原性异质性，”泌尿科学，第124卷，第168-173页，2018年。查看位置：发布者网站|谷歌学术
14. A、 Botticelli，I.Zizzari，F.Mazzuca等人，“抗PD-1/PDL-1治疗的微生物群与免疫适应度之间的交互作用，”肿瘤靶，第8卷，第8890-8899页，2017年。查看位置：发布者网站|谷歌学术
15. D.金，G. Pertea，C. Trapnell，H.皮门特尔，R.凯利和S. L. Salzberg，“TopHat2：在插入，缺失和基因融合的存在转录组的精确对准，”基因组生物学，第14卷，第4期，第R36页，2013年。查看位置：发布者网站|谷歌学术
16. S.安德斯，P. T. PYL，和W.胡贝尔，“HTSeq-一个Python框架，将工作与高通量测序数据，”生物信息学卷。31，没有。2，第166-169，2015。查看位置：发布者网站|谷歌学术
17. A. M.博尔杰，M.洛斯，和B. Usadel，“Trimmomatic：柔性修剪器用于Illumina的序列数据，”生物信息学，第30卷，第15期，第2114-2120页，2014年。查看位置：发布者网站|谷歌学术
18. B. Langmead和S. L. Salzberg，“快跳空读取与领结2对准，”自然方法，第9卷，第4期，第357-3592012页。查看位置：发布者网站|谷歌学术
19. O、 E.Francis，M.Bendall，S.Manimaran等人，《病理学：未组装测序数据下的物种鉴定和菌株归属》基因组研究卷。23，没有。10，第1721至1729年，2013。查看位置：发布者网站|谷歌学术
20. J、 哦，NISC比较测序程序，A.L.Allyson等人，“人类皮肤基因组中的生物地理学和个体形态功能，”自然，第514卷，第7520号，第59-64页，2014年。查看位置：发布者网站|谷歌学术
21. E.洛佩兹-Fernandez和J. I.洛佩兹，“在肾细胞癌肿瘤采样生态演化的影响下，”癌症，第10卷，第12期，第485页，2018年。查看位置：发布者网站|谷歌学术
22. K、 Saeed，P.Ojamies，T.Pellinen等人，“克隆异质性对肾癌药物反应性的影响，通过对多个患者来源癌细胞的体外药物试验进行评估，”国际癌症杂志，第144卷，第6期，第1356-1366页，2018年。查看位置：发布者网站|谷歌学术
23. S、 Turajlic，H.Xu，K.Litchfield等人，“确定性进化轨迹影响原发性肿瘤生长：示踪剂肾，”细胞，第173卷，第3期，第595页，e11–610.e11，2018年。查看位置：发布者网站|谷歌学术
24. S. K.帕尔，S.M。李，X。Wu等人，“治疗转移性肾细胞癌接收血管内皮生长因子酪氨酸凳子bacteriomic分析激酶抑制剂，”临床癌症研究卷。21，没有。23，第5286-5293，2015。查看位置：发布者网站|谷歌学术
25. V.戈帕拉克里希南，B. A. Helmink，C.N。斯宾塞，A.流便，和J. A. Wargo，“对癌症，免疫和癌症免疫治疗肠道微生物的影响，”癌细胞，第33卷，第4期，第570-580页，2018年。查看位置：发布者网站|谷歌学术
26. N、 Chaput，P.Lepage，C.Coutzac等人，“基线肠道微生物群预测伊皮利木单抗治疗转移性黑色素瘤患者的临床反应和结肠炎。”肿瘤学年鉴，第28卷，第6期，第1368-13792017页。查看位置：发布者网站|谷歌学术
27. B、 Routy，E.Le Chatelier，L.Derosa等人，“肠道微生物对基于PD-1的上皮性肿瘤免疫治疗效果的影响”科学类，第359卷，第359号，第91-97页，2018年。查看位置：发布者网站|谷歌学术
28. J. L.德鲁斯，J.R。白色，C. M. Dejea等人，“高分辨率细菌16S rRNA基因轮廓荟萃分析和生物膜状态揭示共同结肠直肠癌财团，”NPJ生物膜微生物组，第3卷，第1期，第34页，2017年。查看位置：发布者网站|谷歌学术
29. X.叶，R.王，R.查亚等人，“具核梭杆菌的亚种animalis影响促炎细胞因子的表达和单核细胞活化在人结肠直肠肿瘤，”癌症预防研究卷。10，没有。7，第398-409，2017。查看位置：发布者网站|谷歌学术
30. 五、 Bucevic Popovic，M.Situm，C.T.Chow，L.S.Chan，B.Roje和J.Terzic，“膀胱癌相关的泌尿系微生物群”科学报告，第8卷，第1期，2018年。查看位置：发布者网站|谷歌学术

版权

版权所有©2020迈克尔A.利斯等。这是下发布的开放式访问文章知识共享署名许可协议，其允许在任何介质无限制地使用，分发和再现时，所提供的原始工作正确的引用。