吖啶橙和流式细胞术:哪一种更好地测量精索静脉曲张对精子DNA完整性的影响?

摘要

我们评估了精索静脉曲张手术对不育男性精液参数和精子DNA损伤水平的影响。本研究共纳入75名患有精索静脉曲张的不育男性和40名可生育男性(对照组)。采用吖啶橙染色和流式细胞术染色质浓缩试验检测精索静脉曲张术前和术后6个月的精液分析和以DNA片段化指数表达的精子DNA损伤情况。随访1年观察妊娠结局。精索静脉曲张患者的精液参数明显低于对照组()。精子DNA断裂和精子DNA染色质凝聚在患者的平均百分比均较对照显著更高（)。精索静脉曲张后，精子DNA断裂显著改善，而精子染色质凝聚没有显著改变。在15出的75例精索静脉曲张，临床妊娠诊断;那些积极妊娠结局有精子数量，进行精子活力，精子DNA碎片显著的改善，但在精子DNA冷凝无显著差异与阴性妊娠结局的患者。我们从这个研究，吖啶橙染色比精子DNA完整性的精索静脉曲张后评价流式细胞仪更可靠的方法得出的结论。

1.介绍

精子DNA完整性是遗传密码的重要传输，并且它被认为是精子发生的完整性和男性生育潜力[的标记物1]。可育男性的精子约有10%和不育男性的精子有20-25%的DNA损伤[2]。精子DNA碎片（DFI）的高水平与不良妊娠结局已显著相关[3-五]。

精子DNA损伤可以与许多环境条件，例如某些药物，污染，吸烟，农药，化学品，高温和各种病理情况下，如隐睾，发热，老化，感染，化学疗法，癌症和精索静脉曲张[相关联6，7]。

精子DNA断裂的预后价值正逐渐优于常规精液参数，但其截断值尚未确定[8]。

在本研究中，我们通过acridine orange染色和流式细胞术评估精索静脉曲张对不育男性精索静脉曲张手术前后精液参数和精子DNA完整性水平的影响。

2.材料和方法

从2012年1月至2015年3月，共有75名男性至少1年不育，可触及的精索静脉曲张，寡，atheno，或畸形的历史，从我们的男科门诊选择。伦理委员会的批准后，所有患者接受参加学习和签署知情同意书。40名健康志愿者肥沃（对照组）也包括在这个前瞻性研究。

患者接受完整的病史和全面和局部检查。当至少有1条阴囊静脉最大直径至少3 mm时，静置或Valsalva机动后，经彩色血流显像的阴囊超声(Fukuda Denshi Tellus UF-850XTD, Tokyo, Japan)检测并证实精索静脉曲张。如Cornud等所述，当反流时间小于1秒时诊断为1级精索静脉曲张，当反流持续1-2秒时诊断为II级，当反流时间大于2秒时诊断为III级[9]。

精液样本在腹股沟下静脉曲张手术前和术后3个月用手淫的方法采集在无菌的塑料容器中，由3位至少有7年经验的外科医生进行环镜放大。37℃液化30min后进行分析，测量以下参数:精子浓度/mL、精子活力百分率、精子形态异常百分率按WHO指南评估[10]。

2.1。吖啶橙(AO)试验

AO测定测定了精子核DNA通过酸变性的能力，从而形成AO荧光从绿色(天然DNA)向红色(变性DNA)的超色差转移。氟铬AO作为单体插入双链DNA，并与单链DNA结合。与天然DNA结合的单体AO发出绿色荧光，而在变性DNA上聚集的AO发出红色荧光[11]。

AO检测可用于荧光显微镜或流式细胞术。为了进行荧光显微镜检测，将厚精液层在固定液(甲醇:乙酸3:1)中固定2小时。载玻片染色5分钟，用水冲洗。载玻片用蒸馏水冲洗，盖上玻璃罩，在激发波长450-490 nm的ZEISS mot plus(德国)荧光显微镜下观察。在每张幻灯片上，平均有200个精子细胞被同一个检验员评估。显示绿色荧光的精子被认为是正常的DNA含量，而显示黄橙色到红色荧光光谱的精子被认为是DNA受损(图)1)。将(黄-红)/(绿+黄-红)荧光比值作为DFI百分比，计算各组中a <1的样本百分比。

2.2。流式细胞术检测精子DNA染色质浓缩

流式细胞术检测精子DNA染色质损伤的方法参照Martinez-Soto等[12]。它依赖于用碘化丙啶(PI)染色并与DNA结合的精子细胞的荧光发射。精液样品用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)稀释至精子/毫升。五十μ精液样本的L的直接与染色50 μg/mL PI，使用循环检测试剂盒(Becton Dickinson，美国);将PI与精液混合，用FACSCalibur流式细胞仪和CellQuest软件(Becton Dickinson Biosciences, USA)立即进行分析。每个样本测量了一万次事件;分析了这种允许的精子染色质浓缩状态，因为DNA浓缩直接与PI摄取有关。用几何平均荧光强度(GMFI)测量PI对精子DNA的染色程度。核浓缩改变的精子(DNA去核和裂解)会有更多的染色(图)2)。这些测试是在患者治疗前，精索静脉曲张后3个月时进行。

3.统计分析

统计分析使用SPSS程序16.0.1版本(SPSS Inc.，芝加哥，IL)。数据以均数±标准差表示，以配对方式评估差异以及。采用斯皮尔曼相关检验研究各值之间的关系。被定为统计显著。

4.结果

75例患者通过体检发现精索静脉曲张，经多普勒超声确诊。患者的平均年龄为31岁(范围:20-57)，对照组为30.2岁(范围:21-37)。对照组和患者的主要精子特征见表1。所有患者在一个或多个这些参数有异常。有在精子浓度和渐进精子活力和正常精子形态中与对照相比，精索静脉曲张患者的百分比显著降低（表1)。

对照组和精索静脉曲张患者的DFI结果和GMFI比较见表1。为DFI和精子DNA染色质凝聚的GMFI在对照组中的平均值分别为低。

精索静脉曲张患者的DFI、GMFI与精子浓度无相关性，但与进展性运动及正常精子形态呈负相关。

精子DNA断裂吖啶橙和精子数精索静脉曲张后显著改变，但关于精子活力，形态和DNA染色质通过流式细胞术缩合（表中没有检测到变化显著2)。75例精索静脉曲张患者中有15例(20%)，临床妊娠(经超声检测胎儿脉搏证实)。与阴性妊娠组相比，阳性妊娠组精子数和精子活力明显改善()。此外，妊娠结局阳性的人，其DNA片段的吖啶橙百分比显著降低，但流式细胞术浓缩精子DNA与未使伴侣受孕的人相比，无显著差异(见表)3)。

5.讨论

众所周知[13-15]，我们的研究表明，平均精液参数显著在精索静脉曲张患者低于对照组。的精子计数低，可能是由于在发生在精索静脉曲张生殖细胞高的细胞凋亡，而减少运动可能是由于精子的异常形态影响其运动性，自由基的增加的氧浓度，或抗精子抗体[15]。

此外，世界卫生组织的一项大规模研究表明，与特发性不育相比，精索静脉曲张不育男性的精子浓度明显较低，但没有提供任何关于精子活力和形态的证据[16]。可怜的染色质凝聚了众多生殖结局[相关17，18]。所以DFI提供了精子质量和受孕结果的额外信息[18，19]。

在我们的研究中，有精子与精索静脉曲张患者中受损DNA的高百分比由AO和流式细胞仪检测;这是很好的先前的研究[记录20，21]。有精子受损的DNA了较大的比例AO染色评估表明，增加DFI是不孕症的可能原因之一，可以有助于不孕不育的发病率较高的患者中精索静脉曲张[15，22]。

与精索静脉曲张相关的几个因素可能导致DNA损伤，包括热、压力[23]，暴露于毒性剂[24]，睾丸缺氧[25]，雄激素剥夺[26，以及氧化应激的增加[27]。

精索静脉曲张患者高比例的精子DFI可能是染色质凝结受损所致[28此外，核损害的性质可能与长期和强烈地接触破坏DNA的因素有关。不仅是DNA，核基质的蛋白质也可能导致进一步的溶解阶段[27]。

我们的研究结果表明，那些有积极的妊娠结局精索静脉曲张后，曾与吖啶橙试验比别人谁没有显著降低精子DFI。不孕的前瞻性研究，少精子男性精索静脉曲张临床谁接受手术修复显示，postvaricocelectomy精液参数和DFI [一个显著改善29]。低DFI与较高的自发妊娠率和ART妊娠率相关。同样，另一项前瞻性研究报道了腹股沟下显微外科临床精索静脉曲张修复对精子DNA完整性和染色质致密性的积极影响(反映在精子DFI显著降低和DNA染色性高，resp.) [19]。在通过的一项研究[7，18]，在自然概念和在宫腔内人工授精受精的概率被认为是接近零，如果精子细胞的DNA损伤的比例超过30％，如通过SCSA提出一种用于DFI的阈值来检测> 30％的不育男性为ART差结果。

在我们的研究中，我们发现，后精索静脉曲张精子数量显著改善，而形态和运动的改善没有达到统计学显着性。同样地，通过吖啶橙精子DNA断裂不仅显著精索静脉曲张后改善，但也与阳性妊娠结局相关，而改善通过染色质凝聚测定通过流式细胞术既不达到统计学显着性，也不具有正妊娠结局相关。

精索静脉曲张切除术后，流式细胞术显示DFI为精子DNA的22.5%，这可能是一个可以接受的成功ART结果的阈值。这可与Pasqualotto等人的工作相媲美。五]谁报告（27-30％）的DNA损伤作为成功怀孕的阈值。

总之，目前的研究表明精索静脉曲张不育患者的精子DFI增加。与流式细胞术相比，精索静脉曲张术后吖啶橙检测与妊娠结局有显著的相关性，提示吖啶橙检测可作为一种廉价、简单的DNA完整性评价方法用于基础男科实验室的诊断和预后。

利益冲突

作者声明，不存在利益冲突，这可能被视为损害了研究报告的公正性。

参考

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