水通道蛋白1的超表达主积水睾丸鞘膜可能导致成人

文摘

调查的原因成人初级noncommunicating积水睾丸,蛋白质的表达水通道水通道蛋白(aqp) 1和3在鞘膜进行了评估。冷冻从成人主要积水患者睾丸鞘膜标本和控制男性nonhydrocele患者进行免疫印迹分析检测AQP1和AQP3蛋白质。石蜡包埋的鞘膜标本组织化学地沾anti-AQP1 anti-AQP3抗体和淋巴endothelia anti-podoplanin抗体染色。水囊肿液体进行生化分析。AQP1在鞘膜蛋白表达明显高于成人积水患者睾丸比控制。AQP3蛋白中没有检测到鞘膜。结构完整,AQP1的表达在鞘膜局部血管内皮和平滑肌细胞。AQP1-expressing毛细血管和淋巴管密度的类似鞘膜之间的控制和积水的患者。在水囊肿液钠含量高于血清。总之,AQP1蛋白表达降低的个人的毛细血管内皮细胞鞘膜的发展可能导致成人初级noncommunicating积水睾丸作为另一个aquaporin-related疾病。

1。介绍

积水睾丸鞘膜之间清晰的流体的积累和睾丸。成人初级noncommunicating积水睾丸导致进行性肿胀和地方不适影响一侧的阴囊,这归因于增强分泌和缺陷吸收液在鞘膜之间的空间和睾丸。原因通常是未知的。二次水囊肿睾丸是次要的炎症或肿瘤的阴囊。阴囊鞘膜是由间皮的细胞和submesothelial间质组织,类似于腹膜。

腹膜透析的终末期肾病患者的肾脏替代疗法,并使用腹部腹膜透析膜,在液体和溶解血液和透析液之间的物质交换。理论模型来解释腹膜透析的机制。three-pore腹膜传输模型描述了毛细管膜作为主要障碍决定运送水和溶质的间质和腹膜腔,由三个不同大小的孔(1]。运输水和溶质在毛细管,间质组织,跨间皮是数学分析模型(2]。一个新版本的模型考虑了血液在毛细血管和淋巴管吸收流量组织(3]。

水通道水通道蛋白(AQP) 1的分子与超孔隙负责transcapillary透水性在腹膜透析。透水性由AQP1占高达50%的超滤在高渗住(4],AQP1的损失可引起超滤衰竭在PD患者中,连同submesothelial纤维层的形成(5,6]。

水通道蛋白(aqp)是一个家庭的水通道保存从低等生物到哺乳动物。十三个哺乳动物水通道蛋白(AQP0-AQP12)已知是广泛表达于各种上皮细胞和endothelia在许多器官。aqp在膜形成四聚体,每个单体含有六个跨膜α螺旋形域与氨基和羧基末端位于细胞质膜的表面(7,8]。狭窄的water-permeable孔隙在每个单体是由两个高度保守的氨基酸残基的疏水部分短叫asparagine-proline-alanine (NPA)主题9]。他们的主要功能是调节水流穿过等离子体膜的细胞。aqp 3、7和9运输甘油以及水和aquaglyceroporins称为达到。aqp 1 - 4扮演重要角色在肾脏浓缩尿液的机制10]。aqp也便于transepithelial流体运输在外分泌腺等分泌上皮细胞(11]。

发现了人类腹膜组织表达aqp - 1, 3和4在这个秩序,这些可能参与水路运输(12]。AQP1是最丰富的AQP家族的鼠标腹膜和毛细血管内皮细胞表达的只有AQP5]。考虑上述机制的腹膜透析,一起解剖腹膜之间的相似性和鞘膜,我们推测,积水造成睾丸鞘膜水通道蛋白的过度。我们调查AQP1和AQP3的表达蛋白质鞘膜的成人患者主要积水睾丸,表明AQP1是过表达。

2。材料和方法

2.1。道德声明

本研究进行了符合赫尔辛基宣言后,关东大Rosai医院伦理委员会的批准。获得书面同意从所有参与者参与了这项研究。

2.2。病人

21岁成人患者主要积水睾丸(33 - 82岁,中位数:66)和19控制男性nonhydrocele患者(年龄:22 - 84,中位数:71)在关东大Rosai医院参加本研究。量水囊肿液可用图表的20名患者,6至1600毫升(中位数:150毫升)。16控制患者前列腺癌和三个积水funiculi。他们没有历史的感染、创伤、腹股沟疝,或肿瘤intrascrotal器官。对于最近的样本,鞘膜在水囊肿切除手术和水囊肿液收集。切除鞘膜()很快就被冻结在液态氮,然后保持在−80°C,直到被用作免疫印迹分析。控制,前列腺癌患者的鞘膜切除()和存储如上所述,当执行双边睾丸切除术作为前列腺癌内分泌治疗的介绍。任何数量的水囊肿液时偶然发现在睾丸切除术,切除标本被认为是积水的睾丸。水囊肿液也进行生化分析使用TBA-c16000(东芝医疗系统公司、Ohtawara、日本)。

2.3。免疫组织化学和形态测量学

石蜡包埋的鞘膜标本组织化学地沾了反兔多克隆AQP1 (c)抗体(Herford AP23362PU-N,阿克利抗体GmbH,德国),反兔多克隆抗体AQP3 (MBS175443 MyBiosource。Inc .)、圣地亚哥、钙、美国),anti-podoplanin抗体(D2-40, Dako、斯特鲁普、丹麦)染色淋巴endothelia作为主要抗体后,制造商的指令使用设想系统(Dako)和Dako Autostainer (Dako)。AQP1和AQP3的表达是由一个单一的病理学家(A.T.)。

各个部分的组织学被捕在Windows电脑和数码相机(DS-Fi1、尼康仪器、日本)的放大100倍,使用析像软件(NIS-Elements D、尼康仪器、日本)。规模100酒吧μ米被添加到每个图像校准的组织学分析。此后,捕获的图像与析像软件部分进行了分析(图像,http://rsbweb.nih.gov/ij/)为了计数AQP1-expressing毛细血管的数量和podoplanin-expressing淋巴管和测量领域的鞘膜组织部分。AQP1-expressing毛细血管和淋巴管的数量除以该地区被视为AQP1-expressing毛细血管密度和淋巴管密度,分别。

2.4。西方墨点法

冷冻组织在冰冷的均质里帕缓冲区(25毫米Tris-HCl (pH值7.5),150毫米氯化钠,1% (w / v)诺乃清洁剂p 40,钠脱氧胆酸盐0.5%,和0.1% SDS)包含1/100 (v / v)蛋白酶抑制剂鸡尾酒(猫P8340数量,Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),在4°C的环境与涡流30分钟。在14000×g离心后,在4°C, 30分钟,浮在表面的蛋白质提取物中恢复过来。整除(15μg为每个)的蛋白质样本与SDS混合样本包含2-mercaptoethanol缓冲,在40°C加热15分钟,在冰上冷却,然后在180 V 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(阿猫号2331850,E-T15L,东京,日本)一小时。凝胶涂抹在PVDF膜(猫呃- 2222,FluoroTrans W膜,覆盖公司,港口华盛顿,纽约,美国)在1.0 mA /厘米²一小时。

膜在室温下孵化30分钟在阻断缓冲区(0.3%脱脂牛奶,1% BSA Triton-TBS 0.05%),杂化与0.5μg / mL反兔多克隆抗体AQP1的(Herford AP23362PU-N,阿克利抗体GmbH,德国)或1μg / mL反兔多克隆抗体AQP3的(猫ab125219数量,Abcam,剑桥,英国)在0.05% Triton-TBS包含0.03%的脱脂牛奶,0.1% BSA在4°C一夜之间,并与0.1% TBST洗了三次。膜被孵化在室温下了三个小时在0.05% Triton-TBS包含0.03%的脱脂牛奶,0.1% BSA, HRP-linked anti-rabbit IgG抗体(1:20000稀释,猫数量7074年代,细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国)和0.1% TBST洗了三次。信号检测使用西方SuperSignal Pico化学发光底物(猫34077号,热科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。

暴露在x光片后,膜在0.1 glycine-HCl孵化(pH值2.0)在室温下30分钟的抗体。GAPDH信号加载控件使用0.1发现如上所述μg / mL anti-GAPDH鼠单克隆抗体(猫AM4300数量,Ambion,奥斯汀,TX,美国)作为主要的抗体和HRP-linked anti-mouse IgG抗体(1:20000稀释,猫数量7076年代,细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国)作为二级抗体。光密度分析西方墨点法进行使用析像软件的信号。AQP1信号值除以相应的GAPDH信号(AQP1 / GAPDH)进行统计评估。

3所示。结果

西方墨点法:AQP1蛋白表达在鞘膜(图1)明显高于成人积水患者睾丸(比控制())。AQP1 / GAPDH比率与分别为(由一个未配对t以及)。如一个散点图(图所示2),AQP1的表达/ GAPDH是相似的两例积水不到10毫升的液体和其他情况下超过100毫升。AQP3蛋白中没有检测到的鞘膜积水患者或控制。

的形态学分析AQP1-expressing鞘膜毛细血管和淋巴管是如下。结构完整,AQP1的表达在鞘膜局部血管内皮和平滑肌细胞(图3)。没有观察到显著差异在AQP1-expressing毛细血管的密度控制和之间的鞘膜积水患者(与/毫米²、职责;平均数±标准差;由一个未配对t以及)。淋巴管密度也比较(8.8±9.9和6.4±9.4 /毫米²、职责;由一个未配对t以及)。积水睾丸标本和控制相互散点图显示所用AQP1-expressing毛细血管密度和淋巴管密度(图4)。

血清的生化分析和水囊肿液是如下。没有观察到显著差异在同渗重摩或钾、氯、葡萄糖、尿素氮、肌酐,或测量之间的血清钙和水囊肿液,如表所示1。在水囊肿液钠含量高于血清。总蛋白的均值较低的水囊肿液比血清,但它不是基于一个未配对的明显不同t以及由于非常广泛的蛋白质水囊肿液中的值(0.1到8.7 g / dL,值:4.7 g / dL)。

4所示。讨论

成人的发病机制主要noncommunicating积水睾丸仍不清楚。我们的发现表明AQP1蛋白的过度表达的参与在个别毛细血管内皮细胞在鞘膜积水睾丸的发展,因为AQP1蛋白的表达水平在鞘膜主要积水患者高于控制,虽然AQP1-expressing毛细血管的密度是相似的。毛细管的upregulation AQP1让水流从血液通过间质和间皮鞘膜层。这些层之间的水运输的淋巴管吸收鞘膜。积水条件下流体可能积累,增强水射流从毛细血管由于AQP1的表达增加超过最大容量的淋巴液体吸收。

积水后,鞘膜功能发生透析膜和平衡的物质,如腹膜透析。因此,大多数物质的生化浓度,除了钠和总蛋白,血清和水囊肿液之间的相似,如表所示1,导致他们相同的同渗重摩。积水的同渗重摩流体,以及血清,可能通常使用公式计算:2 (Na +) +(葡萄糖)/ 18 +(包子)/ 2.8。如表所示1,水囊肿液中葡萄糖浓度相对较低,更不断的价格相比血清,不影响血清葡萄糖水平的广泛分布,原因未知。同渗重摩的血清和水囊肿液相似,钠浓度可以弥补低水平的葡萄糖水囊肿液体。因此,在水囊肿液钠含量可能显著高于血清。星野和他的同事以前的生化成分分析流体的成人积水(13]。报告,钠,钾,尿素氮浓度水囊肿液在血清类似。在水囊肿液总蛋白浓度变化广泛从几乎为零的血清。这可能是由于毛细血管的渗透性与大毛孔,半径为200 - 300,运输大分子蛋白质(1),要取决于每个鞘膜。此外,淋巴引流的可变利率的鞘膜蛋白可能导致更广泛的水囊肿液总蛋白质含量的分布。

淋巴管密度的鞘膜是成人积水患者和对照组之间的相似。流体从淋巴管吸收是否类似仍有待确定。淋巴管吸收液的能力很难量化。散点图显示AQP1-expressing毛细血管和淋巴管密度的不能用来区分水囊肿患者睾丸和控制。不过,总液体吸收淋巴管可能更大的人没有或很少积水液体。水囊肿液可能积累在二级积水的阴囊炎症、癌症、创伤或减少由于淋巴管吸收液的能力。之间的平衡水射流从毛细血管和液体的吸收进入淋巴管必须明显中断为了noncommunicating积水睾丸来培养。

为什么AQP1蛋白调节鞘膜的成人患者主要积水仍然未知。表观遗传学的DNA甲基化和单核苷酸多态性等AQP1基因可能参与成人睪丸水囊肿的发病机制。AQP1基因多态性在原发性开角型青光眼(评估14],hypomethylation AQP1基因表示的唾液腺腺样囊性癌(15]。在先前的研究中,AQP3在人类腹膜组织中发现了逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr)方法(12),这是非常敏感的,而不是发现在鞘膜越不敏感的免疫印迹分析用于本研究。的贡献AQP3在鞘膜水的交通似乎可以忽略不计。

5。结论

过度的AQP1蛋白鞘膜可能导致成人的发展主要积水睾丸疾病作为另一个水通道蛋白。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

作者感谢Koichi Sakazume先生援助与免疫组织化学。

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