提高H的原位生物沼气升级性能分析及微生物群落演化₂/公司₂比

摘要

氢供给量的影响原位通过监测微生物群落的过程和演化，对沼气生物升级进行了研究。两个并行反应器在37°C下运行211天，以1.5 gCOD∙(L∙d)的恒定有机负荷速率连续向其投加污水污泥。^－１和氢(H₂）.H的摩尔比₂/公司₂由0.5:1逐渐增加到7:1，以转化二氧化碳(CO₂)通过氢营养产甲烷作用转化为生物甲烷。在化学计量H以上，沼气成分的变化具有统计学差异₂/公司₂比率(4:1)。在一个小时₂/公司₂当比例为7:1时，沼气中甲烷含量达到90%，对有机物降解无不利影响。选择、适应和富集原始生物质的可能性与目标微生物能够生物转化CO₂16S rRNA基因高通量测序显示，属氢营养产甲烷菌Methanolinea和甲烷细菌属属,占主导地位。基于本研究的结果，进一步优化和工程化该工艺是可行的，是提高污泥处理能量回收的必要手段。

1.介绍

全球变暖已经被证明是大气中碳浓度增加的结果，这是由温室气体排放造成的，主要是二氧化碳(CO₂)源自人类活动。根据现有的最新数据[1中国是最大的一氧化碳生产国₂相当于109亿吨二氧化碳₂紧随其后的是美国(每年5.1 Gt)和欧盟(每年3.2 Gt)。在欧洲国家(EU28)中，意大利排名第三(0.36亿吨)，世界排名第18位。因此，对城市污水处理厂(WWTPs)施加越来越严格的限制，以及减少使用化石资源的需要，要求植物实现能源自给[2］.能源通常是通过厌氧消化(AD)产生沼气来回收的。沼气，主要由55-70%的甲烷组成₄， 30-45%的CO₂，以及其他微量气体(氮、氧、水、碳氢化合物、氨和硅氧烷)[3.，可用于联合热动力发动机，或在去除CO后₂(沼气升级)等杂质，如生物甲烷。在最后一种情况下，市场已经提供了各种化学/物理升级技术。然而，一个主要缺点在于简单地分解CO₂从沼气通量。尽管如此，考虑到能源/化学消耗方面的巨大挑战，研究人员正在研究替代解决方案[4］.其中，生物CO₂转化成甲烷(CH₄)(方程(1)是有吸引力的。

它允许同时减少一氧化碳₂和CH的增加₄产量，转向更可持续的沼气升级技术，转化生物源CO₂转化为一种能源，在化石CO方面具有负碳排放足迹₂(5］.外源H₂允许有限公司₂可通过利用自然波动的可再生能源(风能、太阳能)的过剩非峰值能量来维持水电解过程，将其转化为电能(P2G) [6］.此外，在具有污泥AD处理的污水处理厂中，生物沼气池升级还带来了两个额外的优点:(i) O₂与H₂可用于活性污泥处理，而活性污泥处理所需的能源约占污水处理厂总能源需求的50% [2];(ii)污水处理厂的出水可用作电解的水源，但可能需要进行预处理[7］.

生物有限公司₂甲烷化过程是由古菌属的纲进行的Methanobacteriales，Methanomicrobiales,Methanococcales，属氢养产甲烷菌[8］.各厌氧消化池中普遍存在氢养产甲烷菌，它们在清除H₂为了维持较低的分压( ）.

到目前为止，这种新型升级技术在实验室的三个主要应用进行了研究:原位，非原位(9- - - - - -11),而混合动力(12］.在原位H₂被送入生物气反应器，与CO₂由有机基质降解产生。主要缺点原位(a)中间产物的积累，由于H的增加₂分压(pH值₂)[13]， (b)由于内源性溶解CO的逐渐耗竭而导致pH升高₂(9，12，14]，以及(c)氢溶解度低，限制了气体在液相中的均匀有效分布[13，15- - - - - -18］.

对于有机降解链的影响，Corbellini等[21]试验了一种新方法，在半批生物反应器中进行，包括逐步增加H₂以适应和发展一种特殊的生物质。相关文献中很少有其他研究原位对污水污泥进行了沼气升级处理，并重点研究了H₂/公司₂工序优化比率[19，20.］.的确，深入了解H效应是至关重要的₂/公司₂在形成细菌和古生菌联合体的过程中，能够稳定地同时最大化CO₂有机基质的甲烷化和降解。

在这项研究中，生物学原位沼气升级在两个实验室规模的连续搅拌槽式反应器(CSTR)中并行运行，以评估过程的重复性和实验结果:后一个方面是重要的，因为当测试生物沼气升级时，它很少被提及，而且绝大多数文献报道的是单操作反应器。实验方案的确定主要有两个目的:研究H₂/公司₂并在宏观尺度上研究特定微生物群的演化与该过程的发展相联系。根据研究结果，进一步了解了:(1)产气量与主要操作参数之间的关系;(2) H₂/公司₂在遇到不稳定之前系统可以被推到的比率;(3)提高H₂/公司₂在不同的实验阶段对微生物群落进行分析;(4)工艺的可重复性。

2.材料和方法

2．1．实验设置与设计

两个相同的实验室规模的cstr(总体积， ；工作高度, ；直径, ；工作容积, ），以下简称为R1和R2，它们是并行操作的，每天注入0.5 L的一段和二段污泥混合物。有机负荷率指的是污泥(OLR)_SL)是 gCOD∙(L·d)^－１水力停留时间(HRT) 22天。这两个反应器(Umwelt GmbH)都配备了蠕动泵，用于污泥的装载和排出以及控制pH值 通过加入酸或碱溶液(0.5 M HCl, 1 M NaOH)。H₂在每个反应器中通过一个铝管注入额外的蠕动泵(Velp scientific, Type SP-311/2，意大利) ）沉入总污泥高度的3/4处。

垂直轴式搅拌器保证了在120 rpm时的剧烈搅拌。外部加热套将内部温度维持在 ．沼气流量通过气表(RITTER Apparatebau GmbH & Co. KG)进行定量，并通过Co的气体分析仪(AwiFLEX Cool+， Awite Bioenergie GmbH)进行在线分析₂(范围0 - 100%),CH₄(范围0-100%)，O₂含量(量程0-25%)通过压力和红外补偿的方法，而H₂S(高达1500 ppm)由电化学传感器测量。氢气分析，每周两次，使用气相色谱(DANI主GC)和火焰电离检测器(FID Nukol熔融二氧化硅)。反应堆总共运行了211天，分为八期(表)1）.在第一阶段(启动阶段)，两个反应器仅饲喂污水污泥混合物。然后，保持一个恒定的OLR_SLH₂在H₂/公司₂比率:从II到VI的时期专门用于富集(H₂/公司₂从0.5到4);在第七和第八时期，H₂/公司₂采用化学计量值以上的比率，并等于6和7。表格1报告自OLR以来每个时期的其他相关运行情况_合计是由污水污泥混合物(OLR_SL)和H₂，两者均以COD为基础计算(换算因子8 gCOD∙gH₂^－１）.直到化学计量H的周期长度₂/公司₂假设为Corbellini等[21，这种持续时间的定义是为了同时实现对扰动的稳定响应，并缩短使生物量适应H增加所需的启动时间₂供应。

H的量₂每个反应堆的每日剂量我(剂量(H₂）_{period_我})是根据H₂/公司₂和CO的平均速率₂在( -1）^th期间，根据[21］.每日H₂通过激活H₂泵为20脉冲/天，并调整泵速，以达到H₂每个实验期的数量。

2．2．接种剂、原料制备及特性

饲料污泥和接种物均取自布莱索(意大利米兰地区)的一个市级污水处理厂。投喂污泥(0.5 L∙d^－１)是一次活性污泥和废活性污泥(WAS)的混合物，直接从一次沉淀池中提取，WAS在那里循环。接种物(10 L)从中温全容量消化池中收集。将污泥混合物进行散粒和筛分(2mm)，以防止泵管堵塞;-20℃保存，解冻后使用。底物的主要特性见表2．在试验开始和结束时对污泥混合物进行了两次生化甲烷电位试验(BMP)，在最后一次试验中使用反应器出水作为接种物。

2．3.监控策略

每10天测定一次投喂污泥的总固体、挥发性固体和总COD。每周两次测定污水消化液的总固体和挥发性固体、挥发性脂肪酸、可溶性COD和碱度。在此基础上，计算了每个试验周期的两个指标:(i) H₂消费(H_2,滚开)，根据…21]，以及(ii)挥发性固体的去除百分比，以监测H₂注入对有机基质降解，根据式(2）.

在哪里和(问∙L^－１)为流入和流出污泥中的挥发性固体浓度。

２.４.分析方法

总固体和挥发性固体(TS, VS)根据标准方法2540 [22］.用H滴定法测定碱度₂所以₄pH值可达4.3，使用自动滴定器(哈希兰格沼气滴定管理器，美国)。可溶COD (sCOD)过滤后(0.45)用分光光度测试试剂盒(DR6000 UV-VIS with RFID by Hach-Lange)测定μm)。挥发性脂肪酸(VFA、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、缬酸)浓度按标准方法5560 [22]，使用气相色谱仪(DANI主气相色谱仪)和火焰电离检测器。以后，术语TVFA表示用等效COD表示的VFA总浓度。总COD按标准方法5220测定[22］.沼气成分(有限公司₂,CH_4，H₂阿,₂和N₂)每周进行两次气相色谱分析(DANI Master GC analyzer配备HayeSep Q和Molesieve 5A两柱)。自动甲烷电位测试系统II (AMPTS II, Bioprocess Control®)用于BMP的测定。在中温条件下进行了重复试验( ）根据意大利BMP标准方法，在VS基上采用底物与接种物(S/I)比值为0.5的方法[23］.

2．5．统计分析

使用SPSS v.25软件进行统计分析，以评估:(i)两个反应器(R1和R2)运行的重复性，以及(ii)在八个实验期间观察到的差异的显著性。首先通过图形(未显示结果)和数字验证数据分布。Kolmogorov-Smirnov和Shapiro-Wilk测试( ）用于检验变量是否符合正态性。由于正态性条件不总是满足，非参数Mann-Whitney试验及Kruskal-Wallis试验( ）用来比较所选的因变量和感兴趣的独立分类变量(反应堆或时期)。

2．6．16S rRNA基因的采样、扩增、测序及序列分析

从R1和R2反应器中共采集16个样品，进行16S rRNA高通量测序，进行微生物群落分析。根据以下方案:采样点选择一个样本收集的第四期(R1-IV和R2-IV)和V (R1-V和R2-V),两个期间VI (R1-VI和R2-VI),一个第七期结束时(R1-VII和R2-VII),和三个在过去八世时期(R1-VIII_a;R1-VIII _b;R1-VIII _c;R2-VIII _a;R2-VIII _b;R2-VIII _c)，如图所示1．

将样品离心(7000 rpm, 4°C, 10分钟)，获得约2g细胞颗粒。根据生产商的方案，使用FastDNA Spin for Soil试剂盒(MP Biomedicals, Solon, USA)提取总微生物DNA。利用783F和1046R引物pcr扩增细菌16S rRNA的V5-V6高变区[24，25]，而对于古菌群落，利用IA_349F-IA_571R引物pcr扩增16S rRNA片段[26］.利用双重PCR扩增技术制备了多重文库。细菌PCR在 GoTaq®Green Master Mix (Promega Corporation, Madison, WI)的体积反应μM，循环条件为98℃初始变性30 s;98°C 10 s, 47°C 30 s, 72°C 5 s, 20个循环;最后在72°C下拉伸2分钟。在大肠杆菌中进行PCR 体积反应与Phusion high fidelity polymerase (Thermo Scientific)和2μM，循环条件为96℃初始变性4 min;96°C持续30 s, 68°C持续30 s, 72°C持续25 s共10个循环;96°C 30s, 58°C 30s, 72°C 25 s共30个循环;最后在72°C下拉伸5分钟。根据制造商的说明，使用Wizard®SV凝胶和PCR清理系统(Promega Corporation, Madison, WI, USA)对扩增子进行纯化。纯化后，用分光光度法评价DNA质量，并使用Qubit®(Life Technologies, Carlsbad, CA)对DNA进行定量。Illumina Miseq测序是在意大利的里雅斯特生物医学中心进行的。将测序后的Reads根据索引进行解复用，然后进行质量过滤。使用DADA2 v1.4.0将经过质量过滤的reads组装成错误校正的扩增序列变体(ASVs) [27，代表独特的细菌/古菌类群。利用核糖体数据库项目(RDP)对组装的asv进行分类(门到种)。

使用PAST3软件绘制稀疏曲线。热图是用STAMP软件制作的。采用R (R版本3.6.0)纯素包装进行基于Bray-Curtis不同度指数的非度量多维尺度分析。讨论的数据集中在群落中最丰富的细菌和古菌属，古菌的相对丰度至少为0.5%，细菌的> %。

3.结果与讨论

3．1.反应堆操作之间的重复性

对反应器之间的重复性进行了统计测试，以评估对输出数据进行分组是否可靠。为此，我们使用了5个变量:3个“气相”变量、沼气率及其组成(CH₄和有限公司₂)和两个“液相”变量，碱度和TVFA。对它们进行评估，要么将所有数据汇集在一起，在周期上独立(案例A)，要么逐个周期分离测试变量(案例B)。对于案例A，如果考虑沼气率( ；渐近意义, ；意思是,原因就是: ； ）.对CH进行检测，结果正好相反₄（ ， ，原因就是: ； ）和有限公司₂内容( ， ，原因就是: ； ）以及碱度( ， ，原因就是: ； ）和TVFA ( ， ，原因就是: ； ）.虽然R1和R2的内部条件在统计上相似，但在沼气率的数据分布上存在差异，但气体成分在统计上具有可比性。这可能不仅归因于在两个反应器之间形成的不同微生物群落(见第3.5段)，而且归因于特定的当地环境条件。经过一段时间的H₂加药后，生物反应器可能会改善或反过来限制特定的降解途径或特定酶的分泌。这方面还需要进一步研究，并针对这一目的制定有针对性的实验计划。反应堆之间的逐期比较(情况B)提供了更准确的结果(见表)S1在补充材料中):反应器间的沼气率分布在所有8个时段均有差异，显著性值均远低于0.05。相反,公司₂和CH₄R1和R2各时期的含量分布相同，除了期I(确切意义， ）和六世( ）.碱度和TVFA的结果证实了从第一阶段到第八阶段测试整套数据的观察结果:R1和R2内部的化学条件在统计上总是具有可比性的，除了第六阶段( ）和八世( ）.需要注意的是，第六阶段对应于H的化学计量剂量₂:从这个时期开始，预期会有显著的变化。在此统计分析的基础上，分别给出和讨论了两种反应器的所有结果，特别是与沼气率有关的结果。

3．2.沼气升级的统计意义

三个“气相”变量使用非参数的Kruskal-Wallis检验进行统计检验，以验证观察到的差异在8个周期之间的显著性(见表)S2在补充材料中)。所有三个变量的显著性值均低于0.001，这有力地证明了至少一对周期的平均秩之间存在差异。在拒绝Kruskal-Wallis检验后，进行两两多重比较的事后程序，以确定哪些对是不同的。Dunn的两两检验使用Bonferroni校正来调整总检验数的拒绝水平(结果汇总于表中)S3、补充材料)。本试验表明，对于两个反应器，当接近H的化学计量剂量时，第I期产生的沼气率从第V期开始有统计学差异₂；在R1和R2之间观察到不同的行为:对于R1，期间VII ( ）和八世( ）相反，在R2中，从V到VIII期间产生的沼气率提供了强有力的证据( ）统计上与第一阶段和第二阶段所产生的数据不同。一氧化碳也有类似的结果₂和CH₄含量变化:从第VI期开始，沼气成分变化与第II期有统计学差异( ）;增加H₂/公司₂但从统计学角度看，高于化学计量值的比例变化不显著。

3．3.反应器的性能

3.3.1。期间我:Pre-H₂阶段

如图所示S1在补充材料中，在第一阶段，在两个反应器中观察到甲烷产量的初始变异性。但在97天后，对应三个hrt，两个反应器均达到稳态，甲烷产率分别为0.26和0.28 NLCH₄∙问^－１对于R1和R2，其结果可与BMP值( 和 NLCH₄∙问^－１)在实验开始和结束时进行测量。表格3.报告在两个平行反应堆的实验期间甲烷、二氧化碳和氢气的平均气体流动。从一开始，CO就越高₂和CH₄与R1相比，在R2反应器中可以观察到产量，尽管检测到类似的沼气成分。在实验过程中，尽管所有饲养阶段都保持相同的饲养方式，但R1与R2之间的偏差仍在增大:这可能是由于两个反应器的环境条件发生了无意的小变化，这可能导致微生物群落的不同形态(例如，碱度、营养和VFA，这可能决定了不同的特定酶的分泌)。在正常情况下，这种变化导致的影响可以忽略不计，例如在R1到IV阶段中发现的未转化VFA的浓度略高₂加剂量时，这一过程可能对微小的变化更敏感，然后导致反应器之间更明显的差异(见碱度和VFA浓度从阶段V开始，接近化学计量H时₂/公司₂比率)，这导致了表中所报告的沼气产生率的不同3.．

数字2显示，对于两个反应堆，每个时期监测参数的平均值。

反应器在第一阶段的表现类似，高甲烷(76.2%)和低一氧化碳₂(23.8%)含量(图2 (b))和可比碱度(图2 (c))和TVFA浓度(图2 (d))，以醋酸为主。

3.3.2。阶段II-VI:氢养产甲烷菌富集

在第二至第六阶段(第21-94天)，H₂逐步增加注射剂量。由于在输出气体中检测到很低的浓度，因此可以得出H₂被整个过程消耗殆尽，同时观察到产甲烷速率略有增加，如图2 (b)．这证实了氢营养产甲烷菌通常在H₂消耗率[28，一旦它们接触到它，就能够消耗更多可用的氢。此外，基质的厌氧降解不受影响，VFAs在此过程中很容易消耗，因为没有观察到积累:沼气产量稳定，挥发性固体降解，如表所示4．然而，如图所示2 (c)，乙醇峰为3.2 gCOD∙L和1.4 gCOD∙L^－１在第二阶段报告了R1和R2反应堆的情况，立即响应了H₂注入。据作者所知，在最近的文献中原位沼气升级、乙醇积累尚未见报道。这可能归因于H₂在厌氧消化器的正常运行中。乙醇是在酸生成过程中由糖生成的[29]，一般被合养菌和产甲烷菌氧化[30.，31］.低氢₂浓度允许醇和脂肪酸通过H热力学降解₂-产生共养细菌[30.];因此，额外的H₂提供给尚未适当驯化的生物量影响乙醇氧化，可能导致乙醇积累。然而，尽管H₂不中断供应，乙醇减少到0.2 gCOD∙L^－１在第III期(H₂/公司₂1: 1)，在第四期几乎完全耗尽。这可能是由于H的活性增加₂-清除微生物，能迅速降低外源H₂，然后允许酒精降解。

此外，据报道，约40%的总H₂提供通过同型乙酰生成和乙酰碎屑甲烷生成途径利用[32］.尽管如此，在本研究中，两个反应器中的醋酸盐浓度都是稳定的(0.6 gCOD∙L^－１在R1和0.4 gCOD∙L^－１在R2中)，它似乎与这个显著的H形成对比₂消费路线。

当达到化学计量H时₂/公司₂(4: 1)值，R1产气量变化较大，产甲烷率变化范围为1.5 ~ 4 NLCH₄∙d^－１(图2(一个)）.无论不稳定的沼气率，CO₂而CH则降低至14%₄升至81%。R2表现不同，抑制了沼气和甲烷速率的变化(3至4.46 NLCH)₄∙d^－１)，但CO的还原量较低₂含量(23 ~ 19%)和CH₄增加(75%)(图2 (b)）.作者认为，R1的沼气产量较低，导致H含量较高₂CO的含量较低₂从而产生更高的一氧化碳₂转换。

3.3.3。阶段6 - viii:过量化学计量评估

在第七和第八阶段，两个反应堆都在H₂/公司₂6:1和7:1的比例。在第一个超化学计量期，CO₂进一步转换，以实现CH₄含量分别为R1和R2的84%和80%。VFAs很低，表明过程稳定。当H₂/公司₂R1和R2的最大产甲烷率分别为4和4.5 NLCH₄∙d^－１，尽管R1表现出高变异性。此外，VFAs和乙醇几乎不变。在最后一个时期，R1达到了最低的CO₂含量4.5%，CH最大₄含量为90.3%(图2 (b)）.外源H₂注射。确实，对污泥混合物进行了BMP测试(第137天)，使用从两个反应器中提取的沼地混合物作为接种剂。这导致了 NmLCH₄∙问^－１的值 NmLCH₄∙问^－１在试验开始时，用布雷索污水处理厂的消化液作为接种物。

3.3.4。与文学

表格5总结了国内外关于这方面的研究原位H₂不同操作条件下的注入。可以看出，很少有研究涉及原位在污水污泥中温条件下进行的沼气升级过程可以与目前的工作进行直接比较。Wang等[33利用合成焦炉煤气(SCOG 92% H₂和8% CO)，作为氢源注入，采用中空纤维膜(HFM)模块，应用化学计量生物甲烷化比( ）.沼气完全升级(98-99 CH)₄%)， pH值固定在8。Agneessens等人[19[试验脉冲₂采用H₂/公司₂比率从2:1到10:1不等。8: 1的比例被证明是最终CO的最佳选择₂内容的11.8%。后来，在Corbellini等人进行的一项研究中[21), H₂/公司₂在半连续模式下，比从1:1增加到最大的4:1，但CH₄在沼气中达到的比例最高为80%。本研究研究的过程的体积(16 L)比以往所有研究采用的体积总是低于3.5 L[49]。H₂在更大范围的H₂/公司₂在CSTR生物反应器中。此外，该过程的可重复性是通过两个并行运行的反应堆进行评估的，这是一个以前从未讨论过的话题。上述各方面对生物H₂和有限公司₂甲烷化行为对实际应用具有重要意义，可用于更大规模的研究。

3．4．CO的碱度变化趋势₂％

图中报告了两个反应器中碱度浓度的平均值2 (d)．从第二阶段开始，随着H的逐渐增加，两个反应器的碱度都在消耗₂/公司₂比率。这一证据与CO直接相关₂根据先前的一项研究[33］.整个公司₂实验结束时，R1(-40%)显著高于R2 (-14%)4)，也得到了下级官员的确认₂在输出沼气中登记的内容。厌氧消化池的缓冲能力对保持中性和稳定的pH值至关重要。因此，全面应用原位如果进水的有机基质不足以恢复碱度，则升级过程受到限制。

3．5．高通量16S rRNA基因扩增分析

如表所示S4在辅助材料中，16个样品共获得514,295条(细菌)和495,983条(古菌)reads。除古菌R1-VIII_b和R2-VIII_b外，其余均达到了一个平台，说明asv的数量覆盖了样品的丰富度(图2)S2在补充材料)。由于R1_VIII_b和R2-VIII_b的古菌测序结果不令人满意(仅约200 reads和5 ASV)，因此不纳入进一步分析。通过NMDS分析微生物群落随时间的演变和对消化器的影响(图)3.）.

对于细菌而言，无法观察到明显的簇，而同一时期两个反应器采集的样本相互接近，说明由于不同实验时期采用的操作参数不同，群落发生了演化。相反，对于古菌，可以鉴定出两个簇，其中包含了大部分的R1和R2样本。由于R1_VIIIc和R2_VIIIc与其余的示例完全分离，因此在操作时间结束时，社区发生了一次整洁的转移。

3.5.1。细菌群落组成

细菌群落由厚壁菌门(17%-50%)、变形菌门(12%-26%)、放线菌门(9%-25%)和拟杆菌门(4%-22%)组成，而其他门，如非菌门(8%-15%)、Cloacimonetes(1% -11%)和增殖菌门(1%-2%)数量较少(图2)4(一)）.细菌在属水平的相对丰度如图所示S3补充资料。正如以前的研究一样，在消化器中经常观察到厚壁菌门和拟杆菌门的优势[34，因为它们是水解细菌[33，35，36负责分解聚合物底物，如蛋白质、脂类和多糖。变形菌门(Proteobacteria)，又称产酸细菌，是本研究的优势菌门之一，与前人对AD的研究一致[36，37］.由此可见，与水解和产酸过程相关的细菌占细菌总数的比例很大，超过60% [38］.它们的比例随H的增加而增加₂/公司₂H₂投加促进了富含水解菌和产酸菌的微生物群的发展，提高了甲烷产量和纯度。所有对微生物分析结果的进一步讨论都集中在最丰富的asv与亲属 ．38个asv代表了所有样本中最丰富的成员。在两个反应器中探测到的最丰富的属的演化在图中以属水平的热图表示4 (b)．

Unclassified_Bacteroidetes Romboutsia，Unclassified_Candidatus_Cloacamonas，生丝微菌属,分枝杆菌是两个反应堆的主要属．Unclassified_Bacteroidetes，已知参与AD过程中多糖和蛋白质水解步骤[39，在所有实验期间，两个反应堆的平均浓度均为7%。Romboutsia，称为同质醋酸原[40的相对丰度在实验过程中不断从5%增加到9%。然而，记录的增长Romboutsia在实验试验中发现的低浓度醋酸盐似乎不能证实这一点。这可能是由于在形成甲烷的过程中，与乙酸取样和测量间隔相比，乙酸碎屑的乙酸消耗动态更快。另一个最丰富的细菌属是生丝微菌属， R1和R2分别从3.9%增加到7.1%和2.1%增加到6.4%。属于这一属的细菌已知与产甲烷菌合作(即，甲烷八叠球菌属)同时反硝化及产甲烷[41]和上述的Romboutsia(相对丰度从5.8%上升到8.7%)₂也通过同质醋酸生成。此外，成员属于Gordonia在两个反应器中都增加了(在r1中从3%增加到9%，在R2中从3%增加到8%)。已知这些细菌能够降解环境污染物，如多环芳烃[42]通常存在于污水活性污泥中[43］.

3.5.2。古细菌社区组成

在古菌群落格局中，共鉴定出广古菌(98%)和Woesearchaeota(1.5%) 2个门和8个科。在图5(一个)，所有样本中含量最多的科为Methanobacteriaceae(16%-75%)、Methanoregulaceae(2%-74%)和Methanospirillaceae(3%-76%)。根据一般水平的热图(图5 (b))，五个属，即:Methanolinea(3% - -74%),甲烷细菌属(8% - -73%),Methanobrevibacter(0 - 15%),Methanospirillum(0 - 21%),Methanothrix(0-15%)，可以认为是每个样品丰度超过90%的核心群落，并确认了其在消化器中的关键作用(古菌属水平的相对丰度如图所示)S4补充资料)。众所周知Methanolinea，甲烷细菌属，Methanobrevibacter,Methanospirillum是最常见的氢养产甲烷菌[38，44，因为它们有能力清除H₂保持低pH值。

在古菌群落中，Methanothrix(也称为Methanosaeta)，与之100%相似Methanothrix soehngenii(45，46]为唯一检出的乙碎屑甲烷菌(R1为5.5%，R2至VIII_a为4.5%)。总的来说，这些结果有力地证实了氢养产甲烷菌在两种体系中古菌群落中的优势地位，表明H₂加药是促进氢养菌而非乙酰碎屑产甲烷菌生长的有效途径。

值得注意的是，氢养产甲烷菌在H₂剂量。更具体地说，是最丰富的属Methanolinea除R1_VIII_c和R2_VIII_c外，大多数样本中都存在。NDMS结果显示，除这两个样本外，其余样本均聚在一起。第二丰富的属是甲烷细菌属，甲烷细菌属palustre它利用了H₂/公司₂的产量和/或甲烷产量[47］.随着H的增加，其丰度逐渐增加₂/公司₂显示其在沼气升级中的作用。

4.结论

从所进行的实验中可以得出以下结论:(i)其他研究已经发现[19，即化学计量数H₂/公司₂比(4:1)不足以完成CO₂转换为CH₄并在沼气中实现有趣的低二氧化碳比例;这也很可能受到H的影响₂它决定了气体在液相中的扩散。优化氢气传递工艺需要进一步的研究;(ii)增加H₂/公司₂比例为7:1时，可以有效地最大化CO₂转化以生产主要由甲烷组成的沼气(最大90.3%);(3)增加H的供应对污泥降解没有负面影响₂，同时观察到显著的碱度消耗。为了不损害这一过程，至关重要的是要确保有机进水能够重新吸收所消耗的碱度;这一进程的效率是通过发展一个主要由下列人员组成的专门社区来确保的甲烷细菌属，Methanobrevibacter，Methanospirillum(氢营养产甲烷菌)、同质醋酸菌、水解菌和产酸菌，由于富集策略;在H (v)₂在同一时期，两个平行的反应堆产生不同的甲烷速率，但显示出相似的趋势。这个实验的结果是相当稳定和可重复的，但需要进一步的研究集中在这一主题，以评估该过程的性能，同时引入高浓度的氢，是如何易受一般在厌氧消化器中建立的微小差异的影响。

数据可用性

所有用于支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者要感谢Nadia Margariti和DISAT实验室(米兰比卡大学)对实验室活动的支持。

补充材料

表S1: R1与R2比较的Mann-Whitney检验结果:两个反应器的显著性值、检验样本总数、平均秩。拒绝null假设的情况用灰色突出显示。表S2: R1和R2反应器相比较的Kruskal-Wallis检验结果:显著性值、被检验样本总数、检验统计量。拒绝null假设的情况用灰色突出显示。表S3:反应器R1和R2相多次比较的Dunn 's两两检验(Bonferroni校正):显著性值拒绝null假设的情况用灰色突出显示。图S1:不含H的启动阶段甲烷产量₂加法，R1和R2都适用。表S4:来自两个平行CSTR厌氧消化池中16个样本的阅读和扩增序列变异(ASV)分布。图S2:平行厌氧消化反应器中R1、R2细菌群落和(B)古菌群落的16S rRNA基因分析得到的ASV稀化曲线。图S3:在多个采样点，两个平行反应器属水平的细菌相对丰度。图S4:两个平行反应器在多个采样点属水平古菌的相对丰度。（补充材料）

参考文献

1. M. Muntan, D. Guizzardi, E. Schaff, M. Crippa, E. Solazzo, J. Oliver等，石化有限公司₂世界所有国家的排放- 2018年报告，欧盟出版办公室，2018。视图:出版商的网站
2. J. Foley, D. de Haas, K. Hartley，和P. Lant，“替代废水处理系统的生命周期综合清单”，水的研究，第44卷，第5期。5, pp. 1654-1666, 2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. O. W. Awe, Y. Zhao, A. Nzihou, D. P. Minh, N. Lyczko，“沼气利用、净化和升级技术综述”，废物和生物质定价，第8卷，第2期2, pp. 267-283, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. R. Muñoz, L. Meier, I. Diaz，和D. Jeison，“沼气升级的物理/化学和生物技术的最新进展综述”，环境科学与生物技术评论第14卷第2期4, pp. 727-759, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
5. N. Alfaro, M. Fdz-Polanco, F. Fdz-Polanco，和I. Díaz，“陶瓷膜生物反应器用于H₂和有限公司₂”,生物资源技术， 2018, vol. 258, pp. 142-150。视图:出版商的网站|谷歌学者
6. G. Guandalini, M. Robinius, T. Grube, S. Campanari, D. Stolten，《从风能和太阳能到天然气的长期潜力:意大利的国家分析》，国际氢能杂志，第42卷，第2期19, pp. 13389-13406, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. M. Carmo, D. L. Fritz, J. Mergel，和D. Stolten，“PEM水电解的综合综述”，国际氢能杂志第38卷第2期12, pp. 4901-4934, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. C. Y.戈麦斯，V. Eroglu和P. A. Wilderer，“用FISH和CSLM方法处理合成污水的嗜冷和嗜中温颗粒污泥中鉴定乙酰化和氢养产甲烷菌”，微生物学快速方法与自动化杂志， vol. 17, pp. 135 - 153,2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. Luo G.和I. Angelidaki，“厌氧反应器中含富氢营养产甲烷培养物的综合沼气升级和氢利用”，生物技术和生物工程，第109卷，第2期。11, pp. 2729-2736, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. I. Bassani, P. G. Kougias, L. Treu, H. Porté， S. Campanaro，和I. Angelidaki，“用于非原位生物气升级的嗜热上流式反应器中氢分散的优化”，生物资源技术， vol. 234, pp. 310-319, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. P. G. Kougias, L. Treu, D. P. Benavente, K. Boe, S. Campanaro，和I. Angelidaki，“不同反应器系统的非原位沼气升级和增强”，生物资源技术， 2017, vol. 225, pp. 429-437。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. V. Corbellini, P. G. Kougias, L. Treu, I. Bassani, F. Malpei，和I. Angelidaki，“在两级高温反应器中的混合沼气升级”，能源转换与管理，第168卷，第1-10页，2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
13. 罗国强，谢磊，周青，安杰利达基，“厌氧反应器中氢的同时利用和沼气的原位升级”，生物技术和生物工程，第109卷，第2期。4, pp. 1088-1094, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. I. Angelidaki, L. Treu, P. Tsapekos等，“沼气升级和利用:现状和前景”，生物技术的进步第36卷第2期2，第452-466页，2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. L. Rachbauer, G. Voitl, G. Bochmann，和W. Fuchs，“滴床反应器中氢营养群落的生物沼气升级能力”，应用能源， 2016, vol. 180, pp. 483-490。视图:出版商的网站|谷歌学者
16. “中空纤维膜基的H₂厌氧反应器中高效就地沼气升级的扩散应用微生物学及生物技术第97卷第1期8, pp. 3739-3744, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. S. Savvas, J. Donnelly, T. Patterson, Z. S. Chong, and S. R. Esteves，“CO的生物甲烷化₂在一种新型生物膜塞流反应器中:高速率和低寄生能量过程，应用能源， vol. 202, pp. 238-247, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. M. Peprah, P. G. Kougias, P. Tsapekos, L. Treu, S. Campanaro，和I. Angelidaki，“使用膜作为气体扩散装置的高温反应器的非原位沼气升级”，刊于第16届IWA世界厌氧消化大会摘要，第3-5页，代尔夫特，荷兰，2019。视图:谷歌学者
19. L. M. Agneessens, L. D. M. Ottosen, N. V. Voigt等，“利用脉冲H进行原位沼气升级₂补充:甲烷菌适应与无机碳水平的相关性生物资源技术，第233卷，第256-263页，2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. R. Wahid, D. G. Mulat, J. C. Gaby, and S. J. Horn， " H₂:有限公司₂比和H₂原位生物气升级过程中甲烷含量和微生物群落组成的供给波动对生物燃料的生物技术，第12卷，第2期1, pp. 1 - 15, 2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
21. V. Corbellini, A. Catenacci，和F. Malpei，“集成到污水处理厂的氢养型沼气升级:富集策略”，水科学与技术，第79卷，第5期。4, pp. 759-770, 2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. APHA, AWWA和WEF，水和废水检验的标准方法，百元加法，美国公共卫生协会，美国水工程协会和水环境联合会，2010年。
23. CTI -沼气池厌氧合成气，每一种食物都有一种可消化的厌氧菌和营养基质， UNI - Ente italy di normazone, 2018。
24. 王琪，G. M. Garrity, J. M. Tiedje, J. R. Cole，“Naïve贝叶斯分类器快速将rRNA序列分配到新的细菌分类中，”应用与环境微生物学，第73卷，第2期16，页5261-5267,2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
25. J. A. Huber, D. B. M. Welch, H. G. Morrison等，“深海生物圈中的微生物种群结构”，科学第318卷第318期第2页，第2 - 3页，2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
26. A. L. Gagliano, M. taglivia, W. D'Alessandro, A. Franzetti, F. parelo，和P. Quatrini，“如此接近，如此不同:地热通量在邻近地点形成不同的土壤微生物群落，”地球生物学第14卷第2期2, pp. 150-162, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
27. B. J. Callahan, P. J. McMurdie, M. J. Rosen, A. W. Han, A. J. A. Johnson, S. P. Holmes，“DADA2:来自Illumina amplicon数据的高分辨率样本推断”，自然方法，第13卷，第2期7, pp. 581-583, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
28. T. Kern, J. Theiss, K. Röske，和M. Rother，“商业厌氧消化器中氢代谢的评估”，应用微生物学及生物技术号，第100卷。10, pp. 4699-4710, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
29. B. Demirel和P. Scherer，“乙酰营养和氢营养产甲烷菌在生物质厌氧转化为甲烷中的作用:综述”，环境科学与生物技术评论，第7卷，第5期2，第173-190页，2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
30. R. Conrad，“氢对甲烷产生的贡献以及产甲烷土壤和沉积物中氢浓度的控制”，《微生物生态学第28卷第2期3，第193-202页，1999。视图:出版商的网站|谷歌学者
31. U. Frimmer和F. Widdel，“产甲烷细菌对乙醇的氧化”，档案的微生物学，第152卷，第2期。5，第479-483页，1989。视图:出版商的网站|谷歌学者
32. Liu R.， Hao X.， Wei J.， " effect of homoacetogenesis on heterotrophic methane production with外源H .，₂/公司₂参与进来。”化学工程杂志，第284卷，第1196-1203页，2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
33. 王伟，谢磊，罗刚，周青，安杰利达基，“焦炉气生物甲烷化和原位沼气升级厌氧反应器性能及微生物群落分析”，生物资源技术， vol. 146, pp. 234-239, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
34. C. Sundberg, W. A. al - soud, M. Larsson等人，“21个全规模沼气池中细菌和古菌丰度的454焦糖测序分析，”《微生物生态学第85卷第1期3, pp. 612-626, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
35. J. Cardinali-Rezende, R. a . T. P. D. S. Nahat, C. W. G. Moreno等，“Halomonas sp. HG01的基因组序列草案，一种聚羟基烷酸盐富集菌株，从秘鲁分离，”基因组的公告，第4卷，第4期。1, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
36. Xie X.， Liu N.， Yang B. et al.，“Illumina MiSeq测序对不同结构染料水解酸化反应器中微生物群落的比较，”国际生物退化和生物降解，第111卷，第14-21页，2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
37. 牛涛，周志刚，沈旭东等，“溶解氧对微好氧水解污泥原位还原性能和微生物群落结构的影响，”水的研究，第90卷，第369-377页，2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
38. “厌氧消化微生物群落与过程功能的关系:补充问题:水微生物学”，微生物学的见解， 2015年，第8s2卷。视图:出版商的网站|谷歌学者
39. I. Bassani, P. G. Kougias, L. Treu，和I. Angelidaki，“在中温和高温条件下，通过两级连续搅拌槽反应器的氢养型甲烷生成进行沼气升级”，环境科学与技术，第49卷，第49期。20, pp. 12585-12593, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
40. L. M. M. Agneessens，《小的力量:厌氧消化过程中微生物的氢气转化为甲烷》，[博士论文]2018年，奥尔胡斯大学。
41. a . Fesefeldt, N. C. Holm，和C. G. Gliesche，“污水处理厂及其接收湖sp .的遗传多样性和种群动态”，水科学与技术，第37卷，第2期4-5页，113 - 116,1998。视图:出版商的网站|谷歌学者
42. O. Drzyzga，“Gordonia的优势和劣势:一个新兴的具有日益增长的生物技术潜力的属的综述”，微生物学评论第38卷第2期4, pp. 34,2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
43. a . Raheem, V. S. Sikarwar, J. He等，“污水污泥可持续处理和资源化利用的机遇与挑战:综述，”化学工程杂志， 2018, vol. 337, pp. 616-641。视图:出版商的网站|谷歌学者
44. T. Hori, S. Haruta, Y. Ueno, M. Ishii, Y. Igarashi，“嗜热厌氧消化池中挥发性脂肪酸浓度对产甲烷生物种群的动态变化的响应”，应用与环境微生物学第72卷第2期第2页，1623-1630,2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
45. M. S. M. Jetten, a . J. M. Stams, a . J. B. Zehnder，“醋酸产甲烷:对Methanothrix soehngenii和Methanosarcina spp中醋酸代谢的比较”，《微生物学字母第88期3-4，页181-197,1992。视图:出版商的网站|谷歌学者
46. Liu Y.和w.b. Whitman，“产甲烷古菌的代谢、系统发育和生态多样性”，纽约科学院年报，第1125卷，第1125号1，页171-189,2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
47. G. Zellner, K. Bleicher, E. Braun等人，“泥炭沼泽中一种新的中亲微生物，利用酒精的甲烷菌，palustre spec11 . Methanobacterium palustre，”档案的微生物学号，第151卷。1，页1 - 9,1988。视图:出版商的网站|谷歌学者
48. I. Bassani, P. G. Kougias, I. Angelidaki，“嗜热颗粒UASB反应器中原位沼气升级:影响氢传质速率的关键因素”，生物资源技术，第221卷，第485-491页，2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
49. G. Luo和I. Angelidaki，“粪便和乳清的共同消化，通过添加氢气进行原位沼气升级:过程性能和微生物的见解，”应用微生物学及生物技术， vol. 97, pp. 1373-1381, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者

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