分析产烷生物和Actinobacterium主导的嗜热微生物群落Electromethanogenic Biocathode

文摘

Electromethanogenesis指甲烷的实验合成有限公司₂biocathodes。在electromethanogenic系统利用嗜热微生物宏基因组分析和定量实时聚合酶链反应和荧光原位杂交表明biocathode微生物群是由产烷生物Methanothermobactersp.应变EMTCatA1 actinobacteriumCoriobacteriaceaeEMTCatB1 sp.压力。RNA序列被用来比较转录组的每个菌株产甲烷biocathodes与在一个开放的电路和甲烷生成抑制剂2-bromoethanesulfonate(想)。产烷生物的基因相关hydrogenotrophic甲烷生成具有高度表达的方式下所观察到的类似H₂召集条件。actinobacterium,基因的表达谱编码multiheme c -型细胞色素和膜结合氧化还原酶直接建议actinobacterium占用电子的电极。在这两种菌株,各种应激相关基因通常诱导开路biocathodes和biocathodes想。这项研究提供了一个分子库存的优势种electromethanogenic biocathode功能的见解,因此代表了第一个multiomics表征的electromethanogenic biocathode。

1。介绍

Electromethanogenesis指的是实验的合成甲烷(CH₄从二氧化碳(有限公司)₂在实验系统的biocathodes) (1]。在这样的系统中,催化阴极表面的微生物存在通常从电极和减少利用电子有限公司₂。因为这些biocathodes使高效电能转化为甲烷,应用前景相关的可再生电力转换(权力气体)和有限公司₂提出了利用(2,3]。

Hydrogenotrophic产甲烷菌,尤其是那些属于家庭Methanobacteriaceae,似乎在electromethanogenesis发挥主要作用,通常发现的主要产烷生物biocathodes [1,4,5]。最近的研究biocathodes接种纯净cocultures显示电极的电子传递途径产甲烷菌。例如,直接从负极化电极电子吸收了产烷生物的家庭Methanobacteriaceae,即iron-corroding甲烷细菌属例如archaeon应变IM1 [6]。虽然一些产甲烷菌,包括产甲烷球菌属maripaludis,缺乏这种能力7),如氢化酶和酶heterodisulfide还原酶复杂m . maripaludis(7- - - - - -9)吸附在阴极表面已被证明催化生产可溶性电子介质如H₂甲酸和使用电子的电极,可反过来被产甲烷菌利用。这样的介质也可以由其它微生物能够直接的电子吸收,如硫酸iron-corroding减速器Desulfopila corrodens应变IS4 [10,11]。

尽管获得的基本知识定义的文化系统,对于实际应用来说,重要的是要理解机制的electromethanogenesis multispecies biocathodes微生物协会丰富。描述这些物种构成的功能预计将导致新催化剂的识别,包括产甲烷菌和其他物种的电子吸收,以及微生物与辅助功能(例如,氧气拾荒者)和有害物种(例如,不良产品的生产商)。这些微生物可能代表潜在目标的功能性工程biocathodes更好的性能和鲁棒性。在biocathodes两种类型,即一个公司₂修复有氧biocathode和biocathode主要生产醋酸、宏基因组分析揭示了表面的成分和代谢功能微生物协会(12- - - - - -15]。此外,活跃的代谢途径,包括那些参与有限公司₂固定和电子转移,和可能的种间相互作用通过metatranscriptomic推断和metaproteomic分析(12,15),提供重要的见解原位函数的各种社区成员出席这些biocathodes。

我们之前报道的嗜热微生物的识别财团能够催化electromethanogenesis 55°C阴极处于−0.35 V和标准氢电极(她)(16]。结果表明,甲烷生成和电子消费biocathode依赖公司的存在₂和强烈抑制甲烷生成抑制剂2-bromoethanesulfonate(想)。这些发现表明,电子从负极主要是消耗甲烷生成。初步评估相关的16 s rRNA克隆库建议相关产烷生物Methanothermobacter连同其他几个细菌物种,丰富biocathode表面。因此,在这项研究中,我们的目标是描述这个财团的主要成分和打算洞察electromethanogenesis过程中各自的角色。

2。材料和方法

2.1。反应器设计和操作

的具体特点和操作条件在本研究中使用的反应堆通常是在我们之前的研究中描述的相同(16]。使用250毫升玻璃瓶一院制的反应堆建造。两院的反应堆由两个相同的300毫升玻璃瓶隔开质子交换膜预处理(12.5厘米²全氟磺酸117年,杜邦公司,美国德威尔明顿)也被建造。阳极和阴极是由纯碳布( ,TMIL有限公司、茨城、日本)。每个电极连接到电路通过钛丝(直径0.5毫米,阿尔法蛇丘,病房,妈,美国),这是直接固定在电极的结束没有胶水。电极和钛线之间的内部阻力小于3.0Ω。所有反应堆都与丁基橡胶瓶塞密封和铝海豹,和他们的顶部空间充满了N₂/公司₂(80:20)。,接种的反应堆运行在55°C馈料式模式,在介质与新鲜交换介质在当前生产减背景水平。电磁搅拌器是不断用于孵化期间每个室提供充分的混合。

2.1.1。一院制的反应堆

积极建设biocathodes首次发起一院制的反应堆。最初的微生物的来源是既存的废水实验反应堆,原本接种从石油储层地层水(16]。25毫升的培养液和125毫升无菌无氧介质包含KH的0.136 g / L₂阿宝₄NH 0.54 g / L₄MgCl Cl, 0.2 g / L₂h·6₂CaCl啊,0.147 g / L₂h·2₂NaHCO啊,2.5 g / L₃沃尔夫,10毫升/ L的矿产解决方案补充0.8 g / L醋酸钠被添加到反应堆。恒定电压为0.7 V应用使用数字电源(3645阵列,阵列电子,南京,中国)。一个固定的外部阻力的1.0Ω被连接到电路。通过电阻的电压记录每5分钟使用万用表(34970 a,安捷伦科技,圣克拉拉,CA,美国)。

2.1.2。两院的反应器的操作

一院制三馈料式循环反应器后,biocathode轻轻冲洗使用无菌厌氧培养基,然后转移到阴极室的两院的反应堆进行进一步的分析。在此设置中,每个阳极和阴极室挤满了200毫升的厌氧培养基(没有醋酸钠)。阳极,使用了一种新的非生物电极。Ag / AgCl参比电极(1 M氯化钾)+ 0.20 V的潜力与一个她在55°C是插入到阴极室。biocathode、阳极和Ag / AgCl电极被连接到一个稳压器(hsv - 110、Hokuto电工、日本)工作,计数器,分别和参考电极。以恒定的潜力biocathode即将−0.5 V和一个她。馈料式的反应器操作模式。在这项研究中,biocathodes牺牲了核酸提取和微观分析三个馈料式周期后两院的反应堆。

2.2。分析测量

反应堆顶部空间中的气体成分分析了使用气相色谱仪(gc - 2014配备了ShinCarbon圣柱;日本岛津公司、日本京都)为每个实验。压力在反应器顶部空间使用数字压力传感器测量(AP-C40;日本大阪,日本基恩士)。在两院的反应堆,循环伏安法(CV)使用标准三电极系统进行。稳压器(hsv - 110)结合使用以下参数:平衡时间的99年代,扫描速率为1 Mv / s,和扫描范围0.7−−0.2 V和一个她。

2.3。Metagenome分析

biocathode-associated全基因组鸟枪测序的微生物群落,组装和注释描述的metagenome已经在先前的报道17,18]。DNA提取两个独立biocathodes积极生产甲烷在−0.5 V和一个她使用DNeasy PowerMax土壤工具包(试剂盒、希尔登,德国)。提取的DNA测序的Illumina公司2000年HiSeq编曲(150 bp paired-end排序)。适配器和质量调整的执行读取使用Cutadapt(1.8.3版)(19]。16 s rRNA基因扩增子biocathode-associated社区的测序使用提取的dna作为模板,如前所述[20.]。

大约3.95亿削减读,大约60 gigabase双(英镑),是用于宏基因组装箱。MetaPhlAn2工具(2.2.0版)(21)被用来揭示biocathode-associated财团的组成未装配的宏基因组读取。组装、读取第一downsampled 400 megabase双(Mbp);因此,序列相对较小的物种的减少。然后,读取装配使用天鹅绒包(1.2.10版)(22),其次是填缝使用封口机工具(ver.2.0.2) [23使用REAPR工具)和质量检查(1.0.18版)(24]。支架是注释使用Prokka(1.13版)(25]。代谢途径的分析,在草案基因组蛋白质编码映射到京都基因和基因组的百科全书使用KEGG通路数据库映射器(26]。淡紫色用于对齐linealized基因组的27]。

2.4。定量实时聚合酶链反应(qPCR)

shotgun-sequenced DNA和DNA样本提取其他六个独立biocathodes qPCR分析被用作模板,进行LightCycler 480系统(罗氏诊断,曼海姆,德国)。类属特异性的引物和探针设计的Yu et al。28)被用于订单的产烷生物Methanobacteriales(例如,Methanothermobactersp.应变EMTCatA1)、总古生菌和细菌总数(表中列出S1)。引物和探针具体Coriobacteriaceaesp.应变EMTCatB1设计根据应变的16 s rRNA基因序列及其三个密切相关的序列(FJ638596、KM819482 AY753404)使用ARB程序(29日]。DNA浓度量化使用一个量子位3.0荧光计(热费希尔科学)会同量子位dsDNA海关化验设备(热费希尔科学)。每10μL反应混合物由1μL模板DNA, 300海里的特定的引物,TaqMan探测器,5的200海里μL预混料的Taq(豆类,京都,日本),交货和PCR-grade消毒过的水。PCR扩增进行如下:最初的30年代的孵化在95°C, 40周期的变性为每个在95°C, 5 s和退火/扩展30年代60°C。的放大效率primer-probe集是1.80 - -1.86。三个独立对每个样本进行了试验。为每个测定标准曲线建立了928个基点使用合成DNA片段包含目标区域的16 s rRNA基因Methanothermobactersp.应变EMTCatA1(古细菌和Methanobacteriales化验)和Coriobacteriaceaesp.应变EMTCatB1(细菌和Coriobacteriaceae物种化验)。

2.5。微观分析

荧光原位杂交(鱼)和扫描电子显微镜(SEM)进行。鱼是用来识别Methanothermobacter有关的产甲烷菌使用探针具体订单的16 s rRNA Methanobacteriales (MB311、表S1)[30.]。提高调查的渗透产甲烷菌pseudomurein细胞壁,鱼过程修改包括4%的酶预处理( )paraformaldehyde-fixed样本与重组pseudomurein肽链内切酶(rPeiW),如前所述[31日]。调查具体的16 s rRNACoriobacteriaceaesp.应变EMTCatB1 (B1_648表S1)使用ARB程序设计28]。preevaluated探针的特异性和有效性在网上使用席尔瓦TestProbe(3.0版)(32)和mathFISH工具(33]。革兰氏阳性细胞壁透化作用的放线菌,样本固定在96%乙醇(没有甲醛固定)和使用10毫克/毫升的溶菌酶(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)60分钟,其次是消化与10 U /毫升achromopeptidase (Sigma-Aldrich)杂交前30分钟34]。探针都贴上Alexa萤石488(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国),和5μM SYTO59(热费希尔科学)是用于对比染色。分析了显微图使用斐济[35)估计的大小分布在阴极表面微生物细胞。SEM分析,电极的第一次被固定为2.5% ( )戊二醛和2% ( )多聚甲醛在0.1磷酸缓冲溶液(PBS, pH值7.4)和加工如前所述16]。

2.6。RNA提取和转录组分析

RNA样本提取六个独立biocathodes产生甲烷积极在−0.5 V和一个她。在这种实验装置,biocathodes被建立集群分成两三个实验条件,即闭路(CC),开路(OC),和想条件。为此,两个biocathodes直接进行RNA提取(CC条件),而其他两个biocathodes之前留在开路5 h RNA提取(OC条件)。在接下来的两个biocathodes,想是anoxically注入到阴极室的最终浓度12毫米,将潜在的和biocathodes孵化−0.5 V和一个她以前5 h RNA提取(想条件)。在无菌碎,biocathodes救生员保护土壤溶液中浸泡(试剂盒)稳定rna。那时总RNA提取使用RNeasy PowerSoil总RNA工具包(试剂盒)。残余DNA被DNase已经没有DNA治疗使用涡轮细胞工具包(热费希尔科学)。从提取的总RNA,信使RNA被移除rRNA丰富使用Ribo-Zero工具包(Illumina公司、圣地亚哥、钙、美国)。丰富mRNA然后放大使用MessageAmp II-Bacteria RNA扩增工具包(热费希尔科学)和进一步转化为互补使用上标双链cDNA合成装备(热费希尔科学)。互补脱氧核糖核酸被用来准备一个测序图书馆使用TruSeq滞留mRNA图书馆准备工具包(Illumina公司)。 Metatranscriptome sequencing was performed by using an Illumina HiSeq 2500 system (Illumina), which yielded 100 bp pair-end reads totaling 51.7–108.3 million reads (TableS2)。欧陆坊科技有限公司建立相关的库和执行所有的测序反应。

RNA-seq读取使用Trimmomatic过滤站(0.36版)(36)和对齐的基因组Methanothermobactersp.应变EMTCatA1和Coriobacteriaceaesp.应变EMTCatB1 (AP018336和BDLO01000001 DDBJ / EMBL的基因库数据库)使用BWA(0.7.17版)(37]。读取映射到各自的参考基因组的数量是计算使用SAMtools [38),如表所示S3。Kaiju(版本是1.7.2)[39)是用于未映射读取的分类任务。StringTie (1.3.4d版)(40)是用于组合映射读取到成绩单和计算的相对丰度组装记录。统计分析使用磨边机包(3.16.1版)(41]。记录每百万(TPM)被用于规范化阅读项比较转录组的基因表达水平在获得相同的条件(表S4和S5)。此外,修剪的意思 - - - - - -值(TMM)被用来规范每一个基因的表达水平在不同条件下的转录组(表S6和S7)。似然比检验是用来确定基因表达差异的统计学意义。Benjamini-Hochberg调整是用于控制错误发现率(罗斯福)由于多重假设检验。为此,被认为是差异表达的基因,如果表达水平改变了超过两倍( )罗斯福是< 0.05。层次聚类平均使用皮尔逊相关链接进行不同指标,截止距离,或不同,是0.25。

3所示。结果与讨论

3.1。宏基因组分析的微生物Biocathodes的财团

biocathodes受到宏基因组分析来描述微生物组成和表面微生物的代谢潜力财团。尽量减少任何潜在的影响由于样本变异,DNA分离操作的两个独立的biocathodes超过60天,准备−0.5 V和一个她的潜力。随后的甲烷生产速度(20.2和24.2更易与CH₄/天/厘米²)和简历扫描显示,两biocathodes electromethanogenic活动相似(图S1A)。此外,16 s rRNA测序结果表明,微生物组成的两个biocathodes也相似(图印地)。因此,两个biocathodes结合的DNA在图书馆准备一步whole-metagenome鸟枪测序。

Illumina公司的组装和装箱顺序读取显示,该财团的metagenome几乎完全由序列来自两个优势种(图1(一))。进一步重叠群装配,其次是填缝,导致循环通风的重建这两个物种的基因组(图S2)[17,18]。标记基因的系统发育分析表明,一个物种是一个密切相关的archaeon产甲烷菌属Methanothermobacter(这样命名Methanothermobactersp.应变EMTCatA1)。这个物种的基因组被编码酶所需hydrogenotrophic甲烷生成以及有限公司₂固定途径,通过不完全还原柠檬酸循环。基因组编码没有任何明显的相同器官甲酸运输车或细胞色素。特别是,Methanothermobactersp.应变EMTCatA1密切相关m . thermautotrophicus应变∆H,高温厌氧产甲烷菌的生物模型,共享99%和98% 16 s rRNA的身份和序列mcrA基因,分别。此外,的基因组Methanothermobactersp.应变EMTCatA1高度相似的基因组m . thermautotrophicus应变∆H,分享它的大部分基因的m . thermautotrophicus应变∆H基因几乎相同的订单(图S3)。另一个物种鉴定是一种细菌放线菌的远亲家庭Coriobacteriaceae(命名Coriobacteriaceaesp.应变EMTCatB1)(图S4)。基因组的草案Coriobacteriaceaesp.应变EMTCatB1发现同源染色体编码的酶需要无氧呼吸(减少亚硝酸盐),以及许多公认的氧化还原蛋白质(例如,18 c型细胞色素)。这些结果大多被意想不到的,因为16 s rRNA基因扩增子测序表明虽然Methanothermobacter有关的产烷生物被证实是一个主要古细菌组成,细菌更多样的细菌(图组成的人口印地)。事实上,在16 s rRNA基因扩增子,actinobacterial物种只代表序列(图的比例相对较小印地)。低估在16 s rRNA actinobacterial物种基因的扩增子曾被报道,可能是由于这些基因组的高GC含量(42,43]。例如,GC含量是67.2%的CoriobacteriaceaeEMTCatB1 sp.压力。

3.2。qPCR Biocathode分析微生物财团

检查这两个物种的丰度biocathode表面,16 s rRNA基因复制数量估计使用qPCR,类属特异性的引物(图1 (b))。除了shotgun-sequenced DNA (MG图1 (b)),DNA样本提取biocathodes六个独立的electromethanogenic反应堆(命名为C1 ~ C6)和分析(C1-C6图1 (b))。简历确认的能力(图六biocathodes催化电化学反应S5),这是与以前报道的结果一致(16]。证实了表面微生物殖民SEM(图S6)。在20个pg的DNA,古细菌16 s rRNA基因的拷贝数不等 来 。16 s rRNA基因的拷贝数的顺序Methanobacteriales(包括属Methanothermobacter)范围从 来 ,与平均51%的复制数字总古细菌16 s rRNA的基因。细菌16 s rRNA基因复制数量不等 来 。为Coriobacteriaceae有关的物种,基因复制数量不等 来 ,这与细菌总数的52%的平均16 s rRNA基因拷贝数。应该注意的是,16 s rRNA基因的引物可能高估了Methanobacteriales的丰度,因此,古生菌基因组的草案Methanothermobactersp.应变EMTCatA1,包含16 s rRNA基因的两个副本。尽管如此,绝对支持的16 s rRNA基因拷贝数的量化biocathode表面上的两个物种的统治地位。

3.3。鱼分析Biocathode微生物细胞的表面

鱼分析进一步证实了所代表的两个物种的主要成分的微生物种群在biocathode表面(图2)。数字化的显微图显示,大约26%的产甲烷菌的微生物标记探针的家庭Methanobacteriales,从而针对应变EMTCatA1(数字2(一)-2(c)),和68%的cathode-associated微生物与探测目标的标签Coriobacteriaceaesp.应变EMTCatB1(数字2(e) -2(g))。特别是细胞标记探针定位EMTCatA1相对较长的丝状细胞或棒,平均长度为2.8μ米,与未标记细胞相比,平均长度为1.5μm(图2(d))。这一发现与先前的报道是一致的Methanothermobacter物种(44,45]。相比之下,用探针定位标记的细胞EMTCatB1-labeled视杆细胞平均长度为1.2μm大多是短于未标记细胞,平均长度为2.5μm(图2(h))。可以得出结论,因此,它的表面社区biocathodes主要是由两种细胞类型:长棒或丝状细胞(通常超过1.6μ米)的Methanothermobactersp.应变EMTCatA1和相对短棒(通常短于1.6μ米)的Coriobacteriaceaesp.应变EMTCatB1(数字2(d)和2(h))。

3.4。转录组分析的优势种Biocathode表面

Metatranscriptomes biocathodes在CC, OC,想条件进行分析,以了解各自的角色electromethanogenesis的优势种。正如我们以前观察到(16),甲烷生成停止biocathodes摄氏度条件下,除了想条件下,甲烷生成和电子消费过程在biocathode(图是被抑制的S7)。metatranscriptomes, 69% - -92%的读取映射到两个物种的基因组(表S2),进一步表明他们主要在biocathode新陈代谢活跃的物种。地图上未标明的读取是分配给不同的类群(图S8)。没有分类单元似乎通常过多在地图上未标明的读取。因此,本研究集中在优势种,未映射读取被排除在进一步的分析。

转录组的概要分析了CC条件下,尤其关注高度对能量代谢相关基因的转录和电子转移来确定候选基因参与electromethanogenesis。层次聚类的差异表达基因(意义标准: , )条件中被用来估计的影响供应电子从阴极和产甲烷活性的生理优势种。

3.4.1。的转录组分析Methanothermobacter sp。应变EMTCatA

为Methanothermobactersp.应变EMTCatA1,相关的mrna hydrogenotrophic甲烷生成是最高度丰富的CC条件下,与15 46 methanogenesis-related基因丰富的记录(表的前10%S4)。值得注意的是,mcrA(tca_01121),mtd(tca_01413),海洋博物馆(tca_01698)编码的同系物methyl-coenzyme M还原酶的亚基(MRI)和两个代数余子式F_420年分别端依赖酶被发现被表达在更大程度上比isofunctional酶的基因(例如,MRII和H₂端依赖酶(图)3)。在密切相关m . thermautotrophicus菌株,MRI和酶的表达参与辅因子F_420年端依赖反应诱导下H₂召集条件(例如,syntrophic cocultures) [46- - - - - -54]。

转录组中Methanothermobactersp.应变EMTCatA1, 146被发现差异表达基因(表S6)。基于层次聚类的微分表达式模式,6个集群的差异表达基因被确定(图4、表S8)。最大的集群(A1-I)由49个基因表达上级CC条件下比在那些想或摄氏度条件下。总的来说,28 A1-I集群假想的蛋白质编码基因的未知函数。A1-IV,第二大集群,包括42基因表达水平想和摄氏度条件下高于CC条件下。A1-IV集群中的八个基因编码的同系物的各种与压力相关的蛋白质,如监护人和水解酶(tca_00660, tca_00698, tca_00826),抗氧化酶,和替代氧化还原蛋白质(tca_00140, tca_00141, tca_00142、tca_00723 tca_00821)(以红色箭头在图4)(表S8)。这可能反映了细胞能量损耗的过程中由于缺乏OC和想条件下的甲烷生成。没有直接相关的基因编码一个明显的相同器官电子吸收被确认。

虽然OC和想条件下甲烷生成停止,methanogenesis-related基因并不符合我们标准的微分表达式。对于其他产甲烷菌,甲烷生成基因的表达被报道是由H₂可用性和没有明显影响治疗,抑制甲烷生成(46,55]。这也是符合甲烷生成的产甲烷菌的至关重要的作用。一个例外是mrtG(tca_01086)编码核磁共振gamma-subunit同族体。虽然这个基因高度表达摄氏度条件下比在其他的条件下(在集群A1-III图4几乎测不出),相关的转录丰度,因此,不太可能有生物学意义(表S8)。

3.4.2。的转录组分析Coriobacteriaceaesp。应变EMTCatB1

为Coriobacteriaceaesp.应变EMTCatB1,基因编码假定的multiheme c -型细胞色素(1 d0125, 1 c0363 1 c0406 1 d0898,和1 c0642),一个镍铁氢化酶(1 c0061 1 c0060, 1 c0059),和甲酸脱氢酶(1 c0408和1 c0407上述1 c0406)被发现是高表达在CC条件下(在前10%丰富的成绩单:表S5和S9)。multiheme c -型细胞色素和膜结合提出了氧化还原酶细胞外电子转移管道组成Thermincola potens,一个exoelectrogenic革兰氏阳性菌(56,57]。此外,基因簇编码的子单元形atp酶(1 d0031-37表S5)是高度转录。

转录组中Coriobacteriaceaesp.应变EMTCatB1, 103个差异表达基因被确定(图5、表S7)。一般的集群组织的差异表达基因是相似的Methanothermobactersp.应变EMTCatA1(图5、表S10)。最大的集群(B1-II),由43基因的高表达水平连铸条件下,反之,第二大集群(B1-V),由38个基因的表达想和摄氏度条件下上级。集群B1-II包含上述基因编码两个multiheme c -型细胞色素(1 d0898和1 c0642)甲酸脱氢酶的氢化酶组成部分(1 c0407)和两个子单元的v形atp酶(1 d0032和1 d0037)(蓝色箭头在图5)(表S10)。这些结果表明,这些基因发挥作用在电子消费biocathode表面。此外,类似于A1-IV集群应变EMTCatA1, B1-V集群由应激相关基因编码同系物的监护人(1 d0043 1 d0806, 1 d0807),抗氧化酶(1 c0451 1 c0554, 1 c0665),和另一个氧化还原蛋白质(1 c0602)(红色箭头在图5)(表S10),这表明细菌是在压力下想和OC条件。

3.5。可能的代谢功能的优势种Biocathode表面

基于我们目前的研究结果和那些从我们之前的研究16),我们调查的可能角色的优势种electromethanogenesis过程。我们得出结论,Methanothermobactersp.应变EMTCatA1负责通过hydrogenotrophic biocathodes甲烷生成的甲烷生成途径,这是操作的方式类似,在H₂召集条件。可能这个产烷生物催化electromethanogenesis通过直接电子从阴极吸收,以前报道的一种现象甲烷细菌属例如archaeon应变IM1 [6)和各种甲烷八叠球菌属物种(58]。然而,这可能不是的Methanothermobactersp.应变EMTCatA1的纯粹的文化m . thermautotrophicus应变∆H,密切相关的Methanothermobactersp.应变EMTCatA1,证明没有催化能力在一个潜在的阴极将高于−0.6 V和一个她16]。只有14个基因的Methanothermobactersp.应变EMTCatA1,其中包括两名CRISPR-associated基因,即tca_01044 tca_01045,没有明显的相同器官m . thermautotrophicus应变∆H(表S11)。尽管这些基因可能带来的能力直接产烷生物电子吸收,我们假定Methanothermobactersp.应变EMTCatA1是hydrogenotrophic产烷生物高度相似m . thermautotrophicus应变∆H和可能无法促进electromethanogenesis本身。

的作用Coriobacteriaceaesp.应变EMTCatB1 electromethanogenesis保持更多的投机。基于基因表达谱,它是可能有的Coriobacteriaceaesp.应变EMTCatB1能够直接从阴极电子吸收通过multiheme c -型细胞色素(例如,那些由1 d0898和1 c0642)编码。电子就有可能进行有关膜结合氧化还原酶,如氢化酶、甲酸脱氢酶。至少,电能从这个电子流的一部分可能是用来创建一个质子动力来驱动通过v型ATP合成ATP酶。此外,NADH:泛醌氧化还原酶(复杂I)可能参与的生成一个质子动力两个基因编码酶的亚基(nuoCD:1 c0337和1 c0336)高度转录CC条件下(表S5)。因此,细胞能量可能耗尽在摄氏度条件下,这与应激相关基因的诱导是相一致的。

3.6。一个可能的Electromethanogenesis Biocathode表面过程的模型

基于我们的研究结果和讨论,人们很容易推测,很大一部分的电子从阴极被发放给质子减少Coriobacteriaceaesp.应变EMTCatB1,导致H₂进化。的Methanothermobactersp.应变EMTCatA1然后消耗H释放₂对于hydrogenotrophic甲烷生成。在Coriobacteriaceaesp.应变EMTCatB1,更高的观察与压力相关的基因的表达在想条件下,表明添加想细菌的生理影响。这个观察可以解释甲烷生成所需的细菌的代谢活动在阴极上。换句话说,hydrogenotrophic产烷生物甲烷生成的减少H₂分压。因此,维持新陈代谢热动力有利。因此,这两个优势种可能是新陈代谢biocathode表面相互依存,执行专性共生的新陈代谢(59),用于催化electromethanogenesis。细菌与家庭Coriobacteriaceae作为占主导地位的物种被发现在另一个biocathode [60),支持在electromethanogenesis认为放线菌发挥作用。

然而,上述模型是高度投机和未来所需的调查。相当大的限制是当前缺乏生理知识占主导地位的物种。特别是,Coriobacteriaceaesp.应变EMTCatB1没有培养之间的近亲物种(图S4),其代谢特性仍主要是未知的。的反应Coriobacteriaceaesp.菌株EMTCatB1想很可能是由于直接影响;即。,BrES was toxic to or metabolized by the bacterium, thereby altering its gene expression pattern. Moreover, as the genome does not encode conserved enzymes for CO₂固定,目前尚不清楚如何阴极上的细菌生长。在这方面,它是合理的Coriobacteriaceaesp.应变EMTCatB1利用乙酸为碳源,这是目前在中只在最初的发展biocathode一院制(反应堆),然后省略从介质(在两院的反应堆)。换句话说,上的细菌可能无法传播biocathode醋酸(没有),但仍然新陈代谢活跃,能够产生H₂。

因此,未来的研究应该执行隔离的优势种,在生化分析(56,57,61年]。这种方法也会有用的检查可能的贡献相对较小的物种,被排除在这项研究中,阐述electromethanogenesis过程。进一步转录组和蛋白质组分析使用不同的条件,如使用不同的电势值,也需要更全面理解biocathode机制。

4所示。结论

小说的主要成分高温浓缩在一个财团electromethanogenic biocathode在本研究的特点。结果表明,该财团的metagenome主要是主导Methanothermobactersp.应变EMTCatA1和CoriobacteriaceaeEMTCatB1 sp.压力。的统治地位的两个物种biocathodes进一步证实使用qPCR和鱼,美国主要的转录组分析在不同条件下biocathodes (CC、OC和想)。基于基因表达谱的hydrogenotrophic产烷生物甲烷生成的那些编码c -型细胞色素和膜结合酶的细菌,这些菌株被建议在甲烷生产和电子吸收功能,分别在electromethanogenesis过程。本研究因此代表第一个multiomics表征electromethanogenic biocathode,先前的研究提供补充信息在不同的实验系统。

数据可用性

生读的metagenome metatranscriptomes, 16 s rRNA基因扩增子序列中的沉积央行(Bank of Japan)读取存档的DNA数据(DDBJ) BioProjects PRJDB8994, PRJDB8993和PRJDB8998分别。

的利益冲突

作者没有直接金融与商业身份的论文中提到的关系可能会导致利益冲突。

确认

作者要感谢Hiroshi Sagara博士(东京大学医学科学研究所)的扫描电镜分析。作者要感谢Enago (http://www.enago.jp)英语复习。本研究支持INPEX公司和日本社会科学(jsp)促进科学研究补助金(C) 17 k07713(小林Hajime)。

补充材料

补充数据(特征metagenome-sequenced biocathodes(图S1),两个优势种的基因组地图(图S2),全基因组排列的Methanothermobactersp.应变EMTCatA1和m . thermautotrophicus应变∆H(图S3),系统发育树的Coriobacteriaceaesp.应变EMTCatB1和其他放线菌(图S4),循环voltammograms的biocathodes electromethanogenic反应堆C1 ~ C6(图S5),代表biocathode表面的扫描电子显微图electromethanogenic反应堆C1 ~ C6(图S6),当前一代和CH₄生产资料使用的biocathodes转录组分析(图七),和分类作业的开拓者RNA-seq读(图S8))和表(细节探针和引物(表S1), RNA序列映射(表S2和S3), TPM -(表S4和S5)和TMM(表S6和S7)规范化阅读数和差异表达基因集群(表S8和S10)转录组的主要物种,这种细胞色素的Coriobacteriaceaesp.应变EMTCatB1(表S9)和基因的Methanothermobactersp.应变EMTCatA1没有出现在m . thermautotrophicus应变∆H(表S11))已公布在网上。(补充材料)

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