载体表面官能团分布对涂层的附着力有影响Methanothermobacter ThermautoTrophicus.

抽象的

各种支撑载体用于厌氧废水处理系统中的甲烷型古氏菌的高密度保留。虽然载体材料和微生物的物理化学性质影响了甲状腺原酸原型的粘附，但有关潜在机制的细节仍然是较差的。我们将七种类型的化学表面改性应用于碳纤维，以阐明粘附性Methanothermobacter ThermautoTrophicus.，一种典型的嗜热氢养甲烷菌。评价了载体表面性质与甲烷菌粘附的关系。m . thermautotrophicus用氢氧化钠、盐酸、氢氧化钠处理后，炭毡的附着力较对照显著提高2.6倍₂所以_4.或na.₂HPO._4.．经处理的碳纤维显示出较低的水接触角，但是观察到载体表面接触角和甲烷化粘附之间的相关性。另一方面，在显示出改善甲烷的粘附性的载体的表面上，-COOH：-OH的比例为1：0.65。用处理过的载体未观察到这种比例没有改善甲烷酮粘附。因此，在粘附中m . thermautotrophicus，官能团丰度是重要的以及物理表面性质，如疏水性。在厌氧消化期间，致氢脱甲酸酯参与活性甲烷化。另外，这些甲状腺原型古代型致甲酸型古代抗体催化剂。因此，通过控制诸如的氢型甲烷的粘附性，将大大改善厌氧消化性能m . thermautotrophicus．

1.介绍

厌氧消化被认为是可持续的技术，而与好氧加工相比，因为它产生最小的成本，同时产生有益的最终产品（例如甲烷和消化溶液）[1］.由于这些产甲烷古菌的生长速度慢于其他菌群中的微生物，这一步骤代表了甲烷生产中的速率限制反应，特别是在启动反应器时[2］.因此，在反应器中具有高密度的甲状腺型古亚亚eA是必不可少的，以确保高效的甲烷发酵过程。

已经研究了各种各样的材料（如玻璃，浮石和树脂）作为微生物支撑载体，以实现厌氧联盟的高密度保留。甲状腺原煤的粘附尤其重要，并进行使用纯甲烷培养的一些粘合实验。Verrier等。[3.[比较肌缺血性甲烷的粘附量（MethanoSarcina mazei.和Methanosaeta concilii.）和致氢营养甲烷（Methanobrevibacter arboriphilicus和Methanospirillum hungatei)用于疏水性不同的载体。易附着的载体表面的状况因产甲烷菌的种类而异[3.］.另外，尽管两者都有甲烷八叠球菌属巴氏细菌和M. concii.是中亲性乙酰营养产甲烷菌，细胞表面性质和有利载体表面条件报道不同[4.］.然而，没有鉴定影响甲烷甲烷的粘附的参数，因为通过这些实验比较了不同材料和表面形状的载体。此外，嗜热甲烷酮的粘附性尚不清楚，因为这些研究中的大多数都集中在嗜培素的膀胱型甲烷上。在厌氧消化中，据报道，在稳定相期间支配的肺促进甲烷酮，但在启动阶段期间发挥重要作用[5.］.因此，通过在初始相中累积载体上的氢脱氢甲烷，据认为可以缩短和稳定甲烷发酵的启动时期。

最近有报道称，产甲烷古菌通过在特定细菌之间直接交换电子而产生甲烷气体[6.］.添加导电碳材料[7.那8.]及矿物[9.那10]促进这个共生。因此，导电载体可以支持高密度的甲状腺原煤，并显着提高厌氧消化的性能。近年来，这种电化学关系的研究有所前进，甲烷型古代甲烷化研究是电极催化剂的研究[11那12］.在该反应中，据认为，甲烷转接直接从电极接收电子并产生甲烷，突出理解甲烷的粘附到电极材料的重要性。

Methanothermobacter ThermautoTrophicus.是一种典型的嗜热氢养产甲烷菌。m . thermautotrophicus拉紧δ.H和Pelotomaculum热普洛伊姆（丙酸氧化细菌）一起活在一起并通过导电纳米线连接[13那14］.此外，m . thermautotrophicus更有可能是一个有前途的阴极催化剂，因为m . thermautotrophicus是高温产甲烷阴极上的优势种[12那15］.

本研究旨在阐明胶粘剂的粘接性能m . thermautotrophicus导电材料。碳毡被用作导电材料，其表面使用各种化学物质处理，然后评估接触角和官能团分布的潜在变化。此外，我们试图通过比较量的数量来阐明参与甲烷化粘附的表面特性m . thermautotrophicus拉紧δ.H连接到每个处理过的载体上。

2。材料和方法

2.1。碳毡载体的化学表面处理

碳毡(car硼®毡;以直径1 cm，厚度0.5 cm的圆柱体为载体。以下化学品被用于改性毡表面:KOH, NaOH, HCl, HNO_3.H₂所以_4.，na₂所以_4.和na₂HPO._4.，蒸馏水作为对照。选择不同的处理方法来比较酸处理(HCl, HNO_3.和h.₂所以_4.)和基本处理(氢氧化钠和KOH)。我们预测，含有与碳亲和高的元素的官能团会在载体上表现出更强的附着。因此，处理含硫(H₂所以_4.和na₂所以_4.)和磷(钠₂HPO._4.）进行高亲和力进行碳。

对于每种处理，通过多个真空脱气，将碳毡完全浸入每种化学物质的1.0米溶液中。使用Findenser和热搅拌器在100℃下回流进行化学表面改性。用蒸馏水洗涤用于分析表面性质的支撑材料，直至洗涤溶液变得中性，然后在干燥炉中干燥（在大气压和湿度下60℃）。用于粘附实验的支撑载体用纯净的水洗涤但不干燥。

２.２.碳毡载体的表面性能分析

使用接触角计（面部CA-DS; Kyowa接口科学有限公司，日本埼玉界面科学有限公司）测量水接触角。傅里叶转化的红外（FT-IR）光谱用于分析通过化学表面改性而改变的碳毡材料上的官能团。将化学改性的碳毡切割并与KBR（Wako Pure Chemical Industries，Ltdms，Japan）的KBR混合：碳毡比为400：100毫克。通过FT-IR在前沿MIR / NIR光谱仪（PerkinElmer Japan Co.，Ltd。，Kanagawa，Japan）分析该混合物。

2.3。粘合实验m . thermautotrophicus应变δ.H

m . thermautotrophicus拉紧δ.H (NBRC 100330)来自NITE生物资源中心(NBRC, Chiba, Japan)。通过溶解0.14 g/L KH制备培养基₂阿宝_4.，0.54克/升NH_4.氯，0.20 g/L的氯化镁₂h·6₂o，0.15克/升的cacl₂h·2₂o，2.5 g / l的Nahco_3.， 0.20 g/L酵母提取物(Difco, Detroit, MI, USA)， 0.80 g/L乙酸钠，0.1 mg/L雷蓝蛋白和微量元素溶液。将5 mL等量的培养基转移到50 mL血清瓶中，用氮气(99.999%)气泡2 min后，加盖丁基橡胶塞，用高压灭菌(120℃20 min)。滤过的维生素溶液，0.5 g/L半胱氨酸- hcl和0.5 g/L钠₂S·9h.₂o通过橡胶塞注射注射器，加入HCl以调节pH至7.痕量元素和维生素溶液被称为NBRC培养基1067.一次打开一次以插入五个处理过的载体，鼓泡用过滤氮气鼓泡气体2分钟，并立即用丁基橡胶塞密封。

5毫升m . thermautotrophicus拉紧δ.用注射器将H培养液接种到准备好的小瓶中。随后，泵入混合气体，使气层具有1.5 atm和H₂ : CO₂80: 20的比例;55℃静培养21 d。

2.4。扫描电子显微镜（SEM）

经过21天的培养后，将支撑载体从培养瓶中取出。将样品用无菌0.9％冲洗三次（ ）NaCl溶液除去任何残留物。将粘附在支撑载体上的细胞在4℃下用1.25％的磷酸盐缓冲盐水（pH6.5）固定在67mM磷酸盐缓冲的盐水（pH6.5）中。3小时[16］.样品经乙醇分步脱水后，用乙醇干燥T.-丁醇，涂铂钯。然后用扫描电镜(SU8000;日立、日本东京)。

2.5。DNA提取和定量实时聚合酶链反应（RT-PCR）

以古菌16S rDNA为靶点进行RT-PCR，比较各处理载体上的产甲烷古菌数量。培养后，用0.9% NaCl洗涤碳毡，并根据制造商说明使用PowerSoil®DNA分离试剂盒(MO BIO Laboratories, Inc.， Carlsbad, CA, USA)粉碎提取DNA。

使用Chromo 4™和Opticon Monitor™软件进行RT-PCR（Ver。3.1; Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules CA，USA）以及实时（Sybrr Plus）的强大AMP®系统（Takara BioInc.，Shiga，日本）。根据制造商的说明，反应溶液（25 μL）通过混合2x强大的AMP进行实时缓冲液（TB Green TM Plus，12.5 μl），引物1106f（5 -ttwagtcaggcaacgagc-3 ）和1378r（5 -TGTGCAAGGAGCAGGGAC-3 ;1μl每个）[17]，提取DNA（1 μl）和无菌毫级水。RT-PCR程序在95℃下包含10 s的初始变性步骤，然后在95℃下的50个变性循环10 s，在57℃下退火10 s，并在72℃下延伸6秒[18］.使用未配对的学生的碳毡处理纯净水和化学物质之间的差异的统计学意义被确定 -测试。

结果

3.1。化学处理对接触角的影响

测量了与纯净水的接触角，比较了碳毡材料的表面疏水性1)．用纯净水（对照）处理的碳的接触角表现出高疏水性 ．其他化学处理载体材料均表现出亲水性;特别是KOH, HCl, HNO_3.- 和h₂所以_4.-处理过的载体表现出显著的亲水性(126-130°)( 那 -测试)。但是，即使是h₂所以_4.-处理过的接触角最小的载体( ）仍然属于疏水表面的范畴。

3.2。化学处理对表面官能团的影响

进行FT-IR分析以研究表面处理后官能团的变化。数字1呈现FT-IR光谱（500-4000厘米^-1）用纯净水或NaOH，HNO处理的碳纤维_3.和h.₂所以_4.．在所有样品中，波段在1385厘米、1630厘米和3435厘米左右^-1宽度从2820厘米到2920厘米^-1被看见。

峰值在1385厘米处^-11630厘米^-1匹配分别的膨胀和收缩的群体[19］.峰值在2820-2920厘米处^-1匹配-ch的峰值。3435厘米的乐队^-1匹配COOH官能团中-OH的膨胀和收缩的峰值[20.那21］.这些发现表明，在化学处理后，-COOH，-C = O，-CH和-OH官能团的量改变。该结果对于在该实验中进行的所有八种类型的化学处理，除了这四种官能团引起的峰外，没有观察到特征变化。

图中示出了处理过的载体表面上的官能团的强度比2．在H.₂所以_4.- 与对照表面中的相比，过度的碳毡，其特征在于最小的接触角，亲水基团-C = O，和-OH分别增加了5.55倍，4.59倍和4.46倍。纳₂所以_4.和na₂HPO._4.处理几乎相同的接触角作为对照（134°），但每个官能团的丰度大大差异。该观察结果证明，尽管存在相同的接触角，官能团的组成可能不同。NaOH处理的毛毡和对照之间的接触角之间没有注意到显着差异;然而，亲水性官能团（-COOH，-C = O和-OH）的量增加了大约双重。亲水基团的量表现出对控制的几乎没有差异，也伴随着HNO酸处理_3.，而疏水性 - 疏水组降至1/10。

3.3。化学处理之后甲状腺原煤粘附的变化

经过21天的培养，h₂气体层完全转换为CH_4.在所有文化系统中。通过定量PCR比较粘附在不同系统中碳纤维的甲状腺原煤的量。如图所示3.，用NaOH，HCl，H处理的碳纤维中的附着显着较高₂所以_4.和na₂HPO._4.与对照组相比( ; -测试)。相比之下，用其他化学品处理的载体与对照品之间没有显著差异。

图中SEM图像4.显示甲烷菌附着在化学处理过的载体上。杆状细胞m . thermautotrophicus附着在毛毡纤维上。通过SEM观察测得单位面积内甲烷菌黏附量(数据未显示)，NaOH-， HCl-， H显著增加黏附量₂所以_4.和钠₂HPO._4.-治疗过的携带者与对照组比较( ; -测试)。对产甲烷菌在化学处理过程中黏附变化的SEM评估证实了RT-PCR的结果(图)3.)．

3.4。载体表面性质与甲状腺原核粘附性的关系

由于载体的表面疏水性被认为强烈影响甲烷的粘附性，因此评价各处理过的载体的接触角与甲状腺原粘连量之间的关系（图5.)．与对照组相比，本研究中所有处理过的载体表面的接触角均有所下降;而产甲烷菌的表面接触角与黏附量( )．

最后，研究了各碳毡表面官能团与产甲烷古菌黏附的关系。四种官能团(-COOH， -C=O， -CH和-OH)的数量在本研究中应用的七种化学处理中发生了变化。研究了各官能团丰度与产甲烷菌黏附的一对一关系;然而，任何功能组之间没有显著的相关性。考虑到多个官能团相互作用影响产甲烷菌的整体表面亲和力，我们考察了产甲烷菌的数量与-COOH和-OH基团的关系(图)6.)．用四种处理过的载体(NaOH, H₂所以_4.， HCl，和NaH₂阿宝_4.)，其中有大量的产甲烷菌附着，-COOH和-OH基团显示出较强的相关性( )．与之相反，KOH和Na₂所以_4.-Treated碳纤维，其中粘合量不增加， - 核糖和-OH基团的相关性低。这些发现表明，当其表面-COOH和-OH基团以良好平衡的方式修饰时，载体对甲烷的亲和力增加。从近似曲线的程度和对控制的官能团分布的标准进行比较，认为是为了以-COOH：-OH = 1：0.65的比例分布的官能团。

4.讨论

本研究表明，碳毡材料的化学表面处理可以增加或降低粘附性m . thermautotrophicus拉紧δ.H.先前的研究表明，碳刷电极的酸处理改变了电极的表面积并增加了微生物的粘附[22］.扫描电镜显示，在本研究中进行的任何化学处理后，碳毡表面没有明显的粗糙度(数据未显示)。因此，我们认为在这些实验中，载流子表面的物理外观没有发生明显的变化。

一般来说，产甲烷古菌的细胞表面与细菌相比是疏水的[23，这使得这些细胞更容易粘附在疏水表面[24那25.］.以前，当Verrier比较了使用具有不同接触角的聚合物的甲状腺原煤的初始粘附量，Methanospirillum hungateiJFI附着于亲水表面（水接触角58-65°），而Methanosaeta concilii.随意连接到疏水性聚合物（接触角90-102°）[3.］.因此，据认为，载体表面的有利疏水性条件根据甲烷原物种种类而变化。在这项研究中，经处理的碳纤维显示出非常强的疏水性（水接触角126-134°），但是m . thermautotrophicus附属于所有承运人。另一方面，KOH, HCl, HNO_3.- 和h₂所以_4.-treated载体显着亲密化，但在载体表面接触角和archaea的粘附之间没有观察到相关性（图5.)．

虽然所有碳毡均表现出较强的疏水性，但化学处理后产甲烷古菌的粘附量存在差异。因此，表面物理化学性质之间存在相互作用的可能性，这可能会影响产甲烷菌的粘附。通过FT-IR对载体表面官能团的定量比较，发现-COOH、-C=O、-CH、-OH等官能团的数量随化学处理而变化。特别是四种处理过的载体(NaOH, H₂所以_4.， HCl，和NaH₂阿宝_4.）附着大量甲烷酮，与对照相比，以固定比率存在-COOH和-OH基团（ )．一般来说，羧基和磷酸基在微生物表面是丰富的，它们被认为是通过与载体表面形成酯键来促进粘附的[26.］.因此，可以使载体表面上的-COOH和-OH基团的良好平衡改性促进了化学键m . thermautotrophicus拉紧δ.H，提高附着力。另一方面，虽然-COOH和-OH基团分布在HNO上，但甲烷菌的粘附量没有增加_3.- 如上面的四个载体中的近似比率含有近似的碳。hno._3.-Treated载体显示出降低-CH_3.为对照组的1/10，因此通过评价其他官能团和表面性质，可以更详细地阐明甲烷细菌的粘附特性。

在厌氧消化中，用纯甲状腺培养物的粘附实验集中在肺促甲氧基因上，因为这些生物被认为是在甲烷生产中发挥显性作用[4.那27.］.Montero等人。据报道，当反应器达到稳态条件时，在启动阶段中涉及活性甲烷化的氢脱甲烷，当反应器达到稳态条件[5.］.因此，在厌氧消化的发作时，氢脱氢甲烷酮的粘附性比肺脱发甲烷酮更重要。此外，据认为，氢脱氢甲烷酮在直接筛选电子转移（饮食）中具有重要作用，因为这些甲烷酮是使用导电载体和电化学甲状腺阴极的厌氧消化过程中的主要物种。为了有效利用甲状腺原煤，有必要评估各种甲状腺种类以及肺促甲烷的粘附性。

本研究结果表明，载体表面的官能团有助于产甲烷古菌的粘附。产甲烷古菌的官能团丰度因种间细胞壁结构的不同而有很大差异[28.］.因此，今后对产甲烷古菌粘附机理的研究应关注载体和微生物表面的官能团分布和化学键合以及物理性质。认为使用化学表面修饰和纯培养的粘附实验对澄清粘附性能是有效的，如在本研究中。通过控制产甲烷古菌的粘附性，可大大提高厌氧消化的适用性。

5.结论

大量的m . thermautotrophicus拉紧δ.H粘附在用NaOH，H处理后增加碳毡表面增加₂所以_4.，hcl或nah₂阿宝_4.．化学处理改变了碳毡表面的疏水性，但在载体表面接触角和古亚氏的粘附之间没有观察到相关性。遵守的人数m . thermautotrophicus在碳毡上更大，其表面-COOH：-OH比为1：0.68。已知致氢脱液性甲烷在厌氧消化和电化学甲烷中具有重要作用。因此，通过控制诸如的氢型甲状腺原性的粘附性，将改善厌氧消化物的性能m . thermautotrophicus使用化学表面改性。

此外，我们的结果表明载体表面的官能团影响了甲烷型古氏菌的粘附性。通过专注于功能群分布和化学粘合以及物理特性，将来粘合机构可能变得清晰。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

的利益冲突

作者宣布没有关于本文的出版物的利益冲突。

致谢

这项工作得到了JSPS Kakenhi（授权号JP17H06296和JP19J13004）的支持。作者希望感谢K. ITO以获得SEM观察。

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