甜菜碱调节瘤胃古社区和功能在热量和体外渗透压力条件 - raybet雷竞app,雷竞技官网下载,雷电竞下载苹果

文摘

瘤胃古生菌发挥重要作用在清除瘤胃氢(H₂),因此促进瘤胃发酵。他们需要最佳温度和同渗重摩的生长和新陈代谢;然而,一些外部因素可能把古生菌在热量和渗透压力。甜菜碱是一种osmolyte,分子伴侣蛋白,抗氧化;因此,熊可能打击这些压力。在这个在体外研究中,三个甜菜碱水平,即0(控制),51(低),和286 ppm(高),使用。每一个受到两个温度(39.5和42°C)和两个同渗重摩条件(295年和420年mOsmol公斤¹), 每治疗。测序分析固相(使用固体材料主要包含纤维材料的低密度颗粒饲料)、液相(瘤胃液体发酵罐)使用16 s rRNA透露,超过99.8%的瘤胃古生菌在发酵属于门Euryarchaeota。在属级,Methanobrevibacter在这两个阶段是最普遍的,Methanosaeta只有在液相中发现。的属Methanobrevibacter和甲烷细菌属均显示与甲烷(CH正相关₄)在液体和固体的形成阶段,分别为( )。热应力增加了相对丰富的属Methanimicrococcus的候选人古属Vadin说出( )。在固相,渗透压力显著降低香农和辛普森多样性指数,和相对丰度高Methanobrevibacter为代价的Methanimicrococcus。在液相中,渗透压力的增加不仅abundance-based覆盖率估计量(ACE)和单打参数的多样性也的相对丰度Methanosphaera和甲烷细菌属。估计总体减少所有气体参数和代谢氢(h[2])利用率在渗透胁迫条件下观察( )。甜菜碱提高固相古生菌的多样性的ACE的增加以及单身人士在热应力,只有高剂量改善所有多样性参数在液相渗透压力( )。因此,甜菜碱缓解热应力的影响和渗透压力对古生菌社区。

1。介绍

甜菜碱、三甲基甘氨酸是一种两性离子,兼容的和广泛使用的有机osmolyte合成或被微生物平衡他们的离子平衡和细胞膨1- - - - - -3]。甜菜碱也稳定原生细胞的蛋白质结构,防止分子解体,作为分子伴侣蛋白和细胞内抗氧化4,5]。这些特征使甜菜碱适合稳定压力条件下细菌细胞的新陈代谢。甜菜碱是发现自然丰富的小麦麸皮和甜菜,动物饲料产品,是为了减少环境和饮食变化的影响在胃肠道微生物群3,6,7]。我们先前的研究观察甜菜碱在高温的影响,增加了同渗重摩条件对瘤胃发现甜菜碱的应用在体外导致细菌种群的稳定和改善瘤胃发酵(3]。合理的期望,甜菜碱的存在也可能影响瘤胃古生菌社区和功能。首先,作为一个复合轴承甲基甜菜碱分解代谢进行了瘤胃微生物释放三甲胺,随后用于甲烷生成(8]。这样,甜菜碱除了可以直接影响methylotrophic古生菌,更少的人口研究瘤胃环境。此外,根据上述属性,甜菜碱可能有助于稳定的社区古生菌时受到压力。尽管独特的古细菌细胞膜的结构能使他们更加强调宽容比瘤胃细菌(9),他们仍然需要最佳的瘤胃温度(38°C到41°C)和同渗重摩(260年至340年mOsmol公斤¹)的生长和新陈代谢10]。物理化学参数都是敏感的外部因素的瘤胃牲畜包括使用不同的膳食成分,具有有弹性地改变渗透压的能力以及瘤胃温度(11,12]。这种压力的后果在瘤胃古生菌人口范围从细胞脱水(13,14],单细胞死亡[15),一个完整的瘤胃发酵的生态系统的破坏导致瘤胃失调和减少动物生产和健康(16,17]。产甲烷古菌以其重要的角色在H的分压₂低在瘤胃18),稳定压力下的古细菌社区和他们的代谢功能因此促进瘤胃发酵。因此,虽然他们只代表总数的3.3%的微生物质量reticulorumen的牛,古生菌在生物网络占据了一个重要的生态地位瘤胃微生物群(19]。然而,甜菜碱在瘤胃内的一般应用迄今最小,因此,对瘤胃古生菌的数量和功能的影响仍然未知。研究数据尤其缺乏关于瘤胃瘤胃压力条件下生态系统。

来解决这一问题的研究缺口,目前的研究计划的目标确定甜菜碱的影响相对丰富和社区的多样性瘤胃古生菌在固体和液体阶段的瘤胃在热量和渗透压力条件下,使用一个在体外瘤胃模拟技术(Rusitec)。我们假设热应力和渗透压力会降低瘤胃的多样性和相对含量,古生菌属的固体和液体阶段在体外人口,添加甜菜碱在热应力和渗透压力会抵消多样性降低了稳定的相对丰度瘤胃古生菌,从而导致甲烷生成。

2。材料和方法

2.1。实验设计和治疗

执行的审判是使用两个Rusitec总成详细描述(早些时候3]。总之,每个Rusitec组装包含6发酵置于水浴,每个发酵罐都有800毫升的有效容积。总共6进行了实验运行导致每个治疗。每次运行由10天,前5天(d1-d5)作为适应期紧随其后的最后5天(d6-d10)采样和测量。系统达到稳定pH值经过4天的孵化(补充图1)符合Mickdam et al。(以前的研究20.]。这个实验是基于析因设计与2温度(正常- 39.5°C;热stress-42°C),两个渗透条件(正常~ 295 mOsmol公斤¹和pH值为6.6;渗透压力~ 420 mOsmol公斤¹和pH值为6.0),3甜菜碱补充水平(0 ppm-control;51 ppm-low;286 ppm-high)。低和高剂量甜菜碱提供相当于0.03和0.2克的甜菜碱每天每个发酵罐。ActiBeet®L(自然的甜菜碱),包含40%/甜菜碱(AGRANA斯达克GmbH,维也纳,奥地利),被用来准备各自的甜菜碱剂、pH值和目标和同渗重摩达到使用缓冲和饮食。的饲料干物质的基础上的饮食包含草青贮饲料(25%在正常、渗透压力的20%),玉米青贮饲料(15%在正常、渗透压力的7%),和第二次下调草甸干草(10%在正常、渗透压力的8%)。集中混合物(43%在正常、渗透压力的56%)由大麦(21.55%)、小麦(21.55%)、玉米(51.7%)、和维生素和矿物质补充剂(5.2%),除了Rindastar (Schaumann、德国)浓缩蛋白作为蛋白质来源(7%在正常、渗透压力的9%)(3]。饮食的化学成分已经详细报道在另一个平行研究[3]。正常同渗重摩条件是维护与注入麦克杜格尔的唾液缓冲(21)用小的修改以及使用含有50的饮食:50饲料的比例:集中精神。渗透压力条件下诱导通过调整麦克杜格尔的缓冲和饮食35:65饲料的比例:集中。治疗之间的随机运行,避免instrument-specific发酵效果。在实验开始之前,饮食成分除了干草在65°C烤箱干48 h,然后与威利厂(Idar-Oberstein Pulverisette 25/19,弗里奇GmbH,德国)通过一个6毫米筛。

2.2。Rusitec过程

在每个实验运行的第一天,瘤胃液体和固体digesta(固体材料主要包含纤维材料的低密度颗粒饲料)获得从三个空心荷斯坦奶牛维持在VetFarm不会分泌乳汁Kremesberg Vetmeduni,维也纳和美联储第二次下调草甸干草。瘤胃液体和固体digesta接近通过时收集的瘤胃插管;前得到的帮助下抽吸泵连接软管,而后者收购手动从瘤胃垫。奶牛喂养干草和草青贮饲料和保持根据奥地利动物福利的指导方针22]。从所有三个牛瘤胃内容汇集在一起的阶段。瘤胃液体首次透过四层的医疗纱布(1毫米孔隙大小),然后600毫升和100毫升添加到每个发酵罐的缓冲区。固体digesta子样品,放置在尼龙包( ,150年μm孔隙大小,足总。链接器Industrie-Technik GmbH是一家现代化、卡塞尔、德国),那么一个充满汇集固体digesta和一个装满了相应的饮食(12 g干物质(DM))被添加到每个容器。24小时后,与固体digesta袋被删除,取而代之的是新鲜袋各自的饮食由混合饲料原料。人工唾液不断提供所有发酵使用12-channel蠕动泵(模型ISM932、Ismatec国际防务展健康与科学GmbH,韦特海姆,德国)的速度每一天。流出收集玻璃瓶保持在1°C,和发酵气体收集在不透气的塑料袋(TECOBAG 8 L, Tesseraux集装箱GmbH Burstadt,德国)。添加新提要是每日在0800 h,流出和气体同时进行测量。首先,氮气是通过船30秒刷新收集所有残余气体在各自的气包。随后,发酵罐是测定打开和总流出。最后,48 h孵化饲料袋被替换为一个新的饲料袋。删除之前的实验中,48 h孵化饲料袋第一次冲洗与40毫升的各自的缓冲和挤压促进液相转移回微生物发酵罐。后再密封的发酵罐,氮气冲洗3分钟恢复厌氧条件下,和一个空气包被。进食后不久,600年μL甜菜碱与吸管通过仔细的解决方案是给小阀门顶部的发酵。0 h浓度控制,低,高剂量甜菜碱 , ,和 ( )(3]。

2.3。每日抽样和测量

孵化液从发酵收集每日喂食前通过阀门与一个注射器。这种液体是用来确定酸碱和氧化还原电位计(SevenMulti™,梅特勒-托利多GmbH, Schwerzenbach,瑞士)配有两个电极(InLab专家Pro-ISM pH值和Pt4805-DPA-SC-S8/120氧化还原,分别;瑞士梅特勒-托利多GmbH, Schwerzenbach)。在抽样的日子(d6-d10),额外的整除被短链脂肪酸(SCFA) d10,额外的整除了古生菌的分析。d10,饲料袋孵化24 h snap-frozen并保存在-20°C古生菌的分析。古生菌分析样品在液氮snap-frozen进一步并存储在-20°C DNA提取和测序分析。残余饲料袋收集采样期间用手洗了冷水,直到水变清晰,运行和保存在-20°C进行化学分析。

2.4。化学分析

分析收集到的气体的组成和体积,饲料和饲料残留的化学分析,短链脂肪酸进行了分析进行的一项研究显示Humer et al。23]。总之,发酵气体的成分进行了分析使用一个红外探测器的机器(Ansyco ATEX沼气监控检查BM 2000年,卡尔斯鲁厄,德国),和气体测量水的体积替代方法。饲料残留物都集中在过去的5天,和化学分析饲料和饲料残留物进行根据农业分析和研究方法的手册(VDLUFA) [24]。不同营养成分的饲料,孵化之前和之后,用于估计明显营养失踪的干物质(DM)和有机质(OM)。甲烷(CH₄)生产提出了绝对(毫升/ d),和相对生产规范化的明显营养失踪(mL / g退化DM、OM)。SCFA成分(乙酸、丙酸、n-butyrate异丁酸盐,n-valerate,摘要,和己酸酯)和浓度对个别样本测定气相色谱法(GC) (8060 MS DPFC Fisons GC模型,950713号,Rodena,意大利)使用火焰离子化检测器和一个毛细管柱(SN US46185178 JW科学、福尔松的,CA)。探测器和喷油器保持在特定温度下的190和170°C,分别。氦用作载气的流量持续1毫升/分钟。色谱峰的最终分类和评价被Stratos完成软件(4.5.0.0 Stratos版本,聚合物实验室、肉用羊、英国)。

2.5。计算氢代谢((2 h))的平衡

(2 h)平衡,如表所示1是计算化学计量的发酵终端产品前面描述的(25]。因此,(2 h)总产量(更易/ d)估计的总和(2 h)的日常生产醋酸、丁酸盐,和己酸酯(更易/ d)和总(2 h)利用率(更易/ d)计算的总和(2 h)用于生产丙酸、戊酸酯、己酸酯和CH₄(更易与d)。CH的体积₄被转换为摩尔使用理想气体定律。己酸酯可以从2 propionyl-CoA的缩合合成需要的4摩尔(2 h)每摩尔的己酸酯或2乙酰辅酶a版本2摩尔每摩尔的己酸酯(2 h)。两个场景进行评估来估计总(2 h)生产和消费。利用(2 h)与轻微发酵相关终端产品包括甲酸和heptanoate [25没有考虑)。估计(2 h)生产和利用是用来计算(2 h)增益和% (2 h)复苏。


最终产品	化学计量学方程	(2 h)的平衡

醋酸(CH₃羧基)	C₆H₁₂O₆+ 2 h₂O1⟶2 ch₃羧基+ 4 (2 h) + 2有限公司₂	+ 2
丙酸(CH₃CH₂羧基)	C₆H₁₂O₆2 + 2 (2 h)⟶ch₃CH₂羧基h + 2₂O	1
丁酸(CH₃(CH₂)₂羧基)	C₆H₁₂O₆⟶CH₃(CH₂)₂羧基+ 2 (2 h) + 2有限公司₂	+ 2
戊酸酯(CH₃(CH₂)₃羧基)	C₆H₁₂O₆+ (2 h)⟶CH₃(CH₂)₃羧基+有限公司₂+ 2 h₂O	1
己酸酯^一个(CH₃(CH₂)₄羧基)	C₆H₁₂O₆+ 4 (2 h)⟶CH₃(CH₂)₄羧基+ 4 h₂O	4
己酸酯^b(CH₃(CH₂)₄羧基)	3 c₆H₁₂O₆⟶2 ch₃(CH₂)₄羧基+ 4 (2 h) + 2 h₂O + 6有限公司₂	+ 2
甲烷(CH₄)	有限公司₂+ 4 (2 h)⟶CH₄+ 2 h₂O	4

^一个Propanyl-CoA中间。^b乙酰辅酶a中间。摩尔(2 h)使用或生产发酵终产物的摩尔。

2.6。DNA提取

总基因组DNA提取大约有800μL的液相和固相使用0.25 g DNeasy PowerSoil工具包(试剂盒、希尔登,德国)描述的方法由阿訇Varzaneh et al。26)做了一些调整。总之,在95°C添加解决方案C1和孵化后5分钟,样本离心机和上层的收集和搁置进行进一步处理。100年μL(100毫克/毫升溶菌酶和10μL为2.5 U /毫升mutanolysin (Sigma-Aldrich,维也纳,奥地利)被添加到球和孵化37°C 30分钟。后来,21μL(18.6毫克/毫升蛋白酶K (Sigma-Aldrich,维也纳,奥地利)添加其次是孵化在37°C 1 h。机械破坏的古细菌细胞是由珠打使用FastPrep-24仪器(MP生物医学,圣安娜、钙、美国)按照以前公布的程序(27]。离心后,上清液的样本添加到以前收集上层的其次是化学去除细胞碎片和PCR抑制剂通过几个离心步骤。基于列的上层清液被转移到新鲜的管总基因组DNA的隔离,和DNA在100年被筛选了μL (C6缓冲区。DNA浓度是由一个量子位2.0荧光计(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)利用量子位双链DNA (dsDNA)海关化验设备(技术)和存储在-20°C,直到进一步的分析。为了提高人口古生菌鉴定、PCR扩增子的方法是,使用25-cycle PCR进行,使用5 ng模板和引物344 f(5 100海里 - - - - - -ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA-3 )和1041 r (5 - - - - - -GGCCATGCACCWCCTCTC-3 ;Moissl-Eichinger,个人沟通)。PCR是20μ包括10 L反应体积μL快+ EvaGreen主人较低的混合火箭参考染料(美国CA Biotium, Hayward), 1μL的正向和反向引物7μL DEPC-Treated水(美国圣路易斯G-Biosciences),和1μL模板。所有的反应都是在重复运行包括消极的控制在96孔板(VWR,维也纳,奥地利)使用Mx3000P Stratagene PCR系统(安捷伦科技)在下列温度:95°C 5分钟首次变性,95°C为5秒酶激活,64°C退火30秒,30秒内72°C,伸长。

2.7。测序和生物信息学分析

每个扩增子样本(5 ng在20μL)被扩增子测序使用Illumina公司MiSeq paired-end测序技术(Microsynth AG)、Balgach、瑞士)。目标放大的V4的热点16 s rRNA基因进行使用底漆515 f(5集 - - - - - -GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3 )和806 r (5 - - - - - -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3 )(28]。测序过程是由阿訇所述Varzaneh et al。26]。纯化PCR产品库是由切断测序适配器和指数(Nextera XT样品制备设备,Illumina公司,CA)根据制造商的建议。克分子数相等的数量的每个库都汇集在一起,测序Illumina公司MiSeq个人编曲。由此产生的成对的结束被缝合Microsynth AG (Balach、瑞士)。数据质量控制和使用开源定量分析见解微生物生态学(QIIME)管道(http://qiime.org/)[29日]。筛查嵌合序列完成使用USEARCH [30.),以及由此产生的清洗序列然后对齐和集群定义操作分类单元(辣子鸡)使用Python最近的调整空间终止(PyNAST) (QIIME) [29日)和席尔瓦- 128数据库(v128;2018年11月访问)31日]。序列间的相似度定义为97%获得OTU身份在物种水平。辣子鸡,集群少于10读取手动删除。α多样性分析,abundance-based覆盖率估计量(ACE),香农和辛普森指数,单身。单身人士表示样品中只出现一次的辣子鸡。Beta-diversity分析使用加权Unifrac不同指标和主坐标分析(PCoA)策划41921年与稀疏QIIME序列,基于序列的最低数量在一个样本。质量分析前原始序列的总数是10317729。测序数据可用BioProject SRA数据库下加入PRJNA602990数量。

2.8。统计数据

统计分析使用SAS的混合过程(9.4版本,SAS研究所Inc .卡里,数控,美国)。统计模型包括甜菜碱补充,孵化温度和同渗重摩连同他们的双向和三向交互。实验运行之间的差异被认为是一个随机效应。微生物种群的相对丰度也测试使用以上统计模型不使用重复的措施。相关分析进行了使用CORR过程获取皮尔逊相关系数。意味着值报告 (SE)。意义被宣布在和一个趋势的影响。

3所示。结果

3.1。发酵天然气产量和组成影响孵化条件和治疗

热应力的影响最小的大部分气体参数,,只有acetate-associated (2 h)生产与热应力会增加趋势(表2)。热应力转移的利用率(2 h)与戊酸酯生产的丙酸( )。渗透胁迫显著抑制所有的发酵气体参数包括绝对有限公司₂生产(-146 mL / d),绝对的CH₄生产(-38 mL / d), CH₄/ g OM退化(-5.6毫升),CH₄/ g DM降解(-5.1毫升)和甲烷转化率(-0.71%的总能量摄入(GE); )。


参数	同渗重摩⁸			温度(°C)			甜菜碱⁹				价值^美元
参数	正常的	超	SE	39.5	42	SE	控制	低	高	SE	Osmo。	Temp。	甜菜碱

CH₄生产(毫升/ d)	87.3	49.3	18.98	66.7	69.9	1.62	50.6^c	60.1^b	94.2^一个	13.23	< 0.0001	0.2362	< 0.0001
有限公司₂生产(毫升/ d)	423.8	277.7	73.06	346.3	355.3	4.48	328.0^b	341.3^b	383.0^一个	16.58	< 0.0001	0.4607	0.0013
总发酵气体¹(毫升/ d)	550.3	365.5	92.36	450.6	465.2	7.33	418.6^b	438.2^b	516.9^一个	30.05	< 0.0001	0.3361	< 0.0001
CH₄(%的总气体)	15.6	12.8	1.42	14.1	14.3	0.12	11.6^c	13.2^b	17.8^一个	1.87	< 0.0001	0.432	< 0.0001
有限公司₂(%的总气体)	77.2	76.0	0.63	76.9	76.3	0.28	77.8^一个	77.9^一个	74.1^b	1.25	0.1106	0.474	< 0.0001
甲烷形成基于营养发酵(mL / g退化)
CH₄/ g OM	13.5	7.9	2.82	10.7	10.7	0.00	7.8^c	9.5^b	14.8^一个	2.11	< 0.0001	0.998	< 0.0001
CH₄/ g DM	12.2	7.1	2.56	9.7	9.7	0.01	7.0^c	8.6^b	13.4^一个	1.91	< 0.0001	0.976	< 0.0001
MCR GE摄入量(%)²	1.63	0.92	0.354	1.24	1.30	0.03	0.94^c	1.12^b	1.75^一个	0.246	< 0.0001	0.234	< 0.0001
氢代谢(2 h)(更易与d)
醋酸生产	59.9	50.3	4.77	53.9	56.3	1.17	52.0^b	55.5^一个	57.8^一个	1.68	< 0.0001	0.058	0.0012
丁酸盐生产³	20.8	21.3	0.26	21.1	20.9	0.09	20.5	21.1	21.5	0.30	0.4741	0.797	0.4898
己酸酯生产	3.76	2.99	0.386	3.02	3.74	0.36	3.60	3.37	3.17	0.125	0.1171	0.142	0.7688
丙酸的利用	16.4	16.7	0.16	17.6	15.5	1.05	15.7	16.8	17.0	0.42	0.6826	0.008	0.314
利用戊酸酯	3.23	2.75	0.241	2.77	3.20	0.21	3.01	3.01	2.94	0.023	0.0072	0.016	0.9305
己酸酯利用	7.5	6.0	0.77	6.0	7.5	0.72	7.2	6.7	6.3	0.25	0.1166	0.143	0.7679
CH₄利用	13.8	7.8	3.00	10.5	11.1	0.26	8.0^c	9.5^b	14.9^一个	2.09	< 0.0001	0.235	< 0.0001
氢代谢(2 h)平衡(更易与d)
生产(通道1)⁴	80.6	71.6	4.5	75.0	77.2	1.07	72.4	76.6	79.3	1。9	< 0.0001	0.14	0.001
利用(通道1)	40.9	33.2	3.85	36.9	37.2	0.14	33.9	36.1	41.2	2.16	< 0.0001	0.72	< 0.0001
获得(通道1)⁶	39.7	38.4	0.65	38.1	40.0	0.94	38.5	40.5	38.1	0.72	0.46	0.29	0.51
复苏%(通道1)⁷	51.2	47.2	1.99	49.7	48.7	0.46	47.4	47.7	52.4	1。6	0.01	0.54	0.01
生产(通道2)⁵	84.4	74.6	4.89	78.0	80.9	1.43	76.0	79.9	82.4	1.86	< 0.0001	0.06	0.003
利用(通道2)	33.4	27.2	3.08	30.9	29.7	0.57	26.7	29.4	34.8	2.40	< 0.0001	0.10	< 0.0001
获得(通道2)⁶	51.0	47.4	1.81	47.1	51.1	2.01	49.3	50.6	47.6	0.86	0.04	0.02	0.40
复苏%(通道2)⁷	39.9	36.8	1.53	39.8	36.9	1.43	35.3	37.2	42.5	2.15	0.01	0.02	< 0.0001

¹ 。 ²甲烷转化率。³ 。 ⁴Propanyl辅酶a己酸酯形成的中间。⁵乙酰辅酶a己酸酯形成的中间。⁶ 。 ⁷ 。 ⁸ ; 。 ⁹甜菜碱含量:控制(0)、低(51)、高(286)ppm。标准误差。^美元值测试同渗重摩的固定效应( ),温度( ),和甜菜碱( )。意义: 。

对于甲烷生成参数,没有交互观察。生产(2 h)与醋酸生产、利用与戊酸酯和CH₄生产期间明显降低渗透压力( ),导致显著降低整体(2 h)生产和利用。没有变化(2 h)获得当己酸酯与propanyl - CoA通路,但百分比(2 h)复苏降低7.7 - -7.9%由于渗透压力( )。

不管孵化条件,控制相比,只有补充的高剂量甜菜碱生产更绝对总发酵气体( )和有限公司₂( ,表2)。绝对CH₄生产、CH₄转化率,CH₄每克OM和DM降解,形成和CH₄总额的比例发酵气体,所有仍然显著高于低和高剂量的甜菜碱与控制( )。CH₄形成(每克OM和DM降解)增加了61,95%是由于在低和高剂量添加甜菜碱,分别和CH的增加₄总额的比例发酵气体只有高剂量的有限公司₂( )。(2 h)综合生产和利用增强了每个层次的甜菜碱与控制( )。增加(2 h)醋酸生产被认为与一个协会(5.8 + 3.5低剂量,+高剂量)和增加(2 h)利用率与CH的形成₄低剂量(+ 1.5,+ 6.9高剂量, )。因此,绝对(2 h)仍未受影响,但无论如何,百分比(2 h)复苏相比,提高了尤其是在高剂量控制通过通路( )。

3.2。古菌多样性是影响孵化条件和治疗

液相,热应力并不影响任何α多样性参数表达的王牌,香农和辛普森指数和单身人士( ,表3)。Beta-diversity使用加权UniFrac PCoA显示,只在PC1集群与生物分离块由于热应力(图1(一))。渗透压力显著提高香农和辛普森指数( ,表3),PCoA情节还显示一个渗透压力对热点的影响社区的一个清晰的分离的集群三个主要组件(图1 (b))。补充的甜菜碱对古生菌的beta-diversity没有任何影响(图1 (c)),但一个重要的交互存在了所有α多样性参数( )除了王牌,它只显示趋势( ,表3)。具体来说,只有高剂量的甜菜碱导致显著增加ACE ( ),辛普森( ),香农( ),和单身指数( )在渗透应力状态,而不是在正常同渗重摩状态(图2)。


估计	同渗重摩¹			温度(°C)			甜菜碱²				价值^美元
	正常的	超	SE	39.5	42	SE	控制	低	高	SE	³	³	³	交互⁴

王牌	1488.4	1485.1	52.3	1468.2	1505.3	52.32	1463.3	1495.8	1501.2	55.7	0.93	0.33	0.68	( )
香农指数	4.60	4.81	0.07	4.68	4.73	0.078	4.6672	4.7177	4.7426	0.08	< 0.001	0.28	0.40	,( )
辛普森指数	0.9031	0.9117	0.004	0.9083	0.9066	0.004	0.9045	0.9091	0.9087	0.004	0.003	0.55	0.35	,
单身	385.42	381.15	13.3	378.76	387.81	13.38	375.38	385.34	389.13	14.23	0.66	0.35	0.49

¹ ; 。 ²甜菜碱含量:控制(0)、低(51)、高(286)ppm。³ :同渗重摩; :温度; :甜菜碱。⁴只影响与意义( )或倾向用括号( )列出。标准误差。^美元值是用于测试的固定效果同渗重摩( ),温度( ),和甜菜碱( )。意义: 。

(一)

(b)

(c)

图1

主坐标分析(PCoA) beta-diversity瘤胃古生菌的发酵的孵化内容的液相,在(a)温度的影响(红色方块:39.5°C;蓝色的圆圈:42°C), (b)同渗重摩¹(蓝色的圆圈:正常;红色方块:渗透压力)和(c)甜菜碱补充²(红色方块:控制;橙色三角形:低;蓝色的圆圈:高)。第一个3组件绘制和总原则组件解释总变异的69.74% ( , ,和 ,分别)。¹ ; 。 ²甜菜碱含量:控制(0)、低(51)、高(286)ppm。

图2

瘤胃古生菌的多样性参数在液相中甜菜碱的影响¹和同渗重摩²。不同的标hyperosmolality酒吧代表显著差异( )。。 ¹甜菜碱含量:控制(0)、低(51)、高(286)ppm。² ; 。

在固相,热应力对古菌多样性的影响类似于液相。所有α多样性参数仍未受影响,分离的集群PCoA情节仅仅是著名的PC1与生物( ,表4,图3(一个))。渗透压力显著降低了多样性参数ACE和单身人士( ,表4),和聚类模式在PCoA加载图显示清晰的分离(图3 (b))。没有变化是观察α和beta-diversity参数由于各级甜菜碱补充( ,表4,图3 (c))。然而,这一趋势交互存在了ACE和单身人士( ,表4),甜菜碱水平有一个增强的王牌和单打的数量在热应激条件下固相(图4)。


估计	同渗重摩¹			温度(°C)			甜菜碱²				价值^美元
	正常的	超	SE	39.5	42	SE	控制	低	高	SE	³	³	³	交互⁴

王牌	1622.5	1430.2	32.8	1533.2	1519.5	32.9	1469年	1557.3	1552.2	38.03	< 0.001	0.71	0.11	( )
香农指数	4.83	4.794	0.04	4.84	4.77	0.04	4.74	4.87	4.82	0.05	0.50	0.23	0.19
辛普森指数	0.909	0.9093	0.002	0.911	0.907	0.002	0.903	0.912	0.911	0.003	0.94	0.29	0.11
单身	417.2	368.35	8.90	394.9	390.6	8.91	402.2	402.2	397.5	10.19	< 0.001	0.66	0.12	( )

(一)

(b)

(c)

图3

主坐标分析(PCoA) beta-diversity瘤胃古生菌的发酵的孵化的固相含量,在(a)温度的影响(红色方块:39.5°C;蓝色的圆圈:42°C), (b)同渗重摩¹(蓝色的圆圈:正常;红色方块:渗透压力)和(c)甜菜碱补充²(红色方块:控制;橙色三角形:低;蓝色的圆圈:高)。第一个3组件绘制和总原则组件解释总变异的77.61% (PC1 = 47.78、PC2 = 21.46和生物= 8.37%,分别)。¹ ; 。 ²甜菜碱含量:控制(0)、低(51)、高(286)ppm。

3.3。古生菌成分影响孵化条件和治疗

古生菌的序列扩增子导致质量9442068年读144年样本均值66139读/样品。这些可以集群读入3016独特的辣子鸡,最低10每OTU序列。评价是nonnormalized数据完成的。两个门,Crenarchaeota(0.0008% - -0.2%)Euryarchaeota(99.8% - -99.9%),确定了液体和固体阶段。在属级,Vadin说出,Methanosphaera,甲烷八叠球菌属,Methanobrevibacter,甲烷细菌属,Methanimicrococcus,Methanosaeta在液相中被发现(表吗5)。除了属Methanosaeta所有其他属也在固相(表中找到6)。


	同渗重摩¹			温度(°C)			甜菜碱²				价值^美元
	正常的	超	SE	39.5	42	SE	控制	低	高	SE	³	³	³	交互⁴

门
Crenarchaeota											0.04	0.60	0.22
Euryarchaeota	0.993	0.993	0.000	0.993	0.993	0.000	0.993	0.993	0.993	0.000	0.28	0.59	0.79
属
Vadin说出	0.303	0.305	0.017	0.320	0.287	0.017	0.305	0.305	0.301	0.018	0.86	0.008	0.94
Methanosphaera	0.043	0.069	0.014	0.052	0.060	0.014	0.059	0.057	0.052	0.015	0.04	0.53	0.89
甲烷八叠球菌属			0.000		0.000	0.000				0.000	0.92	0.04	0.69	( )
Methanobrevibacter	0.49	0.49	0.013	0.49	0.49	0.013	0.486	0.496	0.500	0.014	0.44	0.94	0.61
甲烷细菌属											0.03	0.42	0.38
Methanimicrococcus	0.032	0.020	0.006	0.019	0.033	0.006	0.028	0.032	0.018	0.007	0.13	0.09	0.34	( )
Methanosaeta			0.000			0.000	0.000			0.000	0.32	0.32	0.37


	同渗重摩¹			温度(°C)			甜菜碱²				价值
	正常的	超	SE	39.5	42	SE	控制	低	高	SE	³	³	³	交互⁴

门
Crenarchaeota	0.001	0.001	0.0008	0.002		0.0008		0.001	0.002	0.001	0.98	0.10	0.26
Euryarchaeota	0.99	0.99	0.0007	0.991	0.993	0.0007	0.994	0.993	0.991	0.001	0.19	0.07	0.09
属
Vadin说出	0.27	0.26	0.016	0.293	0.2426	0.0162	0.288	0.253	0.260	0.018	0.56	0.001	0.15
Methanosphaera	0.13	0.13	0.0308	0.115	0.159	0.030	0.119	0.0328	0.166	0.125	0.96	0.06	0.19
甲烷八叠球菌属											0.29	0.20	0.46
Methanobrevibacter	0.45	0.50	0.0208	0.494	0.463	0.0208	0.487	0.454	0.494	0.023	0.02	0.14	0.26	( )
甲烷细菌属											0.58	0.42	0.16
Methanimicrococcus	0.01	0.003	0.002	0.0045	0.011	0.0025	0.006	0.005	0.011	0.003	0.02	0.05	0.33	( )

在液相中,热应力显著促进了属甲烷八叠球菌属并表现出增加的趋势Methanimicrococcus以牺牲Vadin说出(表5)。渗透压力显著提高大量的门Crenarchaeota,属Methanosphaera和甲烷细菌属( ,表5)。没有甜菜碱补充影响古生菌属和门的相对丰度水平(表5)。然而,一个趋势和互动被认为属Methanimicrococcus( )和甲烷八叠球菌属( ),分别。属的有显著负相关Methanosphaera与(2 h)利用基于己酸酯和恢复propanyl通路,CH₄形成(每克OM和DM降解),和CH (2 h)的利用率₄( ,表7)。然而,对于属Methanobrevibacter与CH,显著正相关₄每g OM和DM降解形成纠正( ,表7)。


	Methanimicrococcus	甲烷细菌属	Methanobrevibacter	Methanosaeta	甲烷八叠球菌属	Methanosphaera	Vadin说出

总发酵气体	0.22	-0.08	0.18	0.11	-0.03	-0.24	-0.14
CH₄	0.11	-0.06	0.18	0.13	-0.04	-0.24	-0.12
有限公司₂	0.23	0.00	0.04	-0.04	0.06	-0.17	-0.07
CH₄/ g OM	-0.02	-0.03	0.32	0.14	-0.03	-0.27	-0.08
CH₄/ g DM	-0.02	-0.03	0.32	0.14	-0.03	-0.26	-0.09
MCR GE摄入量(%)	0.11	-0.06	0.18	0.13	-0.04	-0.24	-0.12
(2 h)生产醋酸	-0.08	0.01	-0.11	0.31	0.09	0.18	-0.16
(2 h)产生丁酸	0.00	-0.13	0.16	-0.02	-0.11	-0.12	0.12
(2 h)己酸酯	0.26	-0.04	-0.14	0.08	0.10	-0.18	0.10
(2 h)生产(通道1)¹	-0.08	-0.04	-0.04	0.32	0.05	0.14	-0.12
(2 h)生产(通道2)²	-0.02	-0.05	-0.07	0.33	0.07	0.10	-0.09
(2 h)利用丙酸	-0.30	-0.06	0.06	0.02	0.10	0.15	0.08
(2 h)利用戊酸酯	0.21	0.09	-0.23	0.21	0.12	-0.06	0.12
(2 h)利用己酸酯	0.26	-0.04	-0.14	0.08	0.10	-0.18	0.10
(2 h)利用CH₄	0.11	-0.05	0.18	0.12	-0.03	-0.23	-0.12
(2 h)利用(通道1)	0.10	-0.10	0.05	0.21	0.13	-0.23	0.05
(2 h)利用(通道2)	-0.09	-0.08	0.17	0.16	0.06	-0.11	-0.02
(2 h)获得(通道1)	0.10	-0.11	0.06	0.21	0.14	-0.23	0.06
(2 h)获得(通道2)	0.03	-0.006	-0.18	0.27	0.04	0.18	-0.09
(2 h)复苏(通道1)	0.17	-0.07	0.05	-0.04	0.09	-0.33	0.15
(2 h)复苏(通道2)	-0.08	-0.03	0.02	-0.06	0.002	-0.17	0.05

大胆的细胞表现出显著相关性( )。 ¹Propanyl辅酶a己酸酯形成的中间。²乙酰辅酶a己酸酯形成的中间。

在固相,热应力倾向于增加门的相对丰度Euryarchaeota和属Methanosphaera( ,表6)。属Methanimicrococcus是显著增加为代价Vadin说出由于热应力相比正常瘤胃温度条件( )。渗透压力条件显著改变的相对丰度Methanobrevibacter和Methanimicrococcus,前者是后者的增加( ,表7)。丰富的门Euryarchaeota减少补充大剂量的甜菜碱( )。然而,并没有观察到这种效应在属水平。属的显著负相关Methanobrevibacter存在与CH₄形成(每克OM和DM降解),(2 h)利用率与CH₄和总体利用率和恢复(2 h) ( ,表8)。属Methanimicrococcus显示正相关的利用率和恢复(2 h)只有当己酸酯生产与propanyl推广通路( ,表8)。


	Methanimicrococcus	甲烷细菌属	Methanobrevibacter	Methanosaeta	甲烷八叠球菌属	Methanosphaera	Vadin说出

总发酵气体	0.27	0.19	-0.28	-0.21	0.03	0.17	-0.08
CH₄	0.22	0.26	-0.29	-0.18	-0.01	0.17	-0.08
有限公司₂	0.06	-0.12	-0.02	0.03	0.00	0.07	-0.14
CH₄/ g OM	0.12	0.30	-0.26	-0.19	0.00	0.19	-0.03
CH₄/ g DM	0.11	0.30	-0.26	-0.19	0.00	0.19	-0.03
MCR GE摄入量(%)	0.22	0.26	-0.29	-0.18	-0.01	0.17	-0.08
(2 h)生产醋酸	-0.05	-0.05	-0.09	0.16	0.03	0.16	-0.08
(2 h)产生丁酸	0.06	-0.10	0.18	-0.05	-0.08	-0.18	0.10
(2 h)己酸酯	0.30	-0.08	-0.05	-0.09	-0.11	-0.12	0.01
(2 h)⁺生产(通道1)	-0.03	-0.09	-0.02	0.14	0.0002	0.09	-0.04
(2 h)生产(通道2)	0.03	-0.11	-0.03	0.12	-0.02	0.06	-0.03
(2 h)利用丙酸	-0.26	-0.07	0.10	0.09	0.02	0.03	0.02
(2 h)利用戊酸酯	0.23	0.01	-0.20	-0.08	-0.16	0.11	-0.12
(2 h)利用己酸酯	0.30	-0.08	-0.05	-0.09	-0.11	-0.12	0.01
(2 h)利用CH₄	0.21	0.26	-0.29	-0.18	0.00	0.17	-0.08
(2 h)利用(通道1)	0.25	0.11	-0.24	-0.16	-0.10	0.08	-0.06
(2 h)利用(通道2)	0.03	0.18	-0.22	-0.10	-0.02	0.19	-0.07
(2 h)获得(通道1)	-0.19	-0.17	0.12	0.25	0.06	0.04	0.00
(2 h)获得(通道2)	0.02	-0.23	0.09	0.20	-0.01	-0.04	0.00
(2 h)恢复(pathway1)	0.28	0.15	-0.21	-0.24	-0.10	0.00	-0.05
(2 h)恢复(pathway2)	0.04	0.26	-0.22	-0.18	-0.01	0.16	-0.05

大胆的细胞表现出显著相关性( )。 ¹Propanyl辅酶a己酸酯形成的中间。²乙酰辅酶a己酸酯形成的中间。

4所示。讨论

古生菌占据很多的以生态系统的生态位,他们主要功能以H₂保持瘤胃环境有利于微生物发酵(32]。瘤胃古生菌可分为hydrogenotrophic aceticlastic,或根据首选methylotrophic H₂衬底的甲酸,乙酸,主要分别,早在瘤胃中最丰富的(33]。本研究侧重于了解社区内的古菌多样性和人口变化的液体或固体瘤胃阶段温度控制和渗透压力,有或没有甜菜碱补充。

在缺乏甜菜碱,hyperosmolality和热量降低了古生菌的种群多样性,表明古菌对一系列生化的应力敏感因素。值得注意的是,在渗透胁迫比热应力影响是否有力条件。因此,与甲烷生成相关的参数,包括(2 h)利用率与CH₄,CH₄主要生产,古生菌的功能,在渗透胁迫条件下压制。类似的发现之前报道了Bennink et al。34发现CH少12.4%₄生产与salt-induced高架同渗重摩阉羊瘤胃的。古生菌的早期研究没有关注社区与高同渗重摩,但饮食喂养高的谷物,提高瘤胃同渗重摩(35),被证实能够减少CH₄生产和形成36,37),这有利于减少或古菌群落结构的变化。当前修改的古菌多样性由于热应力过于局限于影响天然气生产参数,这表明古生菌的代谢作用相对持续在渗透胁迫条件下不同。这也是支持的在体外履新的研究等。38]记录不温和的热应力对总发酵气体和CH₄生产。强烈的影响渗透压力可能部分解释为底物的减少甲烷生成的应力状态也抑制整体瘤胃发酵(3]。

古生菌并非完全弹性的瘤胃人口压力;然而,这群比瘤胃细菌微生物生理上更强调宽容;以细菌的敏感性越高对这些压力因素在另一项研究中报道了类似的孵化条件(3]。

补充高剂量甜菜碱中和和支持自由浮动的古生菌的多样性,在渗透胁迫条件下抑郁。合理的解释,甜菜碱支持古生菌代谢主要通过其osmolytic属性而不是用作基质因为CH₄生产、甜菜碱的分解产物降解、甜菜碱和同渗重摩之间没有互动。的要求有机osmolytes在渗透胁迫(如甜菜碱大大上升4),像其他微生物,古生菌也占据了甜菜碱在提高同渗重摩由于盐梯度(39]。甜菜碱是一种兼容的有机溶质和osmoprotective物质(1]这不仅有助于保持液体平衡,也防止分子解体在压力条件下(4]。正如前面提到的,热应力在古菌多样性的影响明显小于渗透压力,甚至低剂量的甜菜碱足以扭转增加温度的影响。这是在协议与先前的研究表明甜菜碱的thermoprotective作用对微生物细胞(6]。

有趣的是,甜菜碱的有利影响渗透压力没有注意到固相古生菌,显示更高的渗透压力的稳定。这可能是由于这些古生菌生物膜提供的保护环境的一部分,以生物膜(32]。Methanimicrococcus是唯一的固相属敏感的渗透压力,这是与之前的报道相一致40]。相反,古生菌在液相中受益从甜菜碱渗透压力支持多样性指数增加。被高度水溶性的(41前),直接进入液相,甜菜碱似乎现成古生菌液相,这或许可以解释为什么它选择性地促进了古生菌在这个阶段。此外,古生菌不是唯一甜菜碱的消费者,和改进的发酵(早些时候3)表明,其他微生物,如细菌还利用从甜菜碱和受益。

甜菜碱在固相支持古细菌多样性在热应力,尽管它没有改变群落结构在属水平,这表明甜菜碱不需要在低应力条件下的函数。然而,我们的数据表明,Vadin说出是热敏感,而Methanimicrococcus可以在热应力下茁壮成长。减少Vadin说出针对热被并发增加补偿Methanimicrococcus可生化的应力条件下竞争排斥的结果,因为两者都是methylotrophic [42,43]。当前和以前的结果3这个实验表明,甜菜碱的添加不仅增加了甲烷生成,而且通常会增强发酵,所以甜菜碱可能支持瘤胃微生物包括古生菌间接被用作有机osmolyte兼容。

为了方便种间氢转移,古生菌需要密切联系与瘤胃细菌和原生动物。原生动物物种更有可能与液相相关联,而瘤胃细菌中最丰富的固相(32]。液体和固体阶段不同的古菌群落结构的多样性和成分。它是合理的假设,这种差异是由于喜欢种间相互作用。古生菌被认为是更加多样化的固相液相比也报道了鲍文et al。44]。这可能是由于更高的代谢活动的生物膜,导致可用的基质浓度越高对古生菌访问细菌代谢物,相比与自由浮动的饲料颗粒(45]。此外,古生菌相对增长缓慢的生物;因此,他们需要更多的时间来重建在液相44]。在最近的研究中,Methanobrevibacter、Vadin说出Methanosphaera显示的相对含量最高,不管digesta阶段。然而,有不同的古生菌属和发酵气体参数之间的相关性之间的digesta阶段。在液相中,Methanobrevibacter有正相关(2 h)利用形式CH₄,这是一个更可靠的估计量相比CH古生菌的活动₄形成本身,如CH₄也是一种甜菜碱降解的产物(46]。CH的化学计量的生产₄是1摩尔每摩尔的甜菜碱降解[47]。尽管如此,Methanobrevibacter还与CH拥有很强的正相关关系₄形成相反Methanosphaera与CH,这是负相关₄在液相中形成。这两个属之间的负相关与CH₄支持先前的研究在活的有机体内(48]。然而,Methanobrevibacter有很强的负相关和CH的形成₄和(2 h)纳入CH₄在固相。因此,成员Methanobrevibacter可能是活跃在清除H₂在液相中,可能由于syntrophic与原生动物,它提供了一个稳定供应的H₂底物(49]。相比之下,固相的成员Methanobrevibacter显示活动较少,这也可能被解释成一个更高的竞争H₂在固相这一组的成员更加多样化,在固相液相(44]。在一个在活的有机体内研究中,挑出et al。50没有找到相关的CH₄与Methanobrevibacter和Methanosphaera在属级牛瘤胃的;然而,在物种水平,Methanobrevibacter gottschalkii与CH表现正相关₄相反Methanobrevibacter ruminantium。然而,在当前的研究中,识别测序古生菌的物种水平是不可能的结果进行比较。固体和液体之间的分类组成阶段不同只属Methanosaeta。严格aceticlastic这个属的成员,他们的独家在液相的存在可能是由于醋酸生产液相由于甜菜碱降解相比,更可以在digesta由于生产醋酸纤维降解[42,46,51]。目前的研究表明,尽管类似的发展史,古生菌组有不同的角色在瘤胃微环境和这些群体之间的竞争取决于基质的可用性。

5。结论

的成员Methanobrevibacter、Vadin说出Methanosphaera属是最丰富的类群在液体和固体阶段。渗透压力提供了一个更具挑战性的环境中发酵,影响古生菌的多样性和相对丰富社区相比,热应力。古细菌中发现的液相不太宽容渗透压力比固相。在属级,Methanimicrococcus在固相,在两相中Vadin说出是高度敏感的渗透压力和热应力,分别。高剂量的甜菜碱可以降低渗透压力的不利影响古菌多样性在固相液相但不是。然而,即使是低剂量的甜菜碱就足以消除热应力的影响在固相古菌多样性在体外。

数据可用性

测序数据没有限制在BioProject SRA数据库加入PRJNA602990数量。

信息披露

资助者没有参与研究设计;在数据收集、分析、和解释;和决定发表。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢a . Dockner m .野生艾森,s . lein a·森和美国沙玛(学院动物营养和功能性植物化合物,Vetmeduni,维也纳)提供有价值的实验室服务在这个项目。f博士的支持与Rusitec Klevenhusen过程是高度认可。作者感谢k . Dienbauer和大肠Draxler (VetFarm, Vetmeduni,维也纳)供体牛。第一作者由于高等教育委员会(HEC),巴基斯坦的金融支持通过博士学位与奥地利的合作机构国际合作教育和研究(OeAD),奥地利。

补充材料

补充图1:每天为正常pH值的变化同渗重摩和hyperosmolality条件。¹(补充材料)

引用

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古生菌

甜菜碱调节瘤胃古社区和功能在热量和渗透压力条件在体外

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