髋臼活性促进低温下LCFA的甲烷化：筛选中嗜苯胺接种物

抽象的

接种源在污水厌氧处理中起着至关重要的作用。脂类存在于各种废水中，具有很高的产甲烷潜力，但它们的水解会产生对厌氧微生物有抑制作用的长链脂肪酸(LCFAs)。在中温条件下筛选用于含lcfa废水厌氧处理的接种物。然而，还没有在低温下对从含lcfa的废水中生产甲烷的接种进行评价，需要进行评价。在本研究中，对三种接种剂(一种颗粒污泥和两种市政消化池污泥)在低温(10和20℃)下从含lcfa的合成乳品废水(SDW)中产生甲烷进行了评估。甲烷产量(基于mL-CH_4./ G-COD_添加)，使用未驯化颗粒污泥在10天内达到86-65%，使用SDW在10天内达到45-20%，而城市消化池污泥仅在20°C下产生甲烷，而在10°C下即使在培养200天后也不会产生甲烷。研究发现，接种物中的乙酰营养活性对低温下LCFA产甲烷至关重要，突出了其作用Methanosaeta（乙酸分解古细菌）在低温下。细菌类群的来自家庭的存在Syntrophaceae（Syntrophus.和未培养的类群）在接种物被发现是产生甲烷从SDW在10℃很重要。这项研究表明acetotrophic活性和初始微生物群落特性通过高通量测序的扩增子的评价用于选择所述接种物在低温下从含脂质的废水产生甲烷（最多10℃）。

1.介绍

高速率厌氧处理是一种有效的解决方案，用于处理废水器而不用于通气的能量，并同时产生生物能源作为甲烷。由于微生物组成的最佳生长温度范围，融合条件通常用于废水的厌氧处理[1］.然而，许多废水，包括生活和工业废水，在20°C或更低的温度下排放，在这些低温下进行厌氧处理可以提高从处理过程中获得的净能量。

全球每年生产超过7000亿公吨牛奶，这导致了巨大的乳制品废水器的产生[2那3.］.这些乳制品污水含有大量的脂质（35-500mg / L）以及碳水化合物和蛋白质[4.]，并且每个这些成分的存在带来了特殊的挑战。脂质比碳水化合物或蛋白质[更高的产甲烷潜力5.]，但是它们的厌氧处理是由于副产物[其水解的协同抑制作用挑战6.-10.］.单一的化合物(11.那12.]以及工业废水[13.-16.都经过低温厌氧处理。然而，在低温(≤20°C)下厌氧处理脂类的研究仍处于研究阶段。

在脂肪分解，脂质水解成长链脂肪酸（LCFAs），其是抑制性酸生成细菌，产乙酸菌，产甲烷菌和，甚至在低浓度[6.-9.那17.］.例如，在21℃时，30 mg/L亚油酸、30 mg/L油酸和10 mg/L硬脂酸抑制了100 mg/L醋酸酯的甲烷生成[18.那19.］.此外，LCFA通过施加质转移限制和防止乙酰原和产甲烷菌的聚集来阻碍甲烷的生产[20.那21］.虽然在21℃下，已经在批次中研究了LCFA（油酸，硬脂酸和亚油酸）对氢，葡萄糖和丁酸酯发酵的个体和协同抑制作用，但没有报道甲烷生产[7.这就掩盖了LCFA在嗜冷条件下作为产甲烷前体的潜在用途。以前曾在温度低至10和15°C的条件下，对脂肪含量为40 mg-COD/L(通常<总化学需氧量的1%)的乳品废水(4 g-COD/L)进行厌氧处理的研究[22］.最近，对脂质治疗的知识已经扩展到低温，用于评估国内废水中减少温度（4,8和15℃）的脂肪酶活性[23］.然而，LCFA混合物的甲烷生产尚未在脂质中报道 ％在低温下需要进一步的研究。

接种源起着在低温下在厌氧处理，更使至关重要的作用，如在接种微生物群落影响基板降解电位和甲烷生成活性[24那25］.悬浮污泥和颗粒污泥均已用于低温厌氧消化(LTAD)研究，以处理各种废水[13.那15.那22那26-31］.以前的颗粒状到悬浮在低温下的甲烷产量的比较具有对比的结论，它们的适用性似乎是特异性的。在xing等人时在15°C时。[32]与多年冻土部位（湖泊沉积物，池塘和湿地）与融合颗粒污泥相比，甲烷生产率较高（71毫升 - CH_4./ GVSS·D）使用水禽湖沉积物（悬浮污泥）与其他接种物相比，实现了葡萄糖的葡萄糖。相反，当Enright等人时，在15°C时。[30.[将污泥混合物（废物活性污泥，牛粪和非粒状厌氧污泥）与两个颗粒状污泥进行比较，通过醋酸粒子污垢产生更多甲烷₂/ co.₂和乙醇。

在含脂质废水的厌氧处理中，悬浮污泥和颗粒污泥都被用作嗜培素和嗜热条件下的接种物。据报道，粒状污泥适用于由于其较低的比表面积而适用于厌氧LCFA治疗[33]，更高的甲状腺活性（乙酸纤维营养，丙酸酯和乙醇发酵），与悬浮污泥相比，与悬浮污泥相比，在处理油eate（OLR 2-8G-COD / L·D）[34那35］.然而，由于悬浮污泥具有较高的LCFA吸附能力，已建议使用悬浮污泥作为接种源来处理含油酸废水[34那35]，作为基于顺序吸附解吸机理是必需的长链脂肪酸为吸着其降解[36］.因此，需要在低温下评估含LCFA的废水的甲烷生产所需的不同海外区域。

除理化特性外，厌氧污泥的微生物群落组成还受到高脂或LCFA浓度和低温的影响。LCFA降解是通过去除每个碳原子中的2个碳原子来进行的β-氧化循环通常会产生醋酸盐。在微生物群落中β-氧化需要醋生菌与氢养产甲烷菌的联养耦合来维持低氢分压。在中温和嗜热条件下，参与编码消化脂肪、油和油脂(FOG)或LCFA的微生物群落已被高通量扩增子测序破译，而共养体也被认为在它们的降解中发挥了重要作用[37-40］.只有7种产醋菌属Syntrophomonadaceae(类梭状芽胞杆菌)Syntrophaceae(类Deltaproteobacteria) [5.那41]目前已知可以降解LCFA，该家族的细菌Clostridiaceae.（类Clostridia）已经提出降级LCFA [42那43]，从LCFA降解中致意味着来自这3个家庭的细菌分类群的重要性。此外，尚未在低脂质和LCFA含量的废水处理的低温下在低温下建立氢脱甲酸甲烷酮的优势[1那16.那44-48由于在低温下氢的利用在热力学上优于醋酸盐的利用[49］.通过高通量扩增子测序降解含有脂质或LCFA的废水的微生物组件的研究尚未应用于在低温下降解含有脂质或LCFA的废水的微生物组件中的微生物组分可以提供关于所涉及的主要分类赛的新颖见解。

作为LTAD剂的选择取决于其独特的物理化学特性和微生物群落组成,本研究的目的是评估的作用剂来源从LCFA-containing合成甲烷生产乳制品废水(SDW)批化验在低温下20 - 10°C。采用扩增子测序法对批操作前后的微生物群落进行表征，研究孵育过程中微生物群落组成的变化。

2。材料和方法

2.1。接种物和底物

本研究中使用了从局部来源获得的三个接种物 - 两个悬浮污泥和一种颗粒污泥。收集来自市政废水处理厂，Rahola（RD）和Viinikanlahti（VIInikanlahti（VIInikanlahti（VIInikanlahti（VIInikanlahti（VIInikanlahti（VIINIKANLAHTI（VIINIKANLAHTI），芬兰的悬浮岩，用16毫米网眼筛分，并在7°C的氮气吹扫气氛下储存4周。从嗜培素上流厌氧污泥毯（UASB）反应器中获得颗粒状污泥（GS），从燕麦（Jokioinen，芬兰）的β-淀粉酶和乙醇的综合生产中处理废水，并在7中储存在氮气吹扫气氛中3周°C。筛分悬浮和颗粒状污泥的特征（表格1)．

在本研究中使用SDW和乙酸盐作为底物。SDW模拟乳制品废水的成分，含有蛋白质源（酪蛋白水解产物），碳水化合物源（乳糖一水合物）和脂肪源（LCFA混合物）（表2)．LCFA混合物由棕榈酸酯、硬脂酸酯、油酸酯和亚油酸酯组成，其COD比率为30:15:45:10(见表)2）基于乳制品废水器经常发现的LCFA浓度[41那50］.

２.２.分批分析中的甲烷生产

使用120ml血清瓶进行分批研究，液体体积为60mL。在所有测定中，将15ml基板储备溶液（SDW或乙酸盐）和10-30ml接种物（GS，RD或VD）加入到瓶中，以确保基材的2g-COD / L和6g- 瓦醇固体（Vs）/ L的接种物。向由以下（G / L）的瓶子中加入2毫升库存营养溶液：MgSO_4.·7小时₂O（6），NH_4.CL（16.8），kh₂阿宝_4.h·3₂O（0.24），钠₂HPO._4.h·2₂O（0.2），CACL₂h·2₂0（6），酵母提取物（6），FECL₂h·4₂o（0.12），h_3.博_3.（0.003），ZnCl₂（0.003），CUCL₂h·2₂MnCl O (0.002)₂h·4₂O (0.03), Na₂Moo._4.h·2₂CoCl O (0.001)₂h·6₂NiCl O (0.12)₂h·6₂O（0.005），钠₂SEO._3.h·5₂O (0.01)， EDTA(0.06)和使用前用1 mL 36%盐酸酸化的resazurin [51[用蒸馏水将体积调节至60ml。随后，通过加入0.1M氢氧化钠或0.1M盐酸溶液将测定中的pH调节至7.0。顶空用氮气冲洗10分钟并用丁基橡胶塞关闭，以确保厌氧条件后，用铝卷曲盖密封。实验以三份酸盐进行，并在20或10℃下孵育而不摇动。类似地制备没有基质的测定，以充当坯料。在试验（200d）结束时对来自瓶子的上清液和污泥进行取样，用于可溶性鳕鱼（SCOC）和挥发性脂肪酸（VFA）测量和微生物群落分析。用粒状污泥制备的作为接种物的测定将被称为GS，并且在随后的部分中，用市医学消化器倾斜和Vd-rd和Vd的测定分别被称为Rd和Vd。由于在我们的研究（未公布的数据（数据未出版的数据）和37时，由于先前在20°C（数据未公布的数据）和含脂肪的乳制品流出物中的厌氧行为的可能性，因此进行了长途测定持续时间（200d）。°C [52］.

2.3。分析方法和计算

沼气含量（CH_4.，CO.₂,和H₂)的分析使用岛津GC-2010气相色谱仪，配有Porapak N柱和热导检测器。流动相为氦，流速为20 mL/min。注射器、烘箱和检测器温度分别设置为110℃、80℃和110℃。气体的体积是根据[53]和在标准温度和压力（STP）的报道。Liquid supernatant from the bottles at the end of 200 d was filtered through 0.45 μ.m聚醚砜注射器过滤器的sCOD和VFA测量。VFA测定采用岛津ZB-Wax色谱柱，以氦气为载气，流速为19.6 mL/min。进样器和FID检测器温度均为250°C。烤箱温度设定如下:在40°C加热2分钟，然后以20°C/min加热到160°C，以40°C/min加热到220°C，之后温度保持在220°C 2分钟。

使用根据芬兰标准SFS 5504的二色素滴定法测量SCOD。根据APHA 2005和碱度，通过诸如APHA 2005和碱度测量总固体（TS），VS，总悬浮固体（TSS）和挥发性悬浮固体（VSS）。芬兰标准SFS 3005.阴离子的浓度（所以_4.^2－,阿宝_4.^3－, Cl^-)，用Dionex ICS-1600离子色谱系统，配备IonPac AS4A-SC阴离子交换柱，DS6热导池和1.9 mM Na₂CO._3.1.7毫米Nahco_3.as the eluent at a flow rate of 1 mL/min.

基材的盐度测量用于计算溶解的气体（甲烷和二氧化碳）浓度，并使用手持式电导率计WTW COND 3210进行。使用yamamoto等人的恒定值获得Bunsen溶解度系数。[54]应用于估计溶解的甲烷[55］.

通过将溶解在液相中的甲烷加入气相中的甲烷体积并从该值中减去测定坯料中的甲烷产生来确定甲烷的产生。根据在每个测定（ML / G-COD）中产生的甲烷的比例计算甲烷产率（％），以在标准温度和压力（STP）（350mL / g-cod）下每克焦点产生的理论甲烷体积。在开始时，整体质量余额是鳕鱼（表2）和at the end of the 200 d experiment for all the assays.

累积甲烷产量用修正的Gompertz方程拟合: 在哪里是累积甲烷生产（ml-ch_4.）在时间（d），是甲烷生产潜力（ML-CH_4.或ml-ch_4./ GVS），是最大的甲烷生产率（ml-ch_4./ d），和为甲烷生产的滞后阶段(d)，利用MATLAB R2017b中的曲线拟合工具计算滞后阶段( ）最大的甲烷生产率（ )．

２.４.DNA提取、定量和16S rRNA扩增子测序

微生物样品（三个接种物和从200天孵育后的所有测定）立即在取样时立即储存在-20℃。在4℃下解冻样品后，将总DNA与来自微生物样品的RNA共递减[56］.提取的DNA的浓度用一个量子位荧光（Life Technologies公司）进行定量，并使用NanoDrop分光光度计（纳米滴技术，威尔明顿，USA）测量DNA的纯度。将DNA样品送至FISABIO（西班牙）的16S rRNA基因的V4区域的PCR扩增用通用引物515f和806R [57用Illumina Miseq平台进行扩增子测序。

2.5。生物信息学和统计工具

使用微生物生态学定量洞察(QIIME v1.9)管道对测序数据进行计算分析[58］.The average length of the forward and reverse reads was 291 and 294 bp, respectively. The paired-end reads were joined using a fastq-join method [59]最小重叠为50 bp和15％的perc_max_diff，之后使用qiime中的split_libraries_fastq.py脚本进行质量过滤[58］.对序列进行聚类成使用开参考OTU与BLAST方法拾取操作分类单元（的OTU）中，并与各级的席尔瓦128共识分类学分类法进行分配[60.那61.］.使用ChimerasLayer识别嵌合序列，并且使用脚本make_otu_table.py从非分荷序列生成最终OTU表。

数据集共包含5743805条序列，相似性为97%，聚类为12326条OTUs。有127个丰富的otu组成了99.9%的群落，为alpha多样性度量(样本内的多样性)，将其下采样到均匀的测序深度26511(基于最小样本中的reads数量)。利用Chao1指数和Shannon指数以及观测到的OTUs数量估算了群落多样性和物种丰富度。接种重复和试验重复的alpha多样性指数分别表示为200 d后接种重复内或试验重复内的微生物群落组成的平均值。

由代表127个最丰富的OTU的序列组成的序列采样数据集用于随后的分析。均匀的OTU表是偶数分布的第四根转换，并且在多变量生态研究（Primer）V7中的普利茅斯常规中使用Bray-Curtis相似性构建了相似的矩阵。62.］.采用聚类分析方法对低温处理含lcfa废水中不同接种剂的微生物群落进行了分析。在分类级水平对操作分类单元(OTUs)进行聚类分析，并分别对检测样品进行聚类分析，绘制树状图。采用四根转化OTU表，用树状图表示遮荫样地的微生物群落组成。

3.结果与讨论

3.1。接种特征和微生物群落组成

3.1.1。物理化学特征

在三种嗜苯胺中，与市医学蒸煮器污泥和VD（0.55）相比，粒状污泥（GS）具有较高的VS：TS比（0.86） - 与市医学蒸煮器污泥相比，GS具有较低的SCOD（520 Vs.1100-2500 mg / l）（表1)．GS中含有一定量的挥发性脂肪酸(147 mg/L)，但在两种污泥中挥发性脂肪酸均低于检测限。这两种市政消化池污泥的几种性质不同;例如TS、sCOD和PO_4.^3－浓度有几倍的差异(表1）建议流入废水特性和工厂运行的影响，随着两个城市污水处理设施具有类似的单位过程，这是初级沉降和活性污泥工艺，其次是嗜苯胺的厌氧消化产生的过量污泥。

3.1.2。接种菌的微生物群落组成

使用高通量扩增子测序来研究三个接种物的微生物群落组成。与GS Inoculum（Chao1：93，Shannon：3.69，观察到的Shannon：3.69，观察到的，Shannon：4.53-4.73，Shannon：4.53-4.73）进行了更高的微生物群落分集（Chao1：104-108，Shannon：103-105）79）（表3.），尽管三个接种物是从碘反应器获得的。细菌课程Anaerolineae（相对丰度7.4-23.25％），Clostridia（相对丰度0.1-0.6％），并Synergistia（相对丰度6.3-10.6％）和古细菌类Methanomicrobia(相对丰度7.8 ~ 19%)。城市消化池污泥(RD和VD)虽然具有相似的微生物群落组成，但相对丰度较高Methanomicrobia(13比7%)和Anaerolineae（23 vs.13％）在RD中比VD接种物更高。总体而言，Gs Inculum具有高相对丰富的methanobacteria.（21.5％），未审查Aminicenantes.（25％），和Deltaproteobacteria(5%)，与市政消化池污泥相比。

3种接种方式的微生物群落组成和多样性不同。城市消化池污泥中微生物群落多样性较高(表1)3.）可能是由于城市废水处理厂收到的各种基材。相比之下，Gs来自UASB治疗碳水化合物和基于酒精的废水，这潜在地缩小了微生物群落的多样性。

迄今为止，课程中只有7种Clostridia或者Deltaproteobacteria可以降解LCFA(碳 ）其中只有4种（Syntrophomonas sapovorans那Syntrophomonas curvata.那Syntrophomonas zehnderi,Thermosyntropha lipolytica)从班上Clostridia目前已知可以降解不饱和低碳氟利昂，例如油酸盐和亚油酸盐[5.]，也在各种lcfa喂食的消化器中发现[63.-66.］.此外，在低温下，三角洲变形菌纲与古菌纲一起发挥着重要作用methanobacteria.和Methanomicrobia[22那44那45那47那67.那68.］.因此，监测属于该纲的细菌和古菌类群Deltaproteobacteria和Clostridia,methanobacteria.和Methanomicrobia分别考虑了在本研究的低温下调查厌氧LCFA治疗的同时考虑特殊兴趣。

3.2。来自SDW和乙酸盐的低温下的甲烷生产

三种不同的接种物用于从SDW甲烷生产和乙酸的电势以分批测定中在10研究，20℃（图1)．制备不添加底物的空白测定法，以减去添加底物的相应测定法的甲烷产量。累积产甲烷曲线采用Gompertz方程( -方形：0.9-0.99）并用于计算滞后时间和最大甲烷的生产率（ ）。

颗粒污泥(GS)接种物在20℃(0.6 d)和10℃(1.5 d)条件下均能迅速开始产甲烷，而其他两种接种物(VD、RD)的滞后期更长且相似(20-23 d) (λ.)在10°C醋酸酯和SDW。然而，在20℃时，VD的滞后期是RD的几倍(分别为18-50 d和4-9 d)(图1、表4.)．在20°C与GS相当或更高，而不是由SDW（1.6和0.9）和醋酸酯（9.5和1）的城市消化器污染。在10°C的SDW时，GS高4.7倍而其他的RD和VD方法在10°C下产生的甲烷很少4.)．10天内甲烷产率在粒状污泥-86和65％与乙酸盐和65％的乙酸盐分别与20和10°C的SDW分别高于45％和20％（图1），与城市消化器污泥相比（甲烷产量小于20％）。200天后，具有颗粒污泥的甲烷产率在20和10℃的乙酸盐（分别为83-95％和91-95％）或SDW（分别为70-82％和79-85％）（表4.)．相比之下，乙酸和SDW与市政消化池污泥(RD和VD)的甲烷产率在20°C(分别为75-93%和60-75%)远高于10°C(<20%)。结果表明，城市消化池污泥受温度影响较大。RD在10°C下用SDW产甲烷，而乙酸不产甲烷，乙酸是一种比SDW更简单的甲烷前体。

在20°C下，三种接种剂的sCOD去除率相似，SDW去除率为78-81%，醋酸去除率为81-90%(图2)。S1)，但在10℃时，GS对sCOD的去除率(添加sdw的比例为82%，添加醋酸的比例为91%)高于城市消化池污泥。尽管在10°C下市政消化池污泥的sCOD去除率为29-53%(图。S1)，甲烷产量低(甲烷 ％）表明ScoD去除显然是由于接种物生物量的吸附[36］.200 d后，仅在10°C的市政消化池污泥中检测到VFAs (SDW总VFAs为290 ~ 780 mg/L，醋酸总VFAs为760 ~ 1070 mg/L)。在SDW中，最丰富的VFA是醋酸酯(110-580 mg/L)，而在醋酸酯喂养的测定中，只发现醋酸酯(760-1070 mg/L)(图)2)，提示对乙酰营养活性有抑制作用。鳕鱼平衡(图3.)结果表明，200 d后，醋酸盐和SDW测定的sCOD(非vfa)分别为9-19%和19-23%。这种非vfa sCOD可能是由于内源性衰变产物的释放而产生的。与20°C相比，醋酸盐和SDW测定中未计算的COD在10°C时增加(图)3.)，可能是由于细胞生长或基质吸附到生物量。VFA积累对pH无影响，实验结束时，在20℃和10℃条件下，VFA积累均为6.9-7.1。

从20和10℃的GS的乙酸盐或SDW的甲烷产生表明，通过GS的厌氧结合代谢来自碳水化合物（乳糖），蛋白质（酪蛋白）和LCFA（饱和和不饱和）级分的鳕鱼（图3.)．相反，RD和VD测定中的温度降低降低。此外，在10℃下，SDW水解的分数（VFA-COD和CH的总和_4.- 在图中3.）<50％，表明碳水化合物和蛋白质级分的水解和酸化也在10℃下降低。即使在10℃的乙酸乙酯的测定中，在RD和VD测定中检测到小于50％的底物吸收。高氢部分压力的存在限制了Syntrophic LCFA劣化β- 氧化，LCFA进一步抑制厌氧微生物聚焦中的营养基团，其可能在10℃下影响SDW摄取。然而，在10℃下的底物摄取（醋酸和SDW）在RD和VD中通过氢气积聚/增加的氢分压而不会大致限制，因为在气相中未发现氢。因此，缺乏底物摄取与10℃的消化植物中胰抗营养活性的抑制有关。

以前，据报道，单个LCFA-亚油酸（30mg / L），油酸（30mg / L）和硬脂酸（10mg / L） - 在21℃下抑制100mg / L乙酸盐的甲烷化[18.那19.］.然而，在本研究中，SDW中存在的LCFAs (34.7 mg/L亚油酸盐、91.2 mg/L油酸盐和33.8 mg/L硬脂酸盐)在20和10°C下被GS转化为甲烷，在20°C下被两个市政消化池污泥转化为甲烷(图1)．In spite of a higher LCFA load in the current experiment (38 mg LCFA/g·VS) than the inhibitory concentration reported elsewhere with a single LCFA (20 mg LCFA/g·VS and 6.67 mg LCFA/g·VS at 21°C [18.那19.]），从本研究中的饱和和不饱和LCFA的混合物中产生甲烷。据我们所知，这是在10℃下含有不饱和LCFA（油eate和LiNolee）的LCFA混合物的第一个甲烷生产的第一份报告，其中甲烷产生由接种物质驱动。这些结果可用于了解和开发含脂质处理和甲烷生产的厌氧工艺。

３．３．低温和SDW对微生物群落组成的影响

3.3.1。200d后微生物群落多样性

由于三个接种物中的微生物群落组合物的相对丰度的差异，以及在不同温度和底物的测定中的不同甲烷产生，预计200 d潜伏期后，预计细菌和古出分类群的潜在变化。高通量扩增子测序用于在200天后研究测定中的微生物群落组合物。发现总共12326个Otus，其中99.9％的微生物群落属于127个oTus，由33种细菌和4个古代课程组成。因此，征集的一小部分（占总OTU的0.01％）包含99.9％的微生物群落。此外，与他们的接种物相比，即使在200岁之后，与GS（Chao1：93，Shannon相比，市医学蒸煮器污泥（Chao1：106-116）具有更高的微生物多样性（Chao1：106-116，Shannon：4.31-5.13）：3.69，观察到，79）（表3.)．基于Chao1和观察到的OTU的数量，社区多样性在VD和Rd中增加，但在200天期间，GS无关，无关，温度或基材。

3.3.2。200天后的古代课程的相对丰富

通过其相对丰度的变化评估了在200d潜伏期后改变的细菌和古出分类群。进一步讨论了具有高于0.1％以上的OTU的OTU。在所有测定中，发现了9个古奥鲁斯属于methanobacteria.(3辣子鸡)Methanomicrobia(3辣子鸡)Thermoplasmata(1 OTU)和WCHA1-57 (2 OTU)。班上methanobacteria.与VD和RD(小于7%)相比，GS测定的相对丰度更高(13-19%)(图4.），但与不含温度特异性或底物特异性趋势的GS接种物（21％）相比，其相对丰度在培养期上降低。班上Methanomicrobia与VD(在10°C时从13%增加到19-23%)和RD(在20°C时从8%增加到15-20%)相比，GS(22-28%，从19%增加)的相对丰度更高(图4.)．在类Methanomicrobia，致氢营养的相对丰度甲烷醇素GS含量增加(0.8-6.5% vs. 0.3%)，而氢养型ARC26(模糊分类群)在VD和RD中的相对丰度(0.1-2%)高于GS(图)5.)．Methanosaeta是在200天后发现的唯一acetoclastic archaeal属，并且与Gs（20-25％），Vd（从8.3〜9.1％）相比，其在乙酸乙酯的测定中的相对丰度在20℃下增加。和RD（从5.1到13.8％）。在10°C时，在醋酸乙烯喂食中，相对丰度MethanosaetaGS（20-22％）仍然高，仅在VD（11至24％）增加（图5.)．班级成员methanobacteria.和Methanomicrobia之前已在心理学环境中检测到[69.[厌氧LCFA降解测定[70[还发现在这项研究中普遍存在。

在10°C下用SDW喂食时，用RD和VD法观察到VFA积累(主要是醋酸盐)。此外，在10°C条件下的RD和VD测定中，只消耗了50%的醋酸，产生的甲烷可以忽略不计(图)3.)．即使相对丰度很高Methanosaeta（在本研究中发现的acetoclastic含有植物分类群）在vd和vd和Rd中的氢养虫草株10°C，在10℃下在Rd和Vd测定中产生可忽略不计的甲烷。在RD和VD测定中，在10℃下对肺繁殖活性的这种抑制表明醋酸乙酸乙酸乙酸氧化细菌（SAOB）的乙酸盐吸收。在靠近热力学平衡的较低温度下，萨波的生长可以在较低的温度下保持能力，并且它们的存在在低至7°C的温度下确认[71.-73.］.SAOB是生长缓慢的和在强选择压力的存在已被分离[74.那75.］.在我们的研究中，压力源的存在，比如低温，可能会使醋酸氧化剂与醋酸碎屑产甲烷菌相比，具有吸收醋酸的竞争优势，Methanosaeta。这种优点是通过与氢脱甲酸的乙酸氧化剂赋予醋酸氧化剂，由于较低温度（10℃）的氢脱色途径的更有利的能量。先前通过温度下降观察到从胰抗营养型到肝营养学的甲状腺炎途径的转变[1那47那48]，和长链脂肪酸存在已被已知抑制乙酸分解甲烷多于氢营养甲烷[5.那7.]，从而表明在低温条件下需要保持较高的氢营养活性以生产甲烷。与之前的低温研究相比，本研究强调了通过产甲烷古菌和/或共养醋酸氧化菌(SAOB)在低温下利用LCFA维持高乙酰营养活性的必要性(在本节进一步讨论)３．３．3.)．

3.3.3。200天后的细菌课程的相对丰度

在所有测定中，细菌课程Anaerolineae(相对丰度2.4 - -20%),Clostridia（0.1-0.7％），和Synergistia(6-33%)。的类Bacteroidia和actinobacteria.存在于丰度较高的两个市政污泥消化池比GS（Bacteroidia分别为15-26％，分别为<1％actinobacteria.1-9％与<0.1％）分别为<0.1％），而GS具有更高的未培养Aminicenantes.（15-22％vs.0.2-1.4％）和Deltaproteobacteria（5-14％vs.0.2-2.8％）（图4.)．不同类别的相对丰度的大变化是由于温度和衬底的变化，并且如下所述。

在200d潜伏期后，课程中发现了6个OtusDeltaproteobacteria，其中4属于顺序Syntrophobacterales(家庭SyntrophaeaE（3 Otus），Syntrophaceacheae.(1 OTU))和2的顺序Desulfuromonadales(家庭Geobacteraceae） （数字6.)．乙酰胆碱的相对丰度Syntrophus.和未培养分类群（来自家庭Syntrophaceae）increased in the GS at 10°C (from 3.3% to 9.6-12.3%) during the 200 d incubation (Figure6.），突出从家庭的产乙酸菌的作用Syntrophaceae在10°C的LCFA降解中。家庭成员Syntrophaceae饱和lcfas -棕榈酸酯(C16:0) [65.]、硬脂酸酯(C18:0)和庚酸酯(C17:0) -在中温条件下[66.，并且这个家族中只有一种已知的物种Syntrophaceae-酸养互营菌都具有一个已发现降解的两个饱和LCFAs（棕榈酸（C16：0）和硬脂酸（C18：0））[76.］.酸养互营菌在25-42°C的温度下的增长范围;因此，在10°C的心理溶解生长模式Syntrophus-像类群为代谢不饱和LCFAs（油酸和亚油酸）在本研究中被发现。

此外，在10℃下，GS从衬底SDW的甲烷产率为82％（表2)，由33%的低氯氟烃组成(18%不饱和低氯氟烃(C18:2, C18:1)和15%饱和低氯氟烃(C16:0, C18:0))。因此，本研究证实了饱和和不饱和C16和C18酸在低温(10℃和20℃)下产甲烷的可能性，而同养菌和乙酰养菌则发挥着至关重要的作用。虽然饱和和不饱和LCFAs单独降解和在低温下混合降解的代谢途径尚不清楚，但它们应该通过进一步的研究予以阐明。

另一个重要的类Synergistia（16个Otus）在所有样品中发现（6.3-10.6％）（图4.)．虽然精确的功能Synergistia在降解LCFA的过程中仍未得到证实，但已在嗜中温和嗜热LCFA饲料消化器的核心微生物群中发现[70］.在课堂上的这项研究中发现的16个OtusSynergistia，5属于嗜热或中温氨基酸降解属Thermovirga.[77.]，Lactivibrio[78.),或Aminivibrio[79.］.如酪蛋白在SDW中构成25％COD，预期氨基酸降解剂;但是，其他11个Synergistia类群可能在SDW产甲烷中发挥作用。

在GS,Aminicenantes.与氢营养学密切组成Methanobacteriales（数字7.)．此外，Synergistetes在RD和VD测定中发现了较高的相对丰度，以及最近发现的嗜热SAOB，格莱利亚(订单ThermoanaOrbacterales.）[80，在20°C下用SDW进行GS测定时发现。的分类单元Aminicenantes.那Synergistetes和蒙昧的格莱利亚由于它们在乙酸语法氧化物中的能力和已知作用，是本研究的推定萨波斯[73.那80那81.］.然而，由于这些物种是未经培养的，它们的具体功能无法确定。而联养电子转移则通过Aminicenantes.已经以7℃[低温在分层湖先前建议73.]， 这Synergistetes已经证明用Methanoculleus.和MethanoSarcina在嗜培素的厌氧反应器中[81.］.而且，Geobacter(2个OTUs)在10°C GS检测中富集，同时具有较高的相对丰度Methanosaeta在醋酸盐和SDW测定中。作为Geobacter物质可以促进与互养电子转移Methanosaeta[82.]，也有可能Geobacter介导的乙酸醋酸盐氧化在本研究中。此外，史密斯在市政蒸煮器中被发现，但不在GS中，由于其在22℃下的同步乙酸乙酸氧化中的已知作用，在20°C下，在20°C下的LCFA降解中可能发挥作用。83.］.随着萨宝候选人的数量最近一直在增加，许多萨佛州仍然不为人知，这项研究中苏勃赛的可能性不能排除在较低的温度下。如QPCR等定量方法等先进的分子技术需要评估活动和功能作用所必需的Syntrophus.和Syntrophus-像分类群在降解不饱和和饱和的LCFA（棕榈酸盐，硬脂酸盐，油酸和LiNoLeate）和用于识别推定的SAOB，用于在20°C和10℃的低温下电子转移电子转移。

3.3.4。在微生物群落模式

200 d后，不同检测方法的微生物样本通过树形图和主坐标分析(PCoA)来表示，以识别微生物群落的模式(图)7.和S2)．PCoA分析显示，前两个轴解释了VD、RD和GS污泥中存在的微生物群落变化的80%(第一轴72.5%，第二轴9%)。S2)．遮阳图中的树状图和PCOA图中的相似性均显示RD和VD中的微生物群落组合物彼此相似并在坯料和乙酸盐中的70％相似性和SDW喂养的测定中的70％相似。但是，具有Gs Inculum的测定（坯料，醋酸酯或SdW喂养）的微生物群落组合物在它们之间具有更高的相似性（85％）并从Rd和Vd进一步聚集（图。S2)，而GS的相似性较低(与RD和VD的相似性为66%)(图7.)．

该聚类表明，即使在特定选择压力（温度和底物）在延长孵育时间200天后，微生物社区的组成也没有收敛。在不同的接种物种测定之间发现微生物类别中的重叠的唯一实例是在20℃下乙酸喂食的市医学蒸煮器污泥（图7.和S2)．这表明醋酸的效果在会聚在VD和RD中的微生物群落，虽然VD和RD的甚至初始微生物群落的组合物是类似的。连续反应器中操作还可以揭示微生物群落组件发生的下强选择压力的发展以各种接种物考虑到它们不同的微生物组合物。在20℃下用乙酸或SDW与三个接种物得到的相似的性能（甲烷产生），而不论在初始微生物群落的组合物的差异，表明功能进行了在VD，RD和GS在20保守℃。然而，这种功能保守不是在10℃下有效由于其阻碍了代谢功能，因此甲烷产生在10℃下相比，20℃的强突然选择压力。

互养伙伴（产乙酸细菌以产甲烷古细菌）的存在是为长链脂肪酸降解至关重要，通过穿过其树状同时出现进行评价。该OTU聚类结果表明，细菌类Synergistia和Anaerolineae归入古菌类Methanomicrobia（群集存在于所有样本中）并在20°C下赋予VD，RD和GS的功能保护。另外，在GS，细菌类中Deltaproteobacteria和未受教育的Aminicenantes.归入古菌类methanobacteria.（本簇仅在GS）（图7.），它表示在RD和VD中不存在的GS中的功能冗余。随着最佳代谢物转移，在Syntrophic Partners之间的附近邻近辅助[84.那85.]，在本研究中形成不同的簇（图7.）表示分子水平的结构接近，表明潜在的互动功能作用和推定的生态利基关联。以前，Grabowski等。[66.]已经证明了醋酸根的紧密空间组合的形成Deltaproteobacteria（Syntrophus-相关）与甲状腺原子 -Methanocalculus和Methanosaeta- 原位杂交。在我们的研究中，密切的聚类Deltaproteobacteria和methanobacteria.在GS中可以促进GS的降解能力和甲烷生产。使用涉及细菌醋酸和甲状腺癌的密切聚类分类群的高通量测序（Metagenomics）的研究（如Methanomicrobia和Synergistia和methanobacteria.和Deltaproteobacteria在本研究中)可以证实在簇中参与的融合性伴侣的功能作用。

4.结论

首次证明了混合LCFA(饱和以及单和多不饱和)废水(SDW)在20和10℃的低温下厌氧转化为甲烷。高通量扩增子测序揭示了乙酰营养活性的关键作用Methanosaeta和假定的SAOB和来自该家族的耐冷细菌Syntrophaceae（Syntrophus.和未培养类群)在10°C的LCFA降解。未经驯化的颗粒污泥在SDW下可获得较高的甲烷产率(70-85%)，被发现是处理含LCFA混合废水的20和10°C的合适接种剂。未经驯化的城市消化池污泥可用于在20°C，但不能在较低温度下处理混合lcfa废水。本研究通过评价含lcfa混合废水低温(10°C以下)产甲烷的乙酰营养活性和初始微生物群落特征，为接种物的选择提供依据。

数据可用性

用于支持本研究结果的16S rRNA序列已在项目SRP164945下的NCBI序列读取归档中沉积。

披露

Riitta Kettunen目前的住址是芬兰坦佩雷33800坦佩雷水。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

作者感谢为市政污泥消化池的Viinikanlahti和Rahola城市污水处理厂（芬兰Tampere）。该项目已获得资助下罗多夫斯卡玛丽 - 居里欧洲联合博士（EJD）在先进的生物废物转化为能源技术（ABWET）欧盟展望2020研究和创新计划，在资助协议号643071。

补充材料

图S1:在(a) 20°C和(b) 10°C不同接种剂(GS:颗粒污泥;理查德·道金斯:Rahola Digestate;VD: Viinikanlahti digestate)。图S2:在10°C和20°C条件下，用VD、RD和GS接种，不添加底物(空白)、醋酸盐和合成乳品废水(SDW)的试验中，构成99.9%微生物群落的细菌和古菌类的主坐标分析(PCoA)图。实线和虚线表示样本之间的相似性分别为70%和85%。表S1:多元分析图中使用的样本名称的详细信息。（补充材料）

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