推定的异柠檬酸脱氢酶的晶体结构硫化叶菌tokodaii菌株7在载脂蛋白和NADP中⁺- 行为

抽象的

异柠檬酸脱氢酶是一种分解酶，作用于三羧酸循环的第三步。来自太古菌的ST2166蛋白质硫化叶菌tokodaii被隔离并结晶。它与原核NADP分享高主要结构同源性⁺-依赖的idh，表明这些酶具有共同的酶机制。以apo形式在2.0 Å分辨率下测定ST2166的晶体结构，然后用NADP浸渍晶体结构⁺也确定在2.4 Å分辨率，其中包含NADP⁺结合在假定的活性部位。载脂蛋白和NADP的结构比较⁺- 来自其他原核生物的行为和NADP-IDHS表明，原核NADP-IDHS在域闭合之前在ST2166中使用保守Lys335，Tyr336和Arg386识别其辅助型器。

1.介绍

异柠檬酸脱氢酶（IDH）催化异柠檬酸盐的氧化脱羧剂产生α-ketoglutarate和co.₂在减少官方酰胺酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸盐）（NAD（P）⁺使用二价金属阳离子（mg）至nad（p）h（mg^2＋或者mn.^2＋）在三羧酸循环中。根据辅因子的特异性，已知两个具有IDH活性的同学，NAD⁺- 依赖IDH（EC 1.1.1.41）和NADP⁺- 依赖IDH（NADP-IDH; EC 1.1.1.42）[1-3.］．NADP-IDH可以基于序列相似性分为两个亚壳;亚家族我含有古核和大多数细菌IDH的原核IDH，而亚家族II包括真核和一些细菌IDHS [4.］．虽然亚壳I和II之间的氨基酸序列同一性低（<20％），但IDHS均用作同型二聚体;每个单体由三个域组成：大，小和扣域，并且活动场地位于大型和小域之间。

idh来自大肠杆菌(EcIDH)属于亚科I，被研究得最广泛。用底物/产物在不同的酶态下解决了酶的晶体结构。apo EcIDH既可采用开放构象，也可采用封闭构象，[2那5.］．在将底物/产物的结合到活性位点后，相对于小和扣域诱导大域的大（〜20°）旋转[6.-9.］．ECIDH的催化活性由双官能酶IDH激酶/磷酸酶（ACEK）通过磷酸化/去磷酸化在活性位点附近（称为“磷酸化环”）中的SER113的磷酸化/去磷酸化[2那10］．最近的研究表明，ECIDH的酶活性也通过可逆乙酰化的赖氨酸残留物附近的赖氨酸结合位点和分子表面来控制[11那12］．

所有包含NADP的EcIDH复杂结构⁺采用封闭的构象。其他原核生物NADP-IDHs的结构已被报道，其中IDHs与NADP结合⁺在封闭的构造中，与NADP的ecidh类似⁺，而IDH来自高热Aeropyrum pernix（apidh）可以与NADP结合⁺即使他们的积极点开放，也是偶尔13那14］．这些结构显示出异柠檬酸盐和NADP的单独结合位点⁺，建议原核NADP-IDHS使用随机有序的绑定方案来绑定基板和辅因子[15-17］．然而，在这些结构中，它们具有与辅因子结合的推定残留物，特别是2 -磷酸盐并不完全相同。

NADP的烟酰胺环⁺在原核NADP- idhs与NADP⁺，说明在结晶过程中，辅因子在异柠檬酸存在下被水解。因为EcIDH没有晶体结构，只与NADP配合⁺已公开索取[18]，仍需要进一步的结构信息和见解来阐明原核NADP-IDHs如何以及何时准确识别它们的辅因子。

热酸化毛细管古老的硫化叶菌tokodaii在75℃和pH 3处最佳地生长的应变7在基因组中编码假设IDH的基因组中具有开放阅读帧ST2166 [19］．单体含有409个氨基酸残基，分子量为46,492，分别为IDH的共分序列，氨基酸序列分别与Apidh和EcidH共享50.2％和48.9％的同一性。在这项研究中，我们表达，纯化并确定了APO和NADP中ST2166的晶体结构⁺- 分别为2.0Å和2.4Å分辨率的形式，并讨论了辅助因子识别的机制识别原核NADP-IDHS。

2。材料和方法

２.１.重组蛋白的纯化

根据常规方案制备并纯化ST2166 [20.］．大肠杆菌（Rosetta-gami de3）用质粒pst2166转化，这是来自苏拉姆人教授（大阪大学）的礼物，在含有16克/ l豆荚胰蛋白酶的2x yt培养基中，在37°C下生长在37°C中，含有16克/ L豆荚胰蛋白酶，10g / l豆荚酵母提取物和5g / l NaCl。通过以8000×g离心5分钟收获细胞，用Tris缓冲液（20mM Tris-HCl（pH8.5），1mM EDTA，1mM 2-巯基乙醇和1mM PMSF洗涤。使用超声均化器（150W）的超声处理被收获的细胞破坏。通过以40,000×g离心30分钟除去细胞碎片和大颗粒。将上清液部分在90℃下孵育10分钟，以使固有蛋白质的变性大肠杆菌，取其变性蛋白，4°C, 40000 ×g离心30min。来自大肠杆菌在上清液中沉淀60% (W./V.)，在Tris缓冲液中搅拌3小时，然后在40000 ×g离心30分钟。将上清液应用于25 mL亲和柱(Red-TOYOPEARL)，与Tris缓冲液平衡。蛋白在Tris缓冲液中以0.1-0.8 M NaCl线性梯度洗脱。将含有ST2166的馏分混合，用Tris缓冲液透析，然后用三列HiTrap Q HP色谱柱与Tris缓冲液平衡进行阴离子交换色谱。蛋白在Tris缓冲液中以0-1.0 M NaCl线性梯度洗脱。将含有ST2166的混合馏分用含有1 mM 2-巯基乙醇的20 mM Tris-HCl (pH 7.5)透析，并用centrprep -30 (Amicon)浓缩。

2.2。结晶

对于APO形式的ST2166的结晶，使用重组蛋白质溶液（8mg / ml）。通过在10℃下抵靠含有13％PEG 10,000和100mM HEPES（pH7.5）的结晶溶液的悬液蒸汽扩散方法获得晶体。最终条件雇用了3 μL滴含2μl蛋白质溶液和1 μL结晶溶液。在几天内，Pilar形晶体的尺寸为1×0.1×0.01毫米。

用于与NADP的共晶化⁺，Apo晶体用25毫米NADP浸泡⁺在10℃下在结晶溶液（浸泡溶液）中24小时。

２.３.衍射数据收集

将晶体浸泡在含有30％的结晶或浸泡溶液中10分钟（V./V.蔗糖作为冷冻保护剂。随后，用液氮对它们进行快速冷却。在数据收集过程中，晶体在来自低温流的冷氮气体流下保持在100 K。利用CCD探测器(ADSC Quantum 4)在SPring-8 (Harima, Japan)的BL38B1光束上采集衍射图像。衍射数据用Mosflm处理[21]，scala [22]，截断[23]纳入CCP4计划套件[24］．

2.4。结构分析

ST2166的晶体结构通过使用API​​DH（PDB ID：1V94）的开放形式作为初始模型来解决ST2166的晶体结构;然后，使用CNS1.0执行晶体化改进[25］．使用XtalView进行手工模型构建[26］．随后，apo ST2166的结构被用作带有NADP的复杂结构的初始模型⁺．使用PROCHECK程序对最终模型的质量进行了评估[27］．数据收集和细化的统计数据汇总于表中1．

坐标和结构参数已在蛋白数据库中公布，载脂蛋白的登录代码为2E0C, NADP的登录代码为2E5M⁺- 行为。

图由Clustal W生成[28]，espript [29]和pymol [30.］．

3。结果与讨论

3.1。ST2166 APO形式的整体结构

ST2166结晶为P2单斜晶₁衍射X射线高达2.0埃的分辨率。在该晶体中，非对称单元包含两个单体，其具有几乎相同的整体结构，其具有用于C的根均方偏差（RMSD），用于C的最小二乘拟合α原子的0.18 Å。最终的模型由每个亚基401个氨基酸残基和463个水分子组成。残基101-108，相当于EcIDH中磷酸化环的Cd环和d螺旋(残基97-118)的一部分被打乱。

数据1（a）和1（b）显示APO形式ST2166的二聚体结构。每个亚单位含有17α- 和15.β-链被细分为大结构域(残基1-120和302-409)，小结构域(残基121-153和196-301)和环扣结构域(残基154-195)(图1（d）)．

数字2显示了ST2166、ApIDH和EcIDH的序列比对。400和396 C的二级结构保守，RMSD分别为1.4 Å和2.7 Åα分别在ST2166和ApIDH的开放形式之间和ST2166和EcIDH之间。明显的差异优先见于小区域。ST2166小结构域的g2螺旋与ApIDH共享，而与形成K链的EcIDH不共享。虽然L链在它们之间是保守的，但在EcIDH中与ST2166和ApIDH中的方向相反。

３．２．活性部位

在APO形式的结构中，推定的异柠檬酸结合残基（SER109，ASN111，ARG115，ARG125，ARG149，ASP298，TYR156，LYS223 那ASN225 那和arg274. 那在原核生物NADP-IDHs中，参与异柠檬酸结合的prime指定相邻亚基的残基)暴露在活性位点的深裂内表面(图)3.)．因此，ST2166可能具有与其他原核生物NADP-IDHs相同的催化机制。

3.3。NADP的整体结构⁺- 行为

当Apo晶体用NADP浸泡时⁺，ST2166可以绑定NADP⁺在没有构象变化的有源网站内，RMSD为0.19埃，为401℃α载脂蛋白和NADP之间的原子⁺-bound (holo)形式(图1（a）和1（c）)．与NADP复合的晶体结构⁺每个亚基包含403个氨基酸残基(103-108残基无序)，即NADP⁺， 405个水分子。次级结构也像载脂蛋白一样完全保留。

3．4．活性部位

NADP.⁺与从开放式活性位点的上部裂缝的大域衍生的残留物结合，除了假定的异柠檬酸结合位点，表明基材对其结合位点的接近可能没有限制（图4（a）)．电子密度图清楚地揭示了NADP⁺分子采用U形构象，其中腺嘌呤环和烟酰胺环相对于每个相邻的核糖（图4（b）)．腺嘌呤环与DJ环（N6A-O）中的ASN343的主链氧键合。在深裂中，烟酰胺环与D链（N7N-OE1）的羧基末端中的CD环（O7N-ND2）和GLU327中的ASN111中的侧链相互作用，并且在C链中的Leu99主链（O7N-N / O）。在CD环中，相邻的核糖是粘合到GLU100（O 3-OE1）的侧链和THR101（O2D-N）的主链氮。沿NADP运行的CD循环⁺被这些腺嘌呤和Nicotinamide的NADP夹在一起⁺，二磷酸基以氢键连接到该环中心部分Gly331 (O1A-N)和Ala333 (O2A-N)的主链氮。这些与NADP结合的残基⁺上面描述的ST2166全息形式在位置和方向上与载脂蛋白形式几乎相同，除了Thr101在载脂蛋白形式中是无序的(图4（c）)．

2 -NADP的磷酸盐组⁺与Lys335（OP3-NZ），TYR336（OP2-OH）和ARG386（OP2-NH1）的侧链结合。因为nad.⁺在2处有一个羟基 -部分，大型域与2的直接相互作用 -NADP的磷酸盐组⁺来自单个亚基负责NADP的歧视⁺从NAD为ST2166的开放形式的辅助因子。值得注意的是，前三个残留物来自短短3₁₀在DJ循环中形成的螺旋，后者来自L螺旋（图4（a）和5（a）)．因此，它们可能用作2的刚性结合位点 -NADP的磷酸盐组⁺．

3.5。识别辅子认可的见解

Lys335、Tyr336和Arg386与2相互作用 -NADP的磷酸盐组⁺在ST2166(图5（a）)．在APIDH的三元复合体的开放亚基中，2 -NADP的磷酸盐组⁺确实与相应的Tyr349和Arg400和Lys348相互作用，而靠近（6.2埃）（图5（b）)．由于这些残基在原核生物NADP-IDHs中完全保守，这种结合模式在确定辅因子识别模式中发挥重要作用。

另一方面，两种方式的结合 -NADP的磷酸盐组⁺在闭合构象中是不同的。在ApIDH三元配合物的闭合亚基中，2 -NADP的磷酸盐组⁺与Tyr349的侧链Gln292相互作用 那和arg296.（对应于TYR336，GLN279 那和arg283.在ST2166分别）在活动位点（图5 (c))．EcIDH与NADP形成闭合构象⁺和异柠檬酸，其中Tyr345、Tyr391和Arg395(分别对应ST2166中的Tyr336、Gln382和Arg386)参与与2结合 -NADP的磷酸盐组⁺（数字5 (d))．这些观察结果表明，在生物体之间封闭形式的结合残留物有些不同。这些相互作用总结在表中2．

有趣的是要注意，DJ环路中的骨干螺旋结构对应于3₁₀ST2166的螺旋通常在Subfamily II的NADP-IDH中找到。真核生物的IDH.酿酒酵母属于子家族II与2互动 -NADP的磷酸盐组⁺通过ARG316和HIS317（对应于ST2166的LYS335和TYR336）。残留物来自α11，它被建议作为封闭形式的盖子，覆盖活性位点裂缝[31］．来自嗜热性嗜热性嗜热菌的结构之间的比较Clostridium Thermocellum.和心理学Desulfotalea心理摄影菌通过移动螺旋模块，显示包括螺旋模块的大域的锁定机制到小域α11 (32那33］．因此，DJ环路中的螺旋结构可能参与调节酶活性位点在亚家族II IDHS中的酶活性。对于原核纳迪普 - IDH，3₁₀在ST2166中发现的Dj loop中的helix也在ApIDH中形成，但在EcIDH中没有(图)5.)．已知AceK通过EcIDH中Ser113位点的磷酸化调控催化活性，仅在革兰氏阴性菌中起作用，而在两种细菌中均不起作用美国tokodaii或答:pernix由于缺少AceK认可所需的结构要素[34-36］．因此，ST2166和ApIDH中的这些螺旋结构可能与II亚家族IDHs等封闭构象的调控机制有关。

ST2166的载波晶体经柠檬酸浸渍后易断裂，但未见NADP⁺，建议拟柠檬酸盐模仿底物亚硝酸盐可以与酶的开口活性位点结合，并诱导大构象变化以破坏晶格。因此，NADP的结合⁺在ST2166中，对于大的域移动不是必需的。也可以想象，异柠檬酸或NADP的结合⁺是相互独立的nadp - idh，包括ApIDH和EcIDH。然而，NADP之间有一些相互作用⁺已经通过与它们络合的结构中的酶的磷酸化环来观察并偶乙酸酯。在APIDH的闭合亚基中，烟酰胺核糖核糖与THR112（O3D-N）的主链氮相互作用以及γ- 甲基硝酸盐（O2D-O3）的羧基。这γ- 羧酸盐基团也靠近Thro112（O3-OG1）的侧链氢键。在APIDH的开放亚基中，THR112的侧链与核糖相互作用，如在均匀的ECIDH（O2D-OG1）的相应TH104中所见。这些结构确实包含NADP⁺和异柠檬酸在开放和关闭的活性位点;然而，NADP的烟酰胺部分⁺是混乱的。相反，完全有序电子密度用于绑定NADP⁺在与NADP的eCIDH的假迈克莱斯综合体中观察到⁺异柠檬酸和钙^2＋在封闭形式，加利福尼亚州^2＋作为MG的竞争性抑制剂^2＋/锰^2＋[7.那37］．考虑到THR101的主链使氢键与NADP的烟酰胺核糖⁺在ST2166的Holo形式中向推定的异柠檬酸嵌腔引导侧链，建议NADP⁺应该已经在活性网站内识别并进行到有效催化活动的域闭合。

EcIDH的7倍突变体Cys201Met/Cys332Tyr/Lys344Asp/Tyr345Ile/Val351Ala/Tyr391Lys/Arg395Ser从NADP中转化为辅助因子特异性⁺为nad.⁺，这是由两者的相互作用决定的 -NAD的羟基⁺位置344,345,391和395 [38］．因为ECIDH的TYR391在ST2166和APIDH中占据了GLN，并且在原核NADP-IDH中不保守，因此这些残留物可能不参与与NADP的互动⁺．在ST2166的位置344,345和391处的其他三个残基对应于Lys335，Tyr336和Arg386，并结合2 -NADP的磷酸盐组⁺，这些残留物在原核生物NADP-IDH中完全保守，包括APIDH和ECIDH。因此，可以想到，原核生物NADP-IDH中的辅因子选择性由三个残基LYS335，TYR336和ARG386在ST2166结合到2中 -NADP的磷酸盐组⁺在开放形式，不处于封闭形式。

4。结论

在这项研究中，推定的IDH来自美国tokodaii， ST2166，在载脂蛋白和NADP中结晶⁺- 写形式。因为ST2166显示了与其他原核NADP依赖性IDH，ECIDH和APIDH的高（〜50％）氨基酸序列的相同，研究了与辅因子选择性相关的共同特征。结构显示NADP⁺分子可以在ST2166和Lys335和Tyr336中紧密结合，并且arg386与2相互作用 -NADP的磷酸基⁺．因为这些残留物在原核NADP-IDH之间完全保守，我们提出了ST2166中的LYS335，TYR336和ARG386对于Cofactor识别和结合NADP是必不可少的⁺在原核IDHS中的域闭合之前。

数据可用性

坐标和结构参数已在蛋白数据库中公布，载脂蛋白的登录代码为2E0C, NADP的登录代码为2E5M⁺- 行为。

的利益冲突

提交人声明他们对本文的出版物没有竞争利益。

致谢

作者感谢Spring-8（日本Harima，Harima）的Beamline员工进行数据收集期间的技术援助。他们还感谢Tsutomu Kouyama和Kunio Ihara教授的宝贵意见。这项工作得到了支持Tanpaku3000MEXT(代谢组)。

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