假定的一氧化氮氧化物歧化酶（NOD）的阿尔卑斯湿地有新的主导子集群和一个甲烷汇的潜在能力的发生

抽象的

最近，已经提出了一种新的含氧途径，基于假定的抑制酶（NOD）的歧视症。除了氮循环的新方法之外，该方法还为厌氧条件下底物降解的生态优势，这对于废水处理具有重要意义。然而，水生环境中的点头分布很少被调查。在这项研究中，我们获得了点头丰富的基因为2.38±0.96×10^5.从Zoige湿地复制每克干燥的土壤，并对相应的点头序列中的分子特性对齐。这些点头序列不仅存在于NC10细菌中存在，但也发现与来自WWTP反应器或受污染的含水层的点头序列形成一些其他簇。此外，含水层 - 类似群体中的新子簇甚至在Zoige湿地中占据了占主导地位，并被命名为Z-Aquifer Subcluster。此外，来自Zoige湿地的土壤显示出高潜力率（10.97±1.42 Nmol Co_2.每天每天克干旱土壤）对于亚硝酸盐依赖性厌氧甲烷氧化（N-DAMO），具有低丰度的NC10细菌，这可能表明在考虑Z含水层亚克森特点头的优势时，在其他簇中的点头潜在的潜在活动。总之，我们首次验证了高山湿地的点头，并发现了一个在Zoige湿地中占据占主导地位的新子簇。此外，这种新的点头甚至可以在该高山湿地的N-DAMO过程中活跃，这需要进一步研究以确认。

1.介绍

光合作用是一种众所周知的生物途径，产生氧气，但这不是唯一的途径。近年来，除了氯酸盐呼吸外[1.]以及活性氧的解毒作用[2.]提出了一种新的氧形成途径。新途径能够在氮氧化物中产生厌氧条件下的氧气（除了n_2.O） 作为基质[3.]，这对于富含氮氧化物的厌氧环境中有机物质的降解和氧化是非常有利的，例如湿地和​​废水。

这一途径的关键步骤是NO与假定的NO歧化酶(Nod)的歧化[3.–6.]。点头首先由“为主的富集培养提出Candidatus.甲基咪唑anyivera，“NC10 Phylum中的代表性物种[7.,8.]。目前，据报道，NC10细菌存在于各种环境中，例如湖泊[9,10.]，河流[11.]， 稻田 [12.]，海洋环境[13.]，尤其是湿地[14.–16.]。不过，也有环境点头序列的报道很少。在亚硝酸盐依赖性厌氧甲烷氧化（N-DAMO）反应器接种河流沉积物，点头首先用特异引物检测基因[17.]。然后，点头基因被报道在污染的含水层和废水处理系统[丰富18.]。除了这些，点头海洋最低含氧水体转录物也报道[13.]。

除了NC10细菌外，还推测NOD以存在于骨管反硝化中γ.-变形杆菌菌株HdN1，可在厌氧条件下，在含有硝酸盐或亚硝酸盐的C6至C30（十六烷除外）烷烃上生长[5.,6.,19.]. 这意味着Nod不仅存在于NC10门中，也存在于其他可以利用氧气激活底物的微生物中[6.]。直接调查NOD比仅对NC10的调查更有价值，特别是在理解这种含氧途径的环境意义方面。

随着NOD产生的氧气，NC10细菌能够在亚硝酸盐作为电子受体的亚硝酸盐条件下甲烷氧化甲烷[3.]。nc10和“Candidatus.甲烷丙烯酸甲酯，“一种氧化硝酸甲烷作为电子受体的古群，在一起进行完全的厌氧甲烷氧化（达摩）。DAMO过程不仅提供氮气和碳循环之间的独特链接[20.]但也被认为是WWTP的可持续运作的解决方案[21.]。因此，水生环境中关键酶NOD的研究不仅将促进生物地球化学循环中物质代谢的理解，而且还可能为废水处理操作提供更好的解决方案。

Zoige湿地位于西藏高原，是典型的高山湿地，巨大的碳储存巨大的甲烷排放[22.]。湿地存在NC10细菌的患病率[14.–16.[湿地在湿地中的存在和生态意义仍然缺乏。在此，我们提出以下假设：（1）在该高山湿地中存在NOD，（2）含有点头的微生物可以在天然湿地的甲烷汇中发挥作用。

2.材料和方法

2.1。抽样方法

在这项研究中所使用的样品来自若尔盖湿，位于青藏高原。三个采样整个若尔盖湿地的网站在此研究中设置。For each sampling site, a five-point sampling method was used and sampling depths were 10 to 20 cm below the soil surface. For all the sampling sites, a depth of about 5 to 15 cm of standing water remained during the sampling period. The fresh soils were transported at 4°C to the laboratory. All experiments in this study were conducted in triplicates.

2.2。DNA孤立

DNA使用之前描述的方法分离土壤[23.]略有修改。从MP Biomedicals的裂解矩阵E试管用FastPrep-24由相同的公司用于裂解步骤。总核酸沉淀之前，用10的终浓度加入RNA酶储液 μ.g / ml。在37℃下孵育至少1小时后，通过重复混合氯仿 - 异戊醇（24：1）并重复离心除去添加的酶。通过琼脂糖凝胶分析检查所得DNA溶液的质量，用Nanodrop®ND-1000紫外 - Vis分光光度计（Nanodrop Technologies，Wilmington，De，USA）测量浓度。

2.3. PCR和qPCR

使用5-或10倍稀释5-或10倍的DNA样品用作PCR和QPCR分析的模板。用于PCR和QPCR的引物对点头基因分别是nod684fv2 / nod1706rv2和nod1446f / nod1706rv2 [18.]。用于NC10 16S rRNA基因的QPCR的引物对是QP2F / QP2R [8.]. PCR反应使用26个样本进行 μ.l以下组成：22 μ.L金星T6超级PCR混合（1.1X）（北京清克生物科技有限公司），1 μ.每个底漆的l（10 μ.M） ，及 μ.l模板DNA。该程序如下：98℃，2分钟，其次为37次98℃，57℃，20s，72℃，30秒。然后，72℃的最终5分钟延伸。通过在PLB载体中克隆和测序验证来自QPCR产物的序列，然后用作标准点头基因和NC10 16S rRNA基因。标准曲线浓度点头基因来自2.580×10^3.至2.580 × 10^10.每克土壤的份数。NC10 16S rRNA基因的标准曲线浓度为2.183 × 10^3.至2.183 × 10^10.每克土壤中的副本。一个Bio-Rad公司CFX Connect™的实时PCR检测系统和SYBR®预混防爆的Taq™（TLI酶H加）在定量PCR反应使用。使用的25体积中进行qPCR反应 μ.l以下成分：12.5 μ.SYBR预混实施例的Taq（TLI RNA酶H加）（2×），0.5的升 μ.每个底漆的l（10 μ.m），2 μ.L的DNA模板和9.5 μ.升无菌蒸馏水。The qPCR program was as follows: 95°C for 30 s, followed by 40 cycles of 95°C for 5 s, and 60°C for 30 s. Then, a melt curve was performed with 95°C for 5 s and 60°C to 95°C increasing at a rate of 0.5°C/5 s. The standards and samples were quantified in triplicate, and the analysis was performed with an efficiency of 100 ± 10%.

2.4. 克隆、测序和系统发育分析

的PCR产物点头基因是根据制造商的方案用TIANgel南部纯化试剂盒（TIANGEN，北京）纯化。纯化的PCR产物使用致命基于快速克隆试剂盒（TIANGEN，北京）克隆。的菌落通过PCR和琼脂糖凝胶分析阳性菌落检测，然后阳性菌落的PCR产物进行序列测定。得到的高品质的序列被分配到基于0.03的截止相同的操作分类单元（的OTU）由Mothur。另外，稀疏曲线也与Mothur计算。然后，每个OTU的代表性的序列被翻译到氨基酸和与选定qNor，cNor对准，并且使用先前公开的方法[发表一些点头序列18.]。然后，基于对准文件，使用邻接方法用MEGA7构建系统发育树。

2.5。孵化实验

在一个厌氧盒中，将土壤与无菌厌氧蒸馏水以1：4的体积比混合，除去浆料中的根部。然后，将浆液分成120ml玻璃瓶，每瓶中的10ml浆料。用丁基橡胶塞和铝盖密封后，将这些瓶子从厌氧箱中取出。然后，将瓶子吸尘并用高纯度氩气在五个循环中用高纯度氩气冲洗5分钟。在冲洗的最后一步之后，通过注射器平衡顶空气体中的压力。然后，将这些瓶子在14℃下预孵育116天。在预孵育后，纳米_2.加入了200岁的最终浓度 μ.M在三份瓶中，使用无菌厌氧蒸馏水进行对照。在这些瓶子的顶部空间均为真空并像之前冲洗后，通过相等的体积替换5毫升的顶空气的气体^13.中国_4.（纯度99.9%，原子含量99.8%^13.C）。将样品在14℃温育。生产的生产^13.一氧化碳_2.采用气相色谱质谱仪(GCMS-QP2010 Ultra，岛津)测定。速率是通过生产的线性回归计算的^13.一氧化碳_2.随着时间的推移。

2.6。统计分析

本文中的所有统计分析均使用SPSS软件（美国IBM公司PASW Statistics 18）进行。NC10 16S rRNA基因丰度差异及其意义点头基因通过非参数测试进行。通过一般的线性模型（单变量）计算不同治疗率之间的差异的重要性。

3。结果与讨论

Zoige湿地的土壤的生理化学特性如表所示1.. 定量结果表明，我们获得了该基因的扩增产物点头Zoige湿地的基因，丰富为2.38±0.96×10^5.每克干土复制（图1.). 由于Nod是基于醌依赖性NO还原酶（qNor）的同源序列提出的，因此它与经典的qNor有着密切的系统发育距离，并且Nod的特征是醌结合位点和催化位点中的几个氨基酸替换，这是经典的qNor所必需的[6.,24.]。点头序列（转换为点头在Zoige湿地中回收的序列也在这些关键的氨基酸位点中具有取代，这与其中类似M. Oxyivera.（图2.). 这些结果表明若尔盖湿地实际存在Nod。

定量结果还验证了NC10细菌的存在，丰度为2.80±1.02×10^3.每克干燥土壤复印，这明显低于点头基因（图1.）。这可能是更多的结果点头在一个单一的细胞或基因拷贝数比的16S rRNA点头基因可能存在于除NC10细菌以外的微生物中。在获得的54个高量点头序列（21 oTus）的系统发育分析后，我们发现存在有部分序列与发布的距离大M. Oxyivera.点头序列（图3.). 从若尔盖湿地获得的所有序列形成三个簇，其中一个簇具有已公布的Nod序列，另一个簇具有一些未知的Nor相关序列，这些序列都不同于qNor和cNor（图1）3.）。在密切相关的公开点序列后命名的三个点头簇[18.]，即NC10集群、含水层相似集群和污水处理厂反应器集群。此外，NC10群和含水层相似群中若尔盖湿地的Nod序列甚至形成了亚群，分别命名为Z-NC10亚群和Z-含水层亚群。含水层相似群和污水处理厂反应堆群中的序列不仅与NC10 Nod群不同，而且与HdN1 Nod群也有距离。此外，在与qNor序列对齐时，含水层相似群和污水处理厂反应器群Nod序列中His328和Glu332位点的替换与NC10 Nod序列中的替换不同（图1）2.）。这些结果表明，含水层 - 类似的簇和WWTP反应器簇中的NOD序列来自NC10和HDN1以外的微生物。此外，根据每个簇的相对丰度，这些未知的微生物在Zoige湿地中比NC10更加丰富（图3.）。

随着NOD的活性，NC10能够在亚硝酸盐中氧化甲烷作为电子受体。从Zoige湿地测试土壤的N-Damo活动，^13.中国_4.加入痕量甲烷氧化过程。结果表明，作为电子受体的甲烷氧化速率为15.39±1.29 nmol_2.每天每天克干旱（ ），哪个明显更高（ )比对照中的甲烷氧化速率（4.43±0.43 Nmol CO_2.每天每天克干旱（ ）））（图4.). 这表明若尔盖湿地土壤中存在显著的N-DAMO活性。经计算，甲烷的净氧化速率为10.97 ± 1.42 钴的nmol_2.每天每天克干旱（ ）。根据上一份报告[25.] Zoige湿地的平均甲烷通量约为2.43mg m^−2.H^−1..在目前的研究中测量来自Zoige湿地的土壤密度为0.31g / ml。假设N-DAMO的有源层仅在10-20厘米的深度中，这是当前研究中的采样深度，网N-DAMO为约0.23mg m^−2.H^−1.，这是关于报告的甲烷通量的9.5％。此外，在N DAMO率在我们的研究是类似于minerotrophic泥炭地[14.]甚至高于城市湿地的速度[26.]和一些其他湿[15.]。然而，Zoige湿地的NC10丰富（2.80±1.02×10^3.)其丰度远低于所有这些湿地中的丰度，约为10^6.-10^7.每克土壤中的副本。此外，在这些以往的报告[15.,26.]，当NC10的丰度下降接近10通常是没有检测到N-二DAMO活性^5.每克土壤中的副本。因此，目前研究中的高N-DAMO率可能不仅可以由NC10细菌进行，特别是考虑到ZOIGE湿地的新亚型的主导地位（图3.）。这意味着在一些未知的微生物中的点点也可以在利用氮氧化物中活跃，甚至可以在偶联碳和氮循环中发挥作用。这种猜测需要进一步的研究来确认，例如分析^13.N-Damo工艺中的C标记DNA。

4。结论

这项研究显示出存在点头该基因首次出现在高寒湿地，丰度为2.38±0.96 × 10^5.每克干土的拷贝数。除了报道的NC10细菌的Nod外，还有一些不同的Nod序列和一个甚至在若盖湿地占主导地位的亚簇(Z-aquifer subcluster)。此外，若尔盖湿地土壤表现出较高的N-DAMO速率，而NC10细菌丰度较低，这可能意味着在厌氧条件下，其他群落Nod具有氧化甲烷的潜在能力。然而，这一推测还需要进一步的工作来证实。

数据可用性

本研究中获得的代表点点序列和非相关序列在NCBI下沉积在加入号MG882693〜MG882746下。它也可根据要求提供给相应的作者。

利益冲突

作者宣布没有关于本文的出版物的利益冲突。

致谢

本研究由中国国家自然科学基金（41671270,41001151），中国水污染控制和治疗的主要科学和技术方案（2015ZX07406001）和青年创新促进协会的主要科学和技术方案（2016年）（2016YFC0502104）资助。CAS（2016039）。

补充材料

图S1：本研究中NOD基因库的稀疏曲线。(补充材料)

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