转染的研究与胶体系统含有高纯度双四醚脂质硫化叶菌acidocaldarius

文摘

脂质载体通常用于促进核酸到哺乳动物细胞的转移。在这项研究中,两个分数的四醚脂质古生菌硫化叶菌acidocaldarius使用不同的方法提取和纯化。纯化脂质分数极性脂质分数E (PLFE)和水解glycerol-dialkyl-nonitol四醚(hGDNT)有不同的结构,电荷,大小和混合性从传统的脂质。脂质体是由混合四醚脂质与胆固醇(CH)和1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP)导致稳定的基因传递载体。Lipoplexes是由络合的脂质体荧光素酶表达质粒(pCMV-luc)在某些nitrogen-to-phosphorus (N / P)比率和优化卵巢腺癌瞬时转染的细胞(SK-OV-3)。络合效果被gel-red荧光分析调查。生物物理属性,如尺寸、表面电荷和形态,研究了由微分光散射(DLS)、原子力显微镜(AFM)和扫描电子显微镜(Cryo-SEM),分别揭示脂质体和lipoplexes之间的结构差异。一系列稳定使转染剂包含四醚脂质被合并获得5摩尔%的四醚脂质。Lipoplexes显示减少自由gel-red随着N / P比值表明有效整合质粒DNA (pDNA)和非凡的稳定。转染实验SK-OV-3 lipoplexes透露成功和卓越的转染的细胞系相比商用DOTAP和支化聚乙烯亚胺(25 kDa bPEI)。

1。介绍

目前,转染向量可以大致分为病毒和病毒。从早期的基因疗法,不致病的减毒病毒一直是最常用的输送系统。目前,病毒载体用于全球超过65%的基因治疗临床试验,与腺病毒是最常见,其次是逆转录病毒。病毒具有一种天生的能力,将自己的遗传物质插入到宿主细胞;因此,高转染效率通常是观察各种各样的人体组织。尽管如此显著的优势,有几个对病毒载体的安全性的担忧。包括可能诱发一种强有力的、可能致命的免疫反应,生成复制病毒,主管和生产由于随机插入突变基因转移,可以导致肿瘤形成。此外,病毒载体的能力受到限制,这限制了遗传物质的向量的大小可以容纳。病毒载体如脂质体提供的有前途的替代基于dna的生物制药(1- - - - - -3]然而,前几个问题仍然需要解决脂质体可用于临床设置。的一个主要问题是可怜的脂质体的稳定性和完整性,这部分归因于酯键的水解和氧化不饱和脂肪酸(4]。四醚脂质(运输)是一个独特的脂质发现只在类成员的细胞膜第三域的生活称为古生菌,它可以被认为是有前途的替代常见的脂质脂质体用于药物输送。古生菌的成员已知居住环境从普通到这些特点是极端的盐、温度、pH值,例如,高盐度和碱性湖泊、热酸弹簧,并严格缺氧设置(5- - - - - -7]。醚脂质膜的古生菌的存在被认为是负责他们的不寻常的温度和pH值稳定。醚脂质差别很大从原核和真核脂质,主要区别是碳氢化合物的存在与甘油/半个nonitol桥组由一个醚键,使脂质分子在极端抵抗水解破坏比酯债券的pH值和温度。另一个区别是碳氢化合物本身的结构;古细菌脂质包括支链饱和类异戊二烯,最常见的是C_20.phytanyl,而不是直接链不饱和碳氢化合物在原核和真核细胞膜脂质。未饱和的缺乏保护醚脂质氧化损伤(8]。醚脂质可以大致分为两类:单极和双极。单极醚脂质(二醚脂质)有点类似于常见的脂质结构,有两个烃链链接通过一座桥一部分单头组。双相运输是独一无二的,由于两个头组的存在,一个分子的两端。他们像两个二醚脂类的尾巴被共价结合,出现在古细菌膜的单层。单层安排被认为增加脂质膜的温度和pH值稳定。运输可以进一步细分为两个子类,即glycerol-dialkyl-glycerol四醚(GDGT)或glycerol-dialkyl-nonitol四醚(GDNT)脂质。GDNT-based四醚占总数的70 - 80%或更多的脂质thermoacidophilic古生菌等硫化叶菌acidocaldarius(9,10]。的应用前景之一TEL脂质体是口服药物输送由于pH值稳定在极端条件(10),以及在血清、脂酶和胆汁盐。TEL脂质体已被证明是一个很好的载体等口服交付肽胰岛素(11),皮肤应用程序(12),氯e6光动力治疗(13]。四醚脂质可以修改获取站点特定的相互作用[14]。基因传递、合成或半合成的四醚以及二醚脂类被使用(15- - - - - -17]。在这项研究中,本地纯化nonhydrolysed四醚脂质(PLFE)及其水解脊椎从archaeon (hGDNT)硫化叶菌acidocaldarius结合了辅助脂质胆固醇(CH), L -α磷脂酰胆碱(PC)和阳离子脂质1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP)准备稳定的脂质体。Lipoplexes然后由络合与荧光素酶表达质粒(pCMV-luc)。lipoplexes作为基因运载工具的有效性调查执行SK-OV-3细胞株体外转染研究和比较对支化聚乙烯亚胺(25 kDa bPEI)。此外,运载工具被评为与用于口服基因传递的能力。

2。材料和方法

2.1。一般的材料

冻干的生物量硫化叶菌acidocaldarius从坐(表面和界面技术,Rosenhof GmbH,今天德国)。N - (1 - (2, 3-Dioleoyloxy)丙基)- N, N, N-trimethylammonium氯(DOTAP)的礼物类脂(德国路德维希港)。L -α磷脂酰胆碱是购买的两代情极性脂质(美国亚拉巴马州)和胆固醇是来自Sigma-Aldrich (Taufkirchen,德国)。DNA插入染料gel-red在DMSO溶液(10.000 x)和溴化乙锭(EtBr)获得表达载体(美国加州)和Sigma-Aldrich(密苏里州,美国),分别。从质粒纯化质粒pCMV-luc (pDNA)购买工厂(德国比勒费尔德)。硅胶60(400 - 230目)是来自卡尔罗斯GmbH(德国卡尔斯鲁厄)。反相Chromabond C-18和效果(高性能薄层色谱)板块从Macherey-Nagel购买(Weilmunster,德国)。有机溶剂氯仿(CHCl₃)、甲醇(甲醇)和乙醚(DE)获得VWR国际(美国宾夕法尼亚州)。盐酸从Sigma-Aldrich购买。1 h - nmr,氘氯仿(CDCl₃)获得了从Euriso-Top(温度Cedex、法国)。使用的所有溶剂的液相色谱级。

2.2。细胞培养

SK-OV-3腺癌卵巢细胞从写明ATCC(美国弗吉尼亚州)和购买在Iscove修改杜尔贝科的培养基培养(IMDM),补充10%胎牛血清。单层细胞维持在37°C公司为5%₂和亚文化confluency到达80%。荧光素酶转染研究细胞培养细胞溶解5 x试剂和荧光素从Promega购买(美国威斯康辛州)。皮尔斯BCA化验是购自热科学(美国马萨诸塞州)。

2.3。隔离和净化的四醚脂质

2.3.1。极性脂质部分E (PLFE)

6.3 g的冻干生物量硫化叶菌acidocaldarius杵了15分钟,直到粗好黄/绿色粉末。然后将它转移到索氏提取的提取顶针。500毫升CHCl的混合物₃:甲醇(50:50 v / v)涌入了1000毫升圆底烧瓶(RBF)。提取了48 h使用油浴在80°C。提取、有机溶剂蒸发后留下一个粗糙的瓶壁的脂质层。粗脂质提取就悬浮在甲醇的体积小:H₂O (50: 50 v / v)使用超声波浴,Elmasonic e H从埃尔玛Hans Schmidbauer(德国Singen,理想)。暂停然后转移到Chromabond C-18列。洗脱液用于净化过程是甲醇:H₂O (50: 50 v / v) CHCl₃H:甲醇:₂O (22.5: 55: 22.5 v / v),和CHCl₃H:甲醇:₂O(70: 26日:4 v / v)。

2.3.2。水解脂质(hGDNT)

0.5 g的冻干生物量硫化叶菌acidocaldarius杵,悬浮在500毫升RBF 4 M盐酸。瓶是放在回流冷凝器24 h在100°C。悬架是透过G-4熔块,得到的滤饼干燥之前提取的5倍与在室温下50毫升氯仿。提取集中和转移到硅胶柱。脂质材料被使用溶剂CHCl纯化₃,CHCl₃:德(80:20 v / v)和CHCl₃:甲醇(90:10 v / v)。获得纯化hGDNT最后洗脱液是至关重要的。

2.4。分析四醚脂质

纯化的水解脂质被质谱分析使用Q-Trap 2000(美国应用生物系统公司,促进城市),在ion-spray电离作用(质)。纯化脂质hGDNT稀释到0.1μ在测量之前g / mL。红外光谱的hGDNT记录由一个α傅立叶变换红外光谱仪(美国马萨诸塞州力量Corp .)。5毫克的hGDNT被用来获得透射谱。1 h - nmr研究水解脂质在CDCl溶解在2.5毫克/毫升₃和分析JEOL连成一片- 400自动调谐样本头。效果板被用来识别脂质PLFE CHCl和hGDNT使用移动阶段₃H:甲醇:₂O (22.5: 50: 22.5 v / v)和CHCl₃:甲醇(90:10 v / v),分别。脂质被发现使用甲醇/硫酸喷雾试剂。

2.5。脂质体的制备

脂质体是准备采用薄膜水化法(18]。股票的解决方案的脂质被溶解脂质在CHCl准备₃:甲醇(2:1 v / v)的解决方案。需要大量的脂类解决方案在5毫升RBF混合和蒸发干燥使用Laborota 400旋转蒸发器Heidolph仪器(12月7、德国)创建一个瘦脂质层的墙上瓶(在真空下,280转/分钟)。电影与20毫米水化HBS缓冲区获取6毫克/毫升的脂质浓度,和烧瓶放在浴超声发生器和允许平衡5分钟。然后,烧瓶用了2分钟,直到脂质膜完全重组。脂质体悬浮液进一步挤压通过200 nm和100 nm聚碳酸酯膜(绘画纸)使用一个两代情迷你挤出机(两代情极性脂质)获得小单膜脂质体。对细胞培养实验中,脂质体被filter-sterilised通过0.22μm注射器过滤和储存在4°C到两个星期。

2.6。制备Lipoplexes

脂质体与OPTI-MEM pDNA被稀释。相同体积的pDNA解决方案和脂质体悬浮液混合,磨碎几次,以确保均匀混合。N / P比值计算基于氮含DOTAP脂质(699克/摩尔)和含磷酸基磷pDNA(330克/摩尔)。混合物在室温下被允许站20分钟(过程在无菌条件下进行,当准备转染复合物研究)。

2.7。大小和电动电位测量

水力直径的脂质体和lipoplexes决心通过使用动态光散射莫尔文Zetasizer Nano z使用非侵入式背散射(nib®)。脂质体与Milli-Q稀释(1:10)水和平衡测量前25°C。由设备自动测量subruns设置根据样本。脂质体和DNA被包裹在2.5 N / P(20分钟前测量。电动电势的脂质体和lipoplexes决心在导电率< 100μS /厘米。使用Smoluchowski电动电势的计算方程。

2.8。原子力显微镜(AFM)

脂质体和lipoplexes稀释(1:100)Milli-Q水和用移液器吸取到硅片(1×1厘米²)。10分钟的孵化后,悬架由吸气移除多余的水使脂质体和lipoplexes在硅晶片上。原子力显微镜进行一个NanoWizard®3纳米AFM JPK仪器(德国柏林)。vibration-damped显微镜。商业1-lever技巧(NSC 14 Al / BS)悬臂长度为125μm和共振频率约160赫兹和力常数5 N / m。在空气中所有测量在开发模式下进行。扫描速度是0.5和1.5 Hz之间调整。

2.9。Cryo-Scanning电子显微镜(Cryo-SEM)

10μL(脂质体样本放置在样品架和沉浸在液态氮。样品与罚款叶片断裂的准备室JEOL地产- 7500 f (JEOL有限公司、东京、日本)和sputter-coated铂增加电导率。然后将样品转移到扫描电镜室。仪器维护在−170°C。图像是在2.00伏特的电压。

2.10。pDNA夹层试验

150年μL (lipoplexes增加N / P比值96 -微量滴定板用移液器吸取到一个不透明的。随后,50μL gel-red染料被用移液器吸取到复杂的悬挂在适当的波长和荧光立即被测量。

2.11。毒性研究

麻省理工。毒性研究,比较几种lipoplexes 25 kDa bPEI,进行使用MTT (3 - 4 5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴)试剂(Sigma-Aldrich, Taufkirchen,德国)。10.000细胞/被播种在一夜之间96 -孔板和孵化前的样品。24小时后,转染试剂是吸气和200年μL 2毫克/毫升MTT添加到每个好,其次是进一步孵化3 h。然后,200年μL(添加DMSO溶液是溶解甲瓒晶体。甲瓒的解决方案是使用光谱仪分析在580海里。特里同x - 100, PBS缓冲(pH值7.4),和未经处理的细胞被用作控制。样本分析一式三份。

LDH。LDH测定使用LDH进行细胞毒性工具包(罗氏诊断、巴塞尔、瑞士)。细胞被播种密度为10.000 /好,一夜之间孵化。第二天,细胞处理样品24 h。上层清液然后转移到一个透明的96孔板和LDH测定是根据制造商的协议执行。LDH活性取决于监测丙酮酸的氧化加上减少NAD 340海里。

2.12。转染的研究

SK-OV-3细胞被播种密度在10.000 /转染前24小时。Lipoplexes被添加到细胞在不同的N / P比值导致pDNA 0.5μg /。细胞培养与lipoplexes 4 h IMDM中允许细胞吸收。中,取代它的是一个全新的媒介和细胞进一步培养48 h。与200年细胞随后被清洗μL PBS缓冲和50μL裂解缓冲的添加和放置在一个轨道瓶30分钟。最后,20μL裂解缓冲被转移到一个不透明的微量滴定板96 -好。通过添加50测定荧光素酶的表达量μL的荧光素。发光是表达RLU /毫克(相对发光单元/毫克蛋白)。蛋白质含量是由吸量20μL(裂解缓冲成透明的96孔板。200年μL bicinchoninic试剂添加和孵化的30分钟的轨道振动器。为了确定蛋白质含量、吸光度测量在562 nm和白蛋白为参考标准。

2.13。统计分析

数据表示为平均数±标准差从四个人样本。统计分析是由使用双尾学生的以及在Microsoft Excel。显著差异为代表(),()。

3所示。结果

3.1。分离、纯化和分析四醚脂质

3.1.1。极性脂质部分E (PLFE)

第一的高极性溶剂甲醇:H₂O (50: 50 v / v)筛选了主要色素,它会受到紫外线照射的时候。第二次洗脱液的极性降低导致PLFE。最后洗脱液CHCl₃:甲醇(90:10 v / v)少了极性化合物。包含PLFE的分数被效果分析,硅胶固定相及洗脱液是CHCl组成₃H:甲醇:₂O(70: 26日:4 v / v)。一个现货0.2脂质(图表示3)。

3.1.2。水解脂质(hGDNT)

第一溶剂硅CHCl纯化步骤₃筛选了非极性物质如颜料(橙色乐队)。第二部分是与CHCl筛选了₃:德(80:20 v / v)少了单极物质hGDNT没有nonitol集团。hGDNT终于在最后一步使用CHCl获得₃:甲醇(90:10 v / v)导致一个深棕色的乐队。hGDNT可以进一步净化用冷丙酮沉淀导致resin-like外观。分析了水解脂质hGDNT效果,硅胶作为固定相,洗脱液CHCl组成₃:甲醇(90:10 v / v)使用。一个点表示hGDNT0.2(图4)。

质谱分析(质)hGDNT导致强烈的信号m / z1479年,这表明[M + Na]⁺离子。位于其他特征信号m / z751年和740年,这代表[M + 2 na)^{2 +}和[M + H + Na)^{2 +}分别为离子(图5)。

红外光谱(图记录5)表示hGDNT的官能团。3376厘米的宽带⁻¹对应于哦组。两个锋利的乐队在2921厘米⁻¹和2854厘米⁻¹显示CH, CH₂,CH₃组。乐队在1460厘米⁻¹和1276厘米⁻¹分别是CH2明显和甲基。C-O-C(醚)和C-O-H(羟基)组织的特点是乐队在1102厘米⁻¹和1085厘米⁻¹,分别。一把锋利的乐队在758厘米⁻¹揭示了碳氢键弯曲。

1 h - nmr谱的水解GDNT是按照报告的Lo和张18]:δ0.7 - -0.9 (ch₃),0.95 - -1.4 (ch, ch₂),1.45 - -1.9(环戊基ch), 3.4 - -4.05 (-O-CH -O-CH₂)(图6)。

3.2。大小的决心

见表1和2。

3.3。原子力显微镜(AFM)

形态描述含脂质体的四醚脂质使用AFM显示主要是圆形状的囊泡大小介于50 nm和100海里与DLS测量。脂质体出现不规则的形状和分布在硅表面导致脂质单层(图8)。Lipid-pDNA复合物脂质体配方显示不同的结构,类似于通常提出的“剥离”结构(图9)。与脂质体相比,lipoplexes没有传播到硅表面。

3.4。Cryo-Scanning电子显微镜(Cryo-SEM)

脂质体的四醚脂质,只有完整的囊泡和Cryo-SEM没有骨折的飞机是可见的,指示的紧密包装四醚脂质双分子层内的脂质。

3.5。DNA插入试验

脂质体配方能复杂pDNA以浓度依赖的方式,直到全部络合在2.5到3 N / P比值。这个完美的转染效率最高的相关范围。DOTAP 25 kDa bPEI显示最有效络合pDNA,而所有其他脂质体在绑定pDNA不那么有效。

3.6。毒性研究

参见图12和13。

3.7。转染效率

SK-OV-3细胞系转染研究lipoplexes显示全面合理的转染效率,也就是相当于DOTAP标准。二元混合物,lipoplexes DOTAP导致类似的转染效率。相比之下,将胆固醇和hGDNT到双层导致转染效率的提高,但是减少当PLFE用作稳定剂。通过加入PC和胆固醇,观察转染效率下降30%。

4所示。讨论

据我们所知,这是第一个研究调查潜在的本地高纯度四醚脂质,来自硫化叶菌acidocaldarius,对哺乳动物细胞的转染。两个不同的分数标准化和可复制的萃取过程的四醚脂质ulfolobus acidocaldarius成立。运用索氏提取冻干的生物量、糖以及半个磷酸基的四醚脂质完好无损(图1(一))。其次是净化在Chromabond C-18列,PLFE只能筛选了CHCl组成的流动相₃H:甲醇:₂O (22.5: 55: 22.5 v / v),展示了高极性的糖组在PLFE(图1(一))。效果分析高度极性流动相显示约0.2(图的价值3 (b)),这是按照Lo和张18]。与其他研究结果,没有进一步净化,甲醇是必要的,因为效果分析发现一个位置PLFE分数。Elferink et al。19)有一个范围的点在相应的分数。糖和磷酸基半个可以被一个酸性萃取过程导致极性较弱的四醚脂质(数字1 (b)和4(一))。的程序更简化的相比,波德et al。20.]。使用的流动相CHCl效果分析₃:甲醇(90:10 v / v)显示低极性PLFE相比。值水解脂质,0.3左右,比较hGDNT标准从表面和界面技术(图中获得4 (b))。进一步分析水解的四醚脂质谱显示一系列的山峰在理论质量(图5)。这是由于在分子环戊烷环的存在。水解脂质,钠离子可被检测到。质谱测得的分子量是23克/摩尔理论质量之上,表明hGDNT 1.456克/摩尔。1 h - nmr、IR光谱hGDNT(数字6和7)根据分析显示相关峰值和乐队由有土豆的et al。21]。制备脂质体,四醚脂质和DOTAP组成的,是由5摩尔%利用四醚脂类的稳定效果,纳入脂质双分子层(图2)。类似的观察也是由詹森et al。22),分数最高的四醚脂质18岁摩尔%为了得到稳定脂质体。此外,有土豆的et al。23)表示,5 - 15摩尔%的摩尔分数hGDNT肽通过GIT在提供足够的敏感。脂质体的形态,由Cryo-SEM分析,揭示圆形状的囊泡,没有可见的裂缝飞机,这是常见的传统脂质体(图10)。没有骨折的飞机可以解释紧膜包装的脂质体与四醚脂质作为稳定剂,由汗了,庄24]。lipoplexes的AFM图像显示“剥离”结构(图9 (b)嵌入),脂质体构建核心和pDNA白羽。一层脂质连接,紧随其后的是一层pDNA [25]。络合效果取决于使用gel-red化验显示成功的络合作用的脂质体与pDNA N / P比值在2 - 2.5,在80 - 90%的pDNA复杂化lipoplex内(图11)。优良的络合效率在25 kDa bPEI由于polycationic聚合物的性质有利于粒子的大小60 nm(表2和图9(一个))。转染效率25 kDa bPEI高;然而,价值相比,脂质体DOTAP(图14)。而言,这更有利于使用DOTAP 25 kDa bPEI MTT试验由于毒性较低,只有5%的细胞存活在聚合物的N / P比值最高40%,DOTAP(图12表明高细胞的代谢活动。此外,毒性25 kDa bPEI也影响细胞膜导致更高的乳酸脱氢酶漏(图13),LDH测定。得到了最高的转染效率与lipoplexes积极电动电势由于静电效应发生在lipoplexes与带负电荷的细胞表面交互。统计上显著的转染效率PLFE / DOTAP(5: 95)相比DOTAP可以解释由于四醚脂类的稳定效果,防止pDNA的变性。类似的配方hGDNT / DOTAP(5: 95),糖组的四醚脂质已被移除,更有效地交付pDNA PLFE / DOTAP (5: 95)。考虑几乎相同直径的两种剂型214 nm和322 nm,分别(表2),以及类似的ζ电位,水解稳定的四醚脂太高了,导致更强的保留pDNA。通过加入辅助脂质胆固醇和降低DOTAP的一部分,例如,PLFE / CH DOTAP(5: 45: 50)和hGDNT / CH DOTAP(5: 45: 50),转染效率明显低于上级脂质体配方。两个lipoplex配方与胆固醇显示更大的直径(表2)相比其他配方。尽管电荷,大小的lipoplex获得高转染效率是至关重要的。Lipoplexes在214 nm - 322 nm的尺寸范围,显示最高的转染效率由于最优表面,促进与细胞膜相互作用。在制定包括hGDNT / PC / CH / DOTAP(5: 30: 35: 30),只有60%的pDNA可能复杂化和保护(图11)。这证实了−48.6 mV -电动电势高(表1)表明电动电势主要是由pDNA决定的,这是包裹在脂质体和脂质尾直径约10 nm(图9 (g))。因此,转染效率显著降低其他脂质体系统相比,这主要是由于排斥相互作用的带负电荷的lipoplexes -细胞表面。这是在协议与实验Tabatt et al。26)研究小说lipid-DNA向量,一个负的表面电荷。在创建一个带负电lipoplex基因传递,血小板或胆汁盐聚合可以避免当把车辆进入人体通过注射或口服途径(27]。此外,带负电的粒子可用于遗传物质的pulmonal交付没有与黏液凝胶含有高度糖基化的交互部分。

5。结论

各种四醚脂质可以提取、纯化和纳入球形影响到一定量的纳米脂质体,并稳定。基于四醚脂质转染剂可以很容易地准备通过添加阳离子脂质DOTAP pDNA导致稳定和带正电的lipoplexes。在这项研究中,我们已经表明,lipoplexes包含四醚脂质有显著较高的转染效率相比DOTAP孤单。此外,配方被确认,有可能被绕过用于口服基因治疗血小板和胆汁盐聚合。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感激地感谢坐(表面和界面技术,Rosenhof GmbH,今天德国)请提供冻干的生物量硫化叶菌acidocaldarius。

引用

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