的酸性胞外Haloarcula hispanicaATCC33960及其合成两个基因负责

文摘

1.1×10⁶Da酸性胞外(EPS)从一个极端嗜盐的提纯archaeonHaloarcula hispanicaATCC33960生产30毫克的L⁻¹当生长在- 168中,主要由甘露糖和半乳糖与少量葡萄糖的摩尔比为55.9:43.2:0.9。两个糖基转移酶基因(HAH_1662和HAH_1667)负责确定合成的酸性每股收益。删除的HAH_1662或HAH_1667导致酸性每股收益的损失。突变体显示不同的细胞表面形态、生长阻滞在低盐环境,增加附着力,和游泳的能力。我们的研究结果表明,酸性EPS的生物合成可能充当一个适应性机制,保护细胞免受严酷的环境。

1。介绍

微生物生产系统作为增长战略,坚持固体表面,形成保护屏障,储备营养,生物膜作为一种自适应的生活方式,鼓励在严酷的环境下生存,在不断变化的环境条件下(1- - - - - -4]。每股收益产生的细菌具有广泛的潜在应用在许多工业领域中乳化,稠化,抗氧化剂,螯合剂是必需的5- - - - - -7]。

为了找到系统与小说和有价值的属性,从haloarchaea几个系统已经被分离出来并调查,等Haloferax,Halococcus,Haloarcula,Natronococcus,Haloterrigena,Halobacterium(8- - - - - -12]。结构的几个haloarchaeal系统已经解决了但不知道他们的生物合成13]。每股收益的重复单元Haloferax gibbonsiiATCC33959包含一个主链和两个分支。主链由两个mannosyl和两个半乳糖半个;一个分支包含一个glucosyl一半,另一分支是由半乳糖和rhamnosyl一半(10]。的每股收益Haloferax mediterranei写明ATCC 33500被发现含有甘露糖的杂多糖的主要成分(14]。每股收益的重复单元h . mediterranei包含一个mannosyl和两个N-acetyl-glucosaminuronyl根,一个N-acetyl-glucosaminuronyl组是由一个磺酸基改性(15]。基于的完整基因组序列h . mediterranei一位参与EPS生物合成基因簇h . mediterranei被确定(16]。删除EPS合成基因簇的淘汰。EPS生物合成的突变菌株缺乏显示显著降低粘度和泡沫倾向文化肉汤、溶解氧含量的增加,增强生产PHBV (17]。

Haloarcula hispanica是一个极其嗜盐的archaeon,原来孤立从太阳能盐田在西班牙,和制片人的胞外聚合物给殖民地的一个典型的粘液性质(18]。哈尔。hispanica显示特别低限制活动,因此最驯良的haloarchaea古细菌遗传研究[19]。在这项研究中,我们分离和纯化酸性每股收益哈尔。hispanicaATCC33960。基因缺失的方法,HAH_1662和HAH_1667确定负责生物合成的酸性每股收益。另外,酸性的影响每股收益的增长哈尔。hispanica被评估。

2。材料和方法

2.1。菌株和文化条件

Haloarcula hispanica写明ATCC 33960及其突变株在- 168培养基培养(每1 L, 5 g Bacto Casamino酸,5 g Bacto酵母提取物,1 g谷氨酸钠,柠檬酸三钠的3 g, 20 g MgSO₄h·7₂啊,2 g氯化钾、氯化钠200克、50毫克FeSO₄h·7₂啊,0.36毫克MnCl₂h·4₂O, pH值7.0)。板含有1%琼脂除非提到。Mevinolin(σ)添加到最终的浓度5μg / mL - 168培养基的筛选pUBP突然出现紧张和pWL102互补菌株。pWL-CBD质粒的转化,新生霉素(Calbiochem)添加到最终浓度为0.16μg / mL - 168中。大肠杆菌JM110是生长在LB培养基。在需要时,氨苄青霉素是100年添加到最终的浓度μ克/毫升大肠杆菌。

2.2。EPS的分离和纯化

1 L - 168的细胞培养介质固定相,从文化中删除汤通过离心13000 g×30分钟在4°C。的每股收益从上层清液沉淀增加4倍体积的冷乙醇在一夜之间在4°C。离心收集的降水量在13000 g×30分钟和解决在水里。然后,解决方案是透析对水(分子量截止14 kDa)摆脱盐2天,而最适盐的蛋白质变性沉淀,透析的解决方案是利用离心力分离13000 g×30分钟,上层清液处理10μL Benzonase核酸酶(σ,≥250单位/μL MW 30 kDa)在37°C 12 h,治疗前3毫克蛋白酶K(σ,≥30户/毫克,MW kDa 29日)在37°C 12 h,然后,上层清液集中5倍100 kDa超滤膜(微孔)和冻干。

原油EPS与缓冲可溶性10毫克/毫升(20毫米醋酸钠),通过阴离子交换柱DEAE-Sepharose快流(σ)。洗后与缓冲,EPS绑定到列筛选了由一个线性梯度从缓冲缓冲B(20毫米醋酸钠,2.5 M氯化钠)在5列卷0.5毫升/分钟的流量。列的EPS出现分数从1.25到1.55 M氯化钠。洗脱分数被紫外线监控检测在280 nm, phenol-sulfuric酸反应(20.),而酸性多糖电泳。7.5%的酸性多糖分离页面凝胶和亚甲蓝染色与0.5% 3%醋酸。

然后,酸性EPS分数集中,对水、透析和冻干。冻干EPS可溶性与水在2毫克/毫升,装上Sephacryl s - 400 /小时(通用电气医疗集团)列和筛选了与水的流量0.5 mL / min。用苯酚-硫酸反应分数被监控。主峰分数是汇集和冻干;酸性EPS的产量是由重量决定的。

2.3。Homogenity和分子量

的同质性和分子量多糖估计通过HPGPC啧啧G4000列示差折光检测器,筛选了与流动相包含0.1纳米₃0.5毫升/分钟的流量。列温度保持在30°C。对分子量估计,列是校准标准右旋糖酐(50 kDa, 80 kDa, 150 kDa, 270 kDa, 410 kDa, 670 kDa,和1100 kDa)。所有的样品都准备好3毫克/毫升的解决方案,和40μL在每个运行的解决方案进行了分析。

2.4。糖基成分分析

成分分析是200μ纯EPS的g。作为内部标准,20μg肌醇添加到样本。样品在2 M三氟乙酸水解(组织)2 h在密封管在121°C,与NaBD减少₄,并使用乙酸酐乙酰化/组织。结果alditol醋酸纤维素在安捷伦7890 a GC分析界面的5975 c默沙东公司,电子碰撞电离模式。分离进行30 m Supelco sp - 2331键合相熔融石英毛细管柱。

2.5。硫酸内容分析

2毫克EPS在2 M组织水解2 h在密封管在121°C。水解产品真空干燥,然后随着与H₂o .硫酸的存在证明了使用高效液相离子色谱系统(ics - 2100、热科学)配备一个IonPac AS11-HC列。30毫米氢氧化钠溶液作为洗脱液的流量1毫升/分钟。列温度保持在30°C。Na的校准曲线的准备₂所以₄硫酸作为标准被用于计算每股收益的内容。

2.6。建设和确认删除突变和恢复菌株

染色体缺失生成通过同源重组(突然出现/弹出式)方法如前所述[21]。PCR引物的序列用于本研究总结在表1。606年英国石油公司上游和下游侧翼序列的618个基点HAH_1662被放大使用引物PCR对p1、p2和p3、p4。两个放大DNA片段有关使用重叠PCR引物对p1和p4生成1.2 kb片段包含后三世在5′末端和一个网站Kpn我在3′末端的网站。那时片段克隆到pUBP质粒之间后三世和Kpn我的网站产生pUBPΔHAH_1662质粒。然后转化为质粒哈尔。hispanica野生型细胞和镀到包含mevinolin - 168固体培养基。转化株筛选基因敲除的整合质粒通过PCR分析相应的轨迹。细胞与pUBPΔHAH_1662集成到他们的基因组亚文化至少三次- 168中没有mevinolin允许发生第二次重组。对于反向互补,质粒pWL-CBD-SecY(杰瑞为教授的礼物)消化濒死经历我和Kpn我删除SecY基因(22]。生成的pWL-CBD片段包含组成型启动子PrR16和纤维素结合域thermocellum梭状芽胞杆菌。的HAH_1662使用底漆对p5和p6基因扩增技术(表1),濒死经历我和Kpn我介绍了限制性位点基因的开始和结束时,分别。扩增片段克隆到pWL-CBD濒死经历我- - - - - -Kpn我网站生成CBD融合表达质粒pWL-CBD-HAH_1662。Δ的确认HAH_1662是由基因组DNA的消化EcoR诉1550 bp的下游片段HAH_1662基因扩增引物p7和p8用作探针。

594年英国石油公司上游和下游侧翼序列的613个基点HAH_1667被放大使用引物PCR对票数/ p10及赛/ p12。两个放大DNA片段有关使用重叠PCR引物对票数和p12生成1.2 kb片段包含后三世在5′末端和一个网站Kpn我在3′末端的网站。那时片段克隆到pUBP质粒之间后三世和Kpn我的网站产生pUBPΔHAH_1667质粒。然后转化为质粒哈尔。hispanica野生型细胞和镀到包含mevinolin - 168固体培养基。转化株筛选基因敲除的整合质粒通过PCR分析相应的轨迹。细胞与pUBPΔHAH_1667集成到他们的基因组亚文化至少三次- 168中没有mevinolin允许发生第二次重组。对于反向互补,质粒pWL102消化了BamH我和Kpni。HAH_1667基因上游与下游200个基点和100个基点是放大使用底漆对p13好,中BamH我和Kpn我介绍了限制性位点。扩增片段克隆到pWL102BamH我- - - - - -Kpn我网站生成表达质粒pWL102-HAH_1667。质粒被转化为生成的HAH_1667删除细胞。Δ的确认HAH_1667是由基因组DNA的消化EcoR即1408 bp的下游片段HAH_1667基因扩增引物p15和p16是用作探针。标签使用挖掘和可视化进行了DNA标记和检测设备(罗氏应用科学)根据制造商的指示。

2.7。rt - pcr

菌株生长在是在37°C - 168中摇晃在200 rpm。当OD_600海里达到0.6 - -0.8,细胞收获和总RNA提取使用试剂盒(表达载体)。污染DNA被RNase-free DNase(新英格兰生物学实验室)。相应的互补脱氧核糖核酸合成RNA中使用随机五个一RevertAid合成第一链cDNA工具包(热科学)。单根cDNA被用作模板PCR反应包含适当的意义和反义每个基因的引物。综述了PCR引物的序列中使用rt - PCR在桌子上1。引物p17和p18设计HAH_1662p19和p20的设计的引物HAH_1667,p21引物和第22位的设计表达质粒pWL-CBD-HAH_1662 cellulose-binding域,设计引物p23和p24 mevinolin抗性基因的表达质粒pWL102-HAH_1667。这些rt - pcr产物分离在1%琼脂糖凝胶,其次是溴化乙锭染色。

2.8。扫描电子显微镜(SEM)分析

菌株培养在在37°C - 168固体板中5天,然后用消毒牙签刮掉到500年μL 21%的盐溶液含有3%戊二醛、混合均匀,站在一夜之间在4°C。细胞被洗3次在21%盐溶液,脱水15分钟的30%,50%,70%,85%,95%,和100%的乙醇按顺序,有限公司₂临界点干燥。冻干菌株被固定在SEM存根双面碳带,然后涂上了一层白金。样品在一个寒冷的场发射扫描电子显微镜观察(SU8010、日立公司(Hitachi Ltd .)、日本)。

2.9。负染色透射电子显微镜(TEM)分析

菌株培养在在37°C - 168固体板中5天,然后用消毒牙签刮掉到500年μL 21%的盐溶液,混合均匀。把碳涂层网格在培养皿中碳的一面朝上,把培养皿中仪使网格表面亲水。然后,10μL仪上的示例解决方案是把表面的碳网格大约1分钟。在使用一张滤纸吸干残留样品溶液从网格边缘,样本观察到Tecnai精神120千伏透射电子显微镜。

2.10。增长速度分析

的监控哈尔。hispanica150年增长率,μL OD的文化规范化_600年1.0用于接种40毫升- 168中瓶、培养在37°C用颤抖的在200 rpm。3.4 - 168中包含M氯化钠,2.3米和4.7 M氯化钠也被称为氯化钠的用量(200克、135克或275克氯化钠)1 L - 168年媒介。样本被撤回的时间间隔。经济增长在600纳米的光密度测量spectrophotometrically。对于每个应变,三个独立的生物重复进行。

2.11。活性测定

Flagellum-mediated游泳能动性被刺伤接种菌株在化验为- 168琼脂板(以0.3%琼脂)[23]。经过5天的孵化在37°C,能动性是评估通过测量直径的圆形区域的殖民地从他们的接种点。

2.12。附着力试验

快速附件化验,饱和文化150年μL(平稳增长阶段,OD_600海里2.7)添加微量滴定的井菜(猎鹰3911)。在37°C孵化后4天,浮游和松散附着haloarchaeal细胞被冲洗掉,和板对细胞被添加0.1%结晶紫染色,在95%的乙醇可溶性,(一个衡量_540海里)如前所述24]。

3所示。结果与讨论

3.1。酸性EPS从哈尔。拉美裔分离和纯化

酸性EPS是分离和纯化- 168中根据部分2。2;完全30毫克的酸性EPS从1 L培养基,纯化和酸性EPS是纯化同质性根据HPGPC(图1)。分子量测定使用右旋糖酐1100 kDa标记。gc - ms分析表明,每股收益是主要由甘露糖和半乳糖组成少量葡萄糖的摩尔比为55.9:43.2:0.9(图2)。总碳水化合物含量测定为51% (w/w)。我们也发现₄²⁻集团利用红外光谱和离子色谱法;硫酸的内容被确定为26% (w/w)。EPS样本容易溶解在水中的成分分析,但没有溶解在DMSO溶液用于连锁分析,使permethylation过程更加困难。因此,更多的工作是需要明确的连杆结构酸性每股收益。

酸性EPS的糖基组成哈尔。拉美裔写明ATCC 33960年是不同于其他支付系统在嗜盐古生菌(表2)。高硫酸盐酸性EPS内容可能有特定的生物功能和给一个巨大的应用潜力25),但每股收益产生的数量哈尔。拉美裔ATCC33960不足以使用生物高聚物。如果我们知道确切的生物聚合物的合成途径,尤其是EPS合成的关键基因,基因操作可以用来获得更多每股收益。

3.2。删除HAH_1662或HAH_1667导致酸性每股收益的损失

的基因组哈尔。拉美裔ATCC33960已经完成;HAH_1661、HAH_1662 HAH_1663, HAH_1667多糖生物合成基因簇中所有标注为糖基转移酶(26]。HAH_1665,带注释的多糖生物合成蛋白质,HAH_1666,注释arylsulfatase家族蛋白,可能一起参与合成的酸性EPS (可以在网上https://doi.org/10.1155/2017/5842958)。酸性EPS富含甘露糖,所以mannosyltransferases可能酸性EPS的生物合成的关键。HAH_1662 HAH_1667有一个高度保守的主题EXF (G / C) X₄从分枝杆菌E相似mannosyltransferase皮马人27)(图3)。皮马人(PDB加入代码4 nc9)是一个膜相关酶,属于GT-B总科和启动细胞壁的生物合成途径lipoglycans,利用GDP-Man糖捐赠者和磷脂酰肌醇(PI)糖受体(28,29日]。所以我们主要集中在两个基因HAH_1662和HAH_1667在这篇文章中。

我们第一次发现的表达HAH_1662和HAH_1667通过rt - pcr基因。所示,HAH_1662和HAH_1667积极在对数生长期增长记录。探索它的功能,HAH_1662和HAH_1667删除所描述的实验程序。Δ基因缺失突变体HAH_1662和ΔHAH_1667,经聚合酶链反应()和印迹(),取得了预期的突变模式。在野生型菌株,一个包含2418个基点片段HAH_1662基因和其侧翼地区被放大。在HAH_1662缺失突变,只有1224个基点的片段。在突然出现应变、2418个基点和1224个基点的片段都获得(左)。在野生型菌株,一个包含2329个基点片段HAH_1667基因和其侧翼地区被放大。在HAH_1667缺失突变,只有1207个基点的片段。在突然出现应变、2329个基点和1207个基点的片段都获得(右)。Δ印迹分析HAH_1662是由消化EcoR诉的基因组DNA杂交片段的大小表示示意图:野生型菌株3336个基点和4375个基点Δ吗HAH_1662()。Δ印迹分析HAH_1667是由消化的基因组DNA EcoRІ。杂交片段大小的示意图表示:对Δ野生型菌株4921个基点和3799个基点HAH_1667()。

没有酸性的EPS从缺失突变株(图中提取4 (b))。当HAH_1662和HAH_1667基因引入到ΔHAH_1662和ΔHAH_1667分别下突变体所描述的实验过程,我们通过rt - pcr验证互补基因的转录(图4(一))和合成的酸性EPS恢复补充株(图4 (b))。补充菌株培养在- 168板用抗生素能够保持水分的野生型菌株(图4 (c)),而突变体在黏液状的聚合物干燥缺陷。这些结果表明,两者兼而有之HAH_1662和HAH_1667基因生物合成的酸性EPS负责哈尔。hispanica。

3.3。突变株显示异常的细胞表面形态

在扫描电镜下(图5(一个)),两个ΔHAH_1662和ΔHAH_1667突变体不同的细胞表面形态(图显示5(一个)与野生型相比),或补充压力。我们可以找到破胶囊在突变细胞(黑色的箭头在图5(一个))。除了S-layer,外部胶囊首次报道在haloarchaea外层细胞层Haloquadratum walsbyi由Sublimi Saponetti et al。30.]。建议halomucin,一个非常大的蛋白质,可能建立的框架交联细胞外基质导致的刚度和维护h . walsbyi细胞形态(30.- - - - - -32]。在这里,我们提出酸性每股收益也可能作为交联S-layer维持细胞周围的细胞外基质硬度和保护细胞免受严酷的环境。酸性EPS的缺乏导致了一个不完整的胶囊。

负染色TEM(图下5 (b)SEM结果),结果是一致的,两个ΔHAH_1662和ΔHAH_1667突变体显示异常细胞表面特征。Δ周围的胶囊HAH_1662与野生型菌株相比减少了很多但有些还存在(黑箭头在图5 (b));残余胶囊可能等细胞外基质蛋白类似报道halomucin;Δ的互补菌株HAH_1662几乎恢复细胞表面形态。Δ周围的胶囊HAH_1667成为破碎和松散的与野生型菌株相比,我们可以看到Δ的边缘HAH_1667细胞(黑色箭头在图5 (b)通过负染色TEM)。ΔHAH_1662有更严重的缺陷在细胞表面形态与Δ吗HAH_1667,所以我们认为HAH_1662可能发起的合成酸性EPS更像是在分枝杆菌(皮马人28]。当HAH_1667被删除,一些截断EPS也可以合成,作为细胞外基质,形成破碎Δ胶囊HAH_1667。Δ的互补菌株HAH_1667没有恢复细胞表面形态;原因可能存在互补与mevinolin耐药性质粒;的mevinolin - 168中会干扰脂质合成,这可能影响细胞膜和细胞壁。

3.4。增长的突变体在不同盐环境

如图6(一)在- 168培养基培养,当氯化钠浓度较低(2.3米),ΔHAH_1662表现出显著的生长阻滞与野生型菌株相比,Δ的增长率HAH_1667有一个小缺陷较野生型菌株。结果还表明,比HAH_1667 HAH_1662可能会发挥更重要的作用合成的酸性EPS和启动酸性EPS合成。当HAH_1667被删除,一些截断EPS也可以合成,作为细胞外基质,形成一个不完整的胶囊,和部分保护ΔHAH_1667对低盐环境。

当培养适应力最强下氯化钠浓度(3.4米)或更高的氯化钠浓度(4.7米),两个突变株的增长率并没有受到影响。Δ的细胞形态HAH_1662和ΔHAH_1667不同于野生型菌株在3.4 - 168培养基培养时,但差别显著增强当在2.3 - 168培养基培养(图6 (b)),特别是ΔHAH_1662;他们看起来更聚合和肿胀,这表明酸性每股收益可能作为保护层稳定细胞表面和维持细胞形态。

3.5。突变体显示增加附着力和游泳的能力

两个酸性EPS-deficient突变体ΔHAH_1662和ΔHAH_1667表现出增加粘附能力(图7),根据实验过程中检测到2.12;突变菌株ΔHAH_1662和ΔHAH_1667也表现出增加游泳能力如图8;游泳区内野生型菌株的直径,ΔHAH_1662和ΔHAH_1667分别是2.2±0.1厘米,3.3±0.1厘米和3.2±0.1厘米;Δ的互补菌株的直径HAH_1662和ΔHAH_1667分别是2.4±0.1厘米和2.5±0.1厘米。

EPS生物合成和flagella-biosynthesis通常是反向调节,所以我们可以理解在Δ游泳能力增加HAH_1662和ΔHAH_1667。在细菌中,flagella-dependent活性的降低以及增加附着力和EPS生产可以促进生物膜的形成24,33- - - - - -37]。我们发现Haloarcula拉美裔也可以形成生物膜在静室,培养和基因缺失突变体ΔHAH_1662和ΔHAH_1667更倾向于形成生物膜(气液层和底层)比野生型菌株(补充材料)。这是增加的同时突变株的粘附能力。但突变株也显示增加游泳能力和EPS合成的不足。我们知道系统中主要组件矩阵的生物膜细菌和haloarchaea。很奇怪的游泳,增加每股收益的不足,增加了生物膜的形成发生了突变株。一个原因可能是,我们发现在浮游细胞运动性增长,不是在生物膜的形成阶段;酸性EPS在本文我们报道被隔离和检测到的浮游阶段,生物膜的形成阶段。

据报道,一些法规中存在生产EPS,鞭毛能动性,菌毛粘附,在细菌生物膜的形成35]。但监管网络还不知道任何biofilm-forming archaeon。几个haloarchaeal物种可能形成一个保护营养和ion-absorbing粘液生物膜可以帮助调节离子盐所需的运输策略8,38- - - - - -41]。这两个基因缺失突变体ΔHAH_1662和ΔHAH_1667可能是有趣的生物膜的形成机制研究候选人haloarchaea绝对是不清楚的。

4所示。结论

在这项研究中,酸性每股收益Haloarcula拉美裔ATCC33960分离和纯化,不同于其他支付系统在haloarchaea报道。HAH_1662和HAH_1667负责验证EPS生物合成。删除的HAH_1662或HAH_1667基因导致的酸性EPS和异常细胞表面形态。我们的研究结果表明,酸性EPS的生物合成可能充当一个适应性机制,稳定细胞表面结构和保护细胞免受严酷的环境下。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(Y3113H3531和31661143033)。作者感谢Parastoo阿扎迪博士的复杂碳水化合物研究中心,乔治亚大学的成分分析和陈永生生物物理研究所,中国科学院,负染色透射电子显微镜。

补充材料

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