文摘

使用Illumina公司测序技术,我们调查了垂直分布的热点社区在太湖沉积物竹山湾,那里的黑花经常发生在夏天。杂项Crenarchaeotal集团整体(MCG)、深海热泉口组6 (DHVEG-6)甲烷细菌属古细菌社区主导。然而,我们观察到显著差异在社区组成的热点在不同深度沉积物。DHVEG-6主导(0 - 3厘米)表层沉积物。甲烷细菌属主导的古细菌类群在L2(3 - 6厘米)和L3(6 - 10)沉积物。MCG最丰富的(10 - 15厘米)和一两百(15 - 20厘米)沉积物。此外,DHVEG-6显著影响总磷(TP)的浓度。在点火和损失(缺失是一个重要的环境因素甲烷细菌属。作为典型的古细菌类群在表层沉积物,DHVEG-6和甲烷细菌属可能更适应丰富衬底蓝藻的供应,积极参与生物质转换。我们建议DHVEG-6和甲烷细菌属可能的关键古细菌类群与竹山湾的“黑花”的形成。

1。介绍

古生菌传统上被辨认为极端微生物。然而,文化无关的方法如16 s rRNA基因序列分析显示古生菌可以开拓广阔的地球(1,2]。先前的研究已经广泛研究了产甲烷社区的淡水湖泊。和评论文章表示Methanomicrobiales和Methanosarcinales通常在淡水沉积物(社区主导产甲烷3]。未受教育的热点的杂项Crenarchaeotic组(MCG)和深海热泉喷口附近组6 (DHVEG-6)也发现在淡水湖泊4,5]。无处不在的MCG报告做出显著贡献的碳和氮循环内环境(6,7]。DHVEG-6检测控制在废水处理生物反应器(8),这表明它可能是异养和促进养分循环。由于各自不同的功能和他们的普遍性,古生菌可能发挥重要作用在推动全球生物地球化学循环和维持健康的淡水环境。

“黑花”现象在湖泊、河流、海岸,特点是缺氧和不合法的(9,10]。它经常发生在夏季后严重的藻类大量繁殖和水环境中已经成为一个严重的生态问题11]。太湖湖是一个很大的浅水富营养的淡水湖(12]。严重蓝藻频繁发生在一些太湖湖区域,由于富营养化(13]。由于蓝藻,频繁发生的“黑花”从2007年到2011年在Meiliang湾,这里海湾,太湖和竹山湾(14]。到目前为止,研究微生物多样性在黑人布鲁姆湖区域主要集中在发生细菌。梭状芽胞杆菌,脱磷孤菌属,和Comamonadaceae被发现的主要湖黑布鲁姆(生物因素15,16]。然而,人们很少知道多样性和垂直分布的热点社区在湖泊沉积物。

在这项研究中,我们研究了古细菌群落组成的沉积物黑色布鲁姆发生太湖地区通过使用下一代测序Illumina公司的方法。我们特别想知道古细菌群落组成是不同的在不同的层的沉积物,鉴于有机材料的质量和数量上的差异在不同的沉积物层蓝藻的退化而造成的。我们也想看看是否有一些关键的沉积古细菌类群导致黑布鲁姆在竹山湾。

2。材料和方法

2.1。网站描述和样品收集

太湖湖是一个很大的浅水富营养湖面积2338公里²平均深度为1.9米,位于长江三角洲(30°55.667′-31°32.967′N, 119°52.533′-120°36.167′E)。竹山湾是最富营养的海湾之一在太湖北部,在那里黑人布鲁姆经常发生在夏天。

三个沉积物(内径8.6厘米,25厘米长度)收集从竹山湾(31°23.705′N, 120°02.176′E) 7月9日,2010年。沉积物被立即送往实验室在冰上。一旦到达实验室,沉积物岩心切片为0 - 3厘米,3 - 6厘米,6 - 10厘米,10 - 15厘米,15 - 20厘米。五层的三个复制涨跌互现尽可能彻底。0 - 3厘米,3 - 6厘米,6 - 10厘米,10 - 15厘米,和15 - 20厘米贴上L1, L2, L3、L4, L5,分别。然后,五个样品进行DNA提取存储在−20°C和土壤化学性质的分析在4°C。

2.2。理化分析

上覆水的物理化学性质进行了使用YSI 550乐器。叶绿素(Chla)使用HP8452紫外可见分光光度法测定沉积物。总磷(TP)分析了钼锑resistance-colorimetric方法。分析了总氮(TN)凯氏法。分析了总有机碳(TOC)重铬酸钾硫酸oxidation-ferrous滴定分析方法。水分含量(MC)的泥沙测量干燥恒重后在105°C。损失点火(法)分析了加热在550°C 2 h。TP、TN TOC、MC和定律分析了沉积物的根据包(2000)17]。

2.3。DNA提取、PCR扩增和测序

沉积物样品的DNA提取前,冷冻干燥−53°C进行冷冻干燥机(LABCONCO, 2.5升)。DNA提取五个沉积物层三个复制,使用FastDNA旋转工具土壤(美国俄亥俄州议员生物医学LLC)。根据指令,0.5 g干沉积物被用于DNA提取。的质量和大小的DNA被1%琼脂糖凝胶上电泳检查。

提取的DNA与古细菌放大领域特定的引物组519 f (5′-CAGCMGCCGCGGTAA-3′) (18与条形码),915 r (5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′) (19]。协议和条件聚合酶链反应(PCR)是根据Coolen et al。(2004)20.]。扩增子被凝胶纯化提取工具包(豆类生物,大连,中国)。检查大小的扩增子在2%琼脂糖凝胶电泳。的纯度和数量扩增子评估使用Nanodrop nd - 1000紫外可见分光光度计(Nanodrop技术,威明顿、德、美国)。最后,不同的样本集中的扩增子克分子数相等的比例进行测序分析。图书馆准备和DNA序列分析使用一个Illumina公司MiSeq paired-end 300个基点协议(Illumina公司,Inc .,圣地亚哥,美国)进行上海BIOZERON生物技术有限公司(上海,中国)。原始序列数据提交到ENA数据库(PRJEB10387)。

2.4。序列数据处理

Trimmomatic软件被用于过程的原始序列数据质量控制(21]。PE读取被重叠组装的最后标记序列最小重叠长度为10个基点。我们移除所有的序列包含不止一个模棱两可的基础“N”那些包含正向或反向引物中的任何错误,和那些有超过0.2重叠区域内的失配率。尾巴的读取与质量值低于20过滤,和变量标签(重叠长度-引物和条形码),少于50个基点也被删除。获得干净的序列在Qiime平台进行分析22]。清洁序列筛选使用Usearch嵌合体(23]。原始序列数据处理后,序列长度为301个基点和500个基点之间用于下面的分析(见图S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/8232135)。然后,操作分类单元(OTU)分组进行使用Usearch软件相似度97%。为了过滤细菌序列分配分类过程中,一个热点数据库是由从席尔瓦数据库提取古细菌序列(release_119http://www.arb-silva.de/)。提供的数据库是上海BIOZERON生物技术有限公司(上海,中国)。分类数据被分配给每个代表针对热点数据库序列相似度97%,使用RDP分类器(http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)。共有17358个序列不能找到从属关系在此过程中被过滤掉。

2.5。统计分析

执行下游分析,OTU矩阵必须规范化占不均匀样本数目。OTU数据的正常使用命令执行“正常化。共享”,为每个样本序列的数量设置为19910,指的是最小的。的α古细菌的多样性社区被逆辛普森多样性指数表示。此外,样本覆盖和观察到的数量辣子鸡(抽泣)也提供在表3。OTU的正常数据和分析α古细菌的多样性社区进行使用Mothur软件(24]。计算覆盖率百分比是根据好(1953)(25]。进一步量化所观察到的差异,非参数统计的基础上,使用OTU Bray-Curtis不同指数进行数据。相似性的分析(ANOSIM)进行测试如果确实是有显著差异的古细菌群落组成在不同沉积物层。直观地解释社区不同,调查社区热点数据和物理化学数据之间的关系,多元分类方法的限制。去趋势对应分析(DCA)显示,最大轴长度在OTU级别是2.93和1.69在家庭水平。因此,冗余分析(RDA)被选中,总理化因素的重要性进行了测试与蒙特卡罗排列(permu = 999)。环境因素被选的功能envfit vif (permu = 999)。cca,环境因素或vif > 20人从下面的分析。vif的TOC值、TN和MC高于20和删除。ANOSIM和RDA进行的分析统计计算(26),使用素食包[27]。前13的不同分布最丰富的家庭中五沉积物层视觉解释使用集群3.0 (28]。数据,包括前13个家庭的相对丰度,之前日志转换和集中分析。和颜色是:对比值为2.0;积极的值设置为红色;负值是设置为绿色;零值设置为白色。

3所示。结果

3.1。物理化学性质

上覆水的物理化学性质是显示在表S1。环境参数变化主要在五个抽样层竹山湾沉积物(表1)。各种环境参数的值平均浓度在表面观察到更高的层(寓于,0 - 6厘米)比深层(L3-L5, 6 20厘米)。最高浓度的值Chla TN, TOC,和一般法观察到L2(3 - 6厘米)沉淀物,而TP和MC的集中值最高的L1(0 - 3厘米)沉积物。

3.2。古细菌社区在竹山湾沉积物

分类分析结果表明三大热点类Halobacteria(24.42%),MCG(22.78%),和甲烷菌(14.22%),非机密的除外古生菌(图1(一))。古细菌社区是由Halobacteria在L1(0 - 3厘米)沉积物。在L2(3 - 6厘米)沉积物,产烷生物(甲烷菌和Methanomicrobia社区)是主要成分的热点。L3(6 - 10厘米)沉积物,MCG的相对丰度明显增加。和(10 - 15厘米)和一两百(15 - 20厘米)沉淀物,MCG在古社区主导。

主导产烷生物,甲烷菌由七个辣子鸡(图1 (b))。这七个辣子鸡是附属的属甲烷细菌属和Methanobrevibacter。的组成甲烷菌五层沉积物中没有明显变化。和甲烷细菌属_OTU5是最丰富的OTU在所有的五个沉积物层。

此外,MCG_norank DHVEG-6,Methanobacteriaceae是三大主导家庭沉积物中,除了非保密吗古生菌(表2)。DHVEG-6隶属于Halobacteria,而Methanobacteriaceae是隶属于甲烷菌。

3.3。统计分析

报道估计表明,古细菌16 s rRNA基因库为每个样本都足以捕捉总估计辣子鸡(表3)。和逆辛普森指数的平均值显示,L2(3 - 6厘米)沉积物存在多样性的热点社会最低,而最高的多样性的热点社区发现L1(0 - 3厘米)沉积物。

全球ANOSIM比较显示整个古细菌群落组成中五沉积物层明显不同(统计= 0.932,)。观察差异定性显示在RDA情节,在相对之间的相似之处沉积物层提出了集群的分层的数据点(图2(一个))。此外,RDA OTU层面的结果显示第一轴解释微生物总方差的22.65%,第二轴10.01%。蒙特卡洛排列OTU级别的测试显示,环境因素显著相关(Pseudo -社区热点分布= 1.93;显著性水平= 0.001)。Envfit OTU级别的测试建议Chla和TP在0.001显著水平(),而法则中是重要的在0.05级()。RDA情节在OTU级别表示TP是更重要的因素中的古细菌社区L1沉淀物,而古社区的定律是一个更重要的因素在L2和L3沉积物。古细菌社区在L1和L2沉积物既受到Chla的影响。此外,RDA在家庭层面的结果显示第一轴方差解释微生物总数的25.42%和15.36%(图第二轴2 (b))。蒙特卡洛排列测试在家庭层面显示环境因素显著相关(Pseudo -社区热点分布F= 2.98;显著性水平= 0.001)。Envfit测试在家庭层面提出Chla和TP在0.001显著水平(),而法则中是重要的在0.05级()。RDA情节在家庭层面表示TP DHVEG-6和梅格是一个重要的因素,而法则中是一个重要因素Methanobacteriaceae,Methanosarcinaceae,SCG_norank。

聚类分析的前13个最丰富的家庭确定特定的家庭;那些分布在五个不同沉积物层(图3)。DHVEG-6 L1(0 - 3厘米)中最丰富的沉积物。Methanobacteriaceae和Methanosarcinaceae在L2(3 - 6厘米)最丰富的沉积物。Methanobacteriaceae更丰富的L3(6 - 10厘米)沉积物,与L1的相比,L4, L5沉积物。集团C3_norank和深海Euryarchaeotic集团(DSEG)中最丰富的L4(10 - 15厘米)沉积物。MCG_norank菌和厌氧(ANME) 1中最丰富的(10 - 15厘米)和一两百(15 - 20厘米)沉积物。

4所示。讨论

4.1。重要的垂直异质性社区在竹山湾沉积物的热点

显著差异的古细菌群落组成中五个沉积物层被发现(),这可能会导致从减少营养物质表面一层深的层(图2)。垂直异质性社区的热点也观察到在另一个区太湖湖(29日]。

DHVEG-6分布在五个不同沉积物层和最丰富的在L1沉积物(图3)。DHVEG-6被称为haloarchaea之前,因为它已经在热液沉积物中发现(30.],深海沉积物甲烷渗透[31日),高(32],浅盐(33湖泊。然而,DHVEG-6也发现在水中的淡水湖5),在城市污水处理产甲烷生物反应器(34]。此外,发现DHVEG-6是主要的未受教育的热点社区在废水处理污泥中最丰富的氮- / phosphate-removing废水处理污泥(8]。这可能表明一些组织DHVEG-6更适应高衬底供应,和磷酸盐可能是一个关键因素。和本研究的结果也表明DHVEG-6明显受到TP(图的影响2 (b))。更多的有机物和更高层次的TP表面沉积物可能有利于DHVEG-6。

Methanobacteriaceae分布在五个不同沉积物层和最丰富的在L2和L3沉积物(图3)。除此之外,Methanosarcinaceae也是最丰富的家庭在L2沉积物(图3)。然而,先前的研究表明Methanomicrobia在淡水沉积物通常主导产甲烷的社区,而甲烷菌很少发生(3),使用克隆库和/或荧光原位杂交方法。Methanobacteriaceae通常是主要的产烷生物废水处理污泥或市政固体废物填埋(35]。它可以指出的品种和类型菌株甲烷细菌属和Methanosarcinaceae通常是淡水湖栽培利用媒体高底物浓度(36,37]。在这项研究中,99.99%的序列Methanobacteriaceae是隶属于甲烷细菌属(图1 (b))。这些表明甲烷细菌属和Methanosarcinaceae更适应高碳浓度。和本研究的结果也显示的成员甲烷细菌属和Methanosarcinaceae显著影响定律(图2 (b))。严重蓝藻的竹山湾提供丰富的不稳定有机物和可能受益甲烷细菌属和Methanosarcinaceae。

集团C3_norank和DSEG L4沉积物(图中最丰富的3)。组C3和DSEG主要在海洋沉积物中发现(38- - - - - -40]。此外,在深湖死水区,大量的16 s rRNA成绩单与组C3有关,这说明这群无特征作出贡献的潜力在湖泊营养物循环5]。贺东湖,DSEG盛开在深分层水在夏天在早春,和一个积极和重大的关系被发现DSEG与假定的氨氧化Thaumarchaeota(41]。ANME-1a和MCG在L4和L5最丰富的沉积物(图3)。ANME-1总是发现松散与硫酸盐还原菌(42]。淡水沉积物,这是经常发现在硫酸甲烷过渡区(43,44]。黑色布鲁姆发生期间,高浓度的H₂年代和大量的硫酸还原细菌被发现在竹山的沉积物和水湾(16,45]。和ANME-1a可能受益于黑布鲁姆在竹山湾。高度多样化的成员MCG在全球分布的各种海洋和大陆的栖息地46]。到目前为止,没有MCG的隔离种植或特征。然而,先前的研究表明,MCG厌氧异养生物,不参与甲烷和硫循环但可能使用耐火材料有机碳在更深的竹山湾沉积物碎屑等蛋白质和芳香族化合物(7,47,48]。

4.2。DHVEG-6和甲烷细菌属关键沉积物古细菌类群导致黑布鲁姆在竹山湾

在内陆水体蓝藻已成为普遍,包括淡水湖泊,由于磷和氮的重载49]。大量蓝藻生物量的积累和分解容易导致溶解氧的消耗,这往往会导致缺氧和“黑花”在湖泊11]。先前的研究已经暗示小说的存在细菌组,表明细菌组不同暂时与氧气的浓度和磷酸盐在缺氧区在湖泊和海洋16,50,51]。然而,没有发现研究热点报道社区的“黑花”发生区。在这项研究中,DHVEG-6和甲烷细菌属被统治古细菌组表面沉积物层(清廉厘米),受影响最严重的蓝藻或“黑花”(表吗2,图3)。DHVEG-6和甲烷细菌属适应高的栖息地被发现衬底供应,如废水处理污泥(8,35]。此外,DHVEG-6被磷酸的浓度显著影响,和不稳定的有机物是一个重要的环境因素甲烷细菌属(图2 (b))。此外,成员甲烷细菌属在严格厌氧古生菌(36]。然而,更多的工作需要,使更好的理解的角色DHVEG-6竹山湾沉积物。和主导的无教养的种Methanobacterium_OTU5(图1 (b))预计将进一步被孤立和文化理解的方法。DHVEG-6和甲烷细菌属会积极参加蓝藻生物量、退化导致黑布鲁姆在竹山湾。

5。结论

这是第一个研究探讨垂直分布的热点社区“黑花”令人不安的地区使用高通量测序技术。我们的工作显示垂直分布的热点社会0-20厘米沉积物明显不同。DHVEG-6和甲烷细菌属表面沉积物为主,这可能是重要的古细菌类群与“黑花”出现在竹山湾,太湖湖。这项工作阐明的贡献古生菌黑花形成蓝藻的高危地区。需要更多的工作来得到一个更好的理解的角色DHVEG-6和未受教育的甲烷细菌属在快速表面沉积物的养分循环。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

风扇先芳和彭兴这个工作做出了相同的贡献。

确认

这项研究工作在经济上支持的科技重大水污染控制和治疗程序(2012 zx07101 - 010),中国国家杰出青年科学基金(31225004)、国家自然科学基金(31370508),135年项目南京地理与湖泊研究所、中科院(NIGLAS2012135001)和中科院青年创新促进会(没有。2014273)。

补充材料