异常高的结晶器池塘中的古细菌多样性,Pomorie盐场,保加利亚,揭示了系统发育分析

文摘

最近很少有盐田古细菌多样性的研究显示网站之间的异质性和独特结构的不同位置,阻碍的广义的结论。调查在P18古社区组成,最大的结晶器池塘Pomorie盐田(PS)盐度(34%),显示异常高数量的类群在高盐度环境。古细菌克隆被分组在26个不同的操作分类单元(辣子鸡)从两个订单,分配给15个不同属Halobacteriales Haloferacales。相关检索序列都可栽培的嗜盐菌或从盐水unculturable克隆(主要是高盐度)领域。新的序列代表53.9%的热点辣子鸡。其中一些形成独立分支有90%相似,最近的邻居。目前的结果明显不同于之前的调查提出属的数量方面,一些属的统治没有报告这些极端市场之前,和先前未被发现的16 s rRNA序列的识别。

1。介绍

太阳能盐场是专为生产食盐(氯化钠)从沿海海水的盐浓度不同,化学成分和地理位置。他们代表极端的栖息地,支持增长的极端嗜盐菌(最优增长超过15%生理盐水),而中度嗜盐菌(最优增长3 - 15%氯化钠)和轻微的嗜盐菌(1 - 3%氯化钠)不能够成长在这样的环境中1]。古细菌的代表主导太阳能盐田。高盐浓度是影响多样性的主要因素在高盐环境中由于微生物物种的数量随盐度增加,和一些类群成为占主导地位的2]。

它是普遍接受的文化相关的方法描述只有一小部分真正的多样性在自然环境3)和16 s rRNA环境分析DNA样本已经证明是一个强大的微生物鉴定和评价方法的多样性。在过去的二十年里进行了研究的多样性在不同的地理区域包括突尼斯沿海太阳能盐场,以色列,澳大利亚,墨西哥,印度(2,4- - - - - -8]。在欧洲,咸水环境微生物群一直在深入调查沿海盐场位于西班牙(9- - - - - -11)和克罗地亚(12]。这些研究揭示了社区网站之间的异质性,多年来多次被报道(2,6,12,13]。观察到的差异可以解释为限制分散在漫长的地理距离,和以这样一种方式进化事件可能会导致种群的多样性从不同的地理位置和独特的血统可以出现14]。盐田的许多小说分类群的存在已经被几位作者建议1,6,10,15]。此外,营养水平或其他身份不明的环境因素可能对微生物群负责品种(16]。

比较的结果报告的一些作者揭示了古社区太阳能盐场,而类似的在门级,但是只有一些世界性的类群较低的分类级别。广场archaeonHaloquadratum waslbyi和一个新的候选人古细菌类、Nanohaloarchaea已报告的最常见的古细菌社区(16,17]。宏基因组研究生物多样性在池塘与不同的盐度在圣普拉盐田已经表明,唯一的门由结晶器共享池(37%氯化钠)(18和intermediate-salinity池塘(13%)19在较高的盐度)是Euryarchaeota占主导地位。

我们所知古细菌群落结构的海滨盐场从黑海海岸的地区没有的特点。当前工作的目的是使用16 s rRNA基因分析研究古细菌多样性最大的结晶器池塘Pomorie盐田(PS), P18,比较它与社区结构实验主要从沿海全球太阳能盐田。

2。材料和方法

2.1。采样地点

沿海泻湖Pomorie盐田(42.63 n, 27.62 e)位于Pomorie镇以北,西黑海成本。湖分开大海与自然和人工砂堤和连接槽只能在南部,这是实现海水的流入和流出。它的面积大约是8,5公里²长度是5 - 6公里,宽度变化从350北1、6公里在中间部分,和深度不大于1,4 m。温度适中,7月平均气温24°C和1月2.7°C,温度和年降雨量是598毫米/年。他们是典型的multipond盐田与不连续盐度梯度饱和用于提取的盐(约30000吨)和愈合的泥浆。抽样地点是最大的结晶器池塘P18,盐度的340 g L⁻¹,属于所谓的thalassohaline环境。

无菌盐水水收集2014年6月,来自十个不同网站的结晶器池塘PS18为了获得一个代表性样本。均质样品冷却器袋被流放至实验室,储存在−4°C之前启动过程的DNA隔离。水样的化学和物理性质是由商业水化学分析实验室盘有限公司,保加利亚。池塘的水结晶器P18分析显示下列离子成分(g L⁻¹):Cl⁻188.38;26.59;Na⁺101.10;毫克^{2 +}18.02;K⁺6.21;Ca^{2 +}0.32;B^{3 +}0.076;老^{2 +}0.022点。总盐浓度为34%,pH值7.8,EC (mS厘米⁻¹197.6)。

2.2。隔离DNA, PCR扩增和16 s rRNA库的建设

从沉积物中提取总DNA RB样本所描述的Selenska-Pobell et al。20.)做了一些调整。一个示例(3 L)集中了错流过滤通过无菌中空纤维墨盒(1.2μ米孔隙大小玻璃纤维预滤器和0.2μm膜过滤;微孔)。过滤器是储存在−随后20°C DNA提取。样品材料是悬浮在10毫升0.12钠磷酸盐缓冲剂。裂解的细胞后实现添加十二烷基硫酸钠(最终浓度2%),氯化钠(0.5米),和挂钩6000 (20%)。协议提取的总DNA包含社区三个冰冻和解冻周期(相应地−80°C和96°C),化学溶解提取缓冲区,和蛋白酶K的一步。axg - 100的原油DNA纯化Nucleobond墨盒(Machery-Nagel Duren,德国)后,制造商的指示。洗出液是由0.7卷的冰冷的异丙醇沉淀。45的总量μg从样本中提取DNA。DNA的完整性检查的水平在1%琼脂糖电泳(σ)凝胶和可视化与溴化乙锭(0.5 mg L⁻¹)。

提取的基因组DNA被用作目标16 s rRNA基因的PCR扩增。社区核糖体DNA被放大从1到50 ng大部分DNA反应包含(最终浓度)1 x PCR缓冲,CaCl 2毫米₂4 x 200μM deoxynucleoside三磷酸腺苷,每个正向和反向引物400海里,0.5 U Taq (GenetBio、韩国)。古细菌16 s rDNA特定引物21 f (5′-TTCCGGTTGATCCYGCCGGA-3′)和958 r (5′-YCCGGCGTTGCCAATT-3′) (21用于放大。反应混合物中孵化BioRad热循环使用一个初始T100变性在94°C 3分钟,其次是30 94°C的周期为30秒,30秒55°C, 72°C 1分钟和最后一个扩展为20分钟72°C。

PCR克隆产品大肠杆菌JM 109使用pJet1.2克隆工具(Fermentas)根据制造商的指示。克隆片段reamplified使用pJet1.2正向和反向引物位于周围的向量和PCR插入片段。

2.3。分析图书馆和克隆选择

筛选的图书馆进行了两个独立的RFLP分析(限制片段长度多态性)。获得最高分辨率的RFLP分析,四个基地限制性内切酶。十μL reamplified PCR产品分别是每个核酸内切酶的消化5 U, Msp我,有三世(Fermentas)在最后一卷20μL 2 h在37°C根据制造商的指示(Fermentas)。生成的片段2%琼脂糖凝胶上分离。限制片段短于100个基点也没有包含在分析。乐队被可视化与溴化乙锭染色法和紫外光照。相同的克隆限制模式(带模式的特征限制PCR产品)被分组在一个OTU。至少一个每一个克隆测序限制模式。

2.4。16 s rRNA基因测序和分析

16 s rRNA基因序列测定与应用生物系统公司373型DNA定序器通过使用ABI棱镜循环测序工具包(Macrogen、荷兰),在那里,他们reamplified通过使用上述引物。16 s rRNA基因序列在NCBI最初与参考序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)使用爆炸22)和核糖体数据库项目资源(23)来确定他们的近亲和近似的系统发育关系。进行了系统发育分析使用大型版本6.0 [24)和neighbor-joining方法(25]。克隆序列检查可能的嵌合结构使用的程序嵌合体检查核糖体数据库项目网站(http://rdp.cme.msu.edu/),建立了五个嵌合体序列被排除在进一步分析。克隆显示不到97%的相似序列被称为新后最近的亲戚。

样本的多样性的程度与衡量,覆盖分析(26)的报道值来源于方程,在那里是独特的克隆和数量研究克隆的总数,香农指数(27]:,在那里的相对频率th克隆研究中克隆和ln是自然对数。

2.5。加入核苷酸序列号码

这项研究报告的16 s rRNA基因序列提交EMBL,基因库在加入数字LN865027 LN865053数据库。

3所示。结果与讨论

完全112年古细菌克隆插入包含预期的约的大小。950个基点。他们三个显示嵌合结构和其余109被选为进一步RFLP分析Msp我(图1(一))和III(图1 (b))。限制产品观察3 - 10乐队从每个rDNA消化和明显的片段大小范围从100到700个基点。两种限制性内切酶的克隆与相同的模式分为26离散辣子鸡(表1)。多样性报道价值是86%,香农指数是5.24。十个序列的单例克隆库中只有一次。为了评估是否限制克隆的数量足以评估多样性克隆库,稀疏的分析应用。稀疏曲线通过观察策划辣子鸡的数量对克隆测序(图的数量1 (c))。减少观察辣子鸡的检出率增加限制克隆的数量。虽然没有发现明显的高原,展示了丰富的克隆库和暴露的可能性进一步多元化额外的分析之后,这种减少表明,多样性的主要部分在这个库被发现。

十五的描述50嗜盐古细菌属(28被发现在Pomorie盐田(图2)。意想不到的高数的检测属不同于微生物群的共同意见低多样性高盐环境接近饱和,只有一个集群的统治(6,10]。是明显高于其他作者观察到的高盐度盐田盐含量高于30%的抽样地点(表2):两个马拉什盐场,秘鲁13];四个32%盐池,圣普拉盐场,西班牙(10];四个在30%盐池塘,格雷罗州黑人盐场,墨西哥(7];三个盐池S5在31%太阳能盐田在突尼斯(2];9在孟加拉海湾盐场、印度(8],显示确认属的数量在不同的盐田变化范围从2到9和15甚至更高的多样性可以预期有嗜盐的属的数量。比较的结果关系检索序列显示,古细菌社区,而类似的分类水平更高像家人,但是他们较低的不同分类水平像属什么可以解释上述特有分布在不同的地理位置(14]。代表相同的一个或两个家庭可以发现在所有调查盐田(表2),但主要属不同。Halorubrum发现控制相比,四个六盐田(包括Pomorie),Haloquadratum其中一半,与此同时,属Natrinema,Halogeometricum,和Haloferax只在孟加拉海湾被确定为主导,印度(8),Halobacterium只有在马拉什盐田(13),而Halanaeroarchaeum和Halonotius只有在Pomorie盐田。这是第一次报告的统治Halanaeroarchaeum(四个辣子鸡,28%的所有克隆)高盐环境后的频率由四个序列相关Halorubrum辣子鸡(四个不同的辣子鸡,23%的所有克隆)Halonotius(OTU, 16%)。的统治Halorubrum已经报道了各种盐田和盐湖在哪里Haloquadratum既不是没有,也不是占主导地位(6,12,29日),但都在S5属被确定为主导,突尼斯太阳能盐田(2]。克隆archaeon附属于世界性的广场Haloquadratum在克隆库最频繁检索实验,沿海盐田(2,6,7,9,10,13,30.]。是由只有一个克隆在图书馆从PS。其他12个物种代表在PS很少或不确定高盐环境。

类似于其他调查在盐水环境多样性(5,10,31日]从PS恢复古细菌序列被称为王国的门Euryarchaeota Euryarchaeota和没有一个有关Crenarchaeota或其他Proteoarchaeota门(根据佩提特金等建议的分类。32])。检索到的序列称为三个有效发表haloarchaeal订单中的两个门Euryarchaeota [33),即Halobacteriales和Haloferacales卓越Halobacteriales(辣子鸡22日)(图3)。

作为一种常见的家庭Halobacteriaceae只代表已确定由文化独立调查。恢复序列相关Haloferax也报道了盐田在孟加拉海湾,印度(8]。中放置的Haloferaceae辣子鸡Halobacteriaceae辣子鸡在系统发育树中反映出复杂的嗜盐的发展史arcahaea和证实了明显的绝大多源的秩序需要进一步修订Halobacteriales [28]。基于探索不同标记上述订单Haloferacales作者建议分为两个家庭,家庭Haloferacaceae Halorubraceae,和订单Halobacteriales分成三个家庭的一个部门,Halobacteriaceae Haloarculaceae, Halococcaceae。

所有热点检索序列分组在系统发育树中可培养嗜盐菌(9辣子鸡)或从盐水(主要是高盐度)unculturable克隆领域全球(辣子鸡17日)如海滨盐场和咸水湖泊。Unculturable比赛克隆从盐水中恢复全球细分市场:索尔顿海,我们;湖Kasin,俄罗斯南部;卡波德叫西班牙;突尼斯斯法克斯盐场;盐泉,加拿大;太阳能盐场,亚得里亚海;舟山盐场,中国;盐湖,新疆,中国。其中四个热点辣子鸡最相似的序列从结晶器池塘11和12 Kasin湖、俄罗斯(34),但在微生物群落组成相似性并没有发现。总共六个热点辣子鸡是隶属于≥97%序列相似性与栽培物种。所有可耕种的近亲都嗜盐的微生物或halotolerants与其他高盐度环境存活和nonhalophilic亲戚一起被发现(13,31日]。

虽然调查环境是盐田中最高的新序列超过一半的辣子鸡从古库(53.9%)显示与最接近的匹配相似度小于97%序列的系统发育的距离不超过10%暗示存在低水平的新分类群。最远亲克隆是pa - 80 (Pomorie-Archaea图书馆,克隆80)有90%的相似度Haloferax denitrificans,PA-26和pa - 112分组独立于任何已知的栽培与适度haloarchaeon相似(92%)。

4所示。结论

目前的调查显示,从Pomorie咸水池塘盐场小说存在古细菌多样性为实验以前从未被报道。群落结构不同于其他沿海太阳能盐场结晶器池塘的高数量的属和嗜盐的属的存在,到目前为止没有考虑其他盐场的特征。许多人分组unculturable代表相应的分类单元。超过一半的检索序列被称为新,他们中的一些人显示系统的距离超过10%,表明存在的小说分类部门高于物种水平。结果有重要意义扩展视图在高盐环境中微生物多样性的发展新方向,为知识盐场的微生物群。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

对金融支持这项工作,作者承认国家科学研究基金,保加利亚,批准号B02/26。作者感谢Ivailo吉奥吉夫博士生物多样性指数的工作。

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