发现抗氧化剂分子在古菌域:酶类Bcp1硫化叶菌solfataricus保护H9c2 Cardiomyoblasts从氧化应激

文摘

(插件可以抗氧化蛋白)是无处不在的硫醇氧化酵素参与过氧化物的还原。据报道,原核的插件可以通常比真核同行显示更大的结构鲁棒性,使其不易被氧化过度失活。这种差异激发了寻找新的抗氧化剂原核来源,可以使用尽可能治疗biodrugs。Bacterioferritin comigratory蛋白质(bcp) hyperthermophilic archaeon硫化叶菌solfataricus属于插件可以家庭最近的特点。这些蛋白质之一,Bcp1,选择确定其抗氧化效果H9c2鼠cardiomyoblast细胞。Bcp1活性测定在体外在生理温度和pH值条件下典型的哺乳动物细胞;酵母硫氧还蛋白还原酶(yTrxR) /硫氧还蛋白(y硫氧还蛋白)减少系统被用来评估酶活性。构建TAT-Bcp1融合蛋白,使其内化并验证的效果Bcp1 H9c2鼠cardiomyoblasts受到氧化应激。研究结果表明,TAT-Bcp1没有细胞毒性,抑制H₂O₂全身的细胞凋亡在H9c2细胞通过减少H₂O₂这些细胞内的内容。

1。介绍

活性氧(ROS),值得注意的是,过氧化物()、氢氧自由基()和过氧化氢(H₂O₂),是产生强大的氧化剂在有氧代谢和应对外部因素。在高浓度时,ROS能破坏所有主要类别的生物大分子,导致蛋白质氧化,脂质过氧化作用,DNA基础修改,链断裂。此外,H₂O₂在细胞代谢中发挥着关键作用,因为它功能作为信号分子,调节细胞生长、细胞粘附、细胞分化和细胞凋亡。由于这些原因,ROS浓度必须严格控制。然而,细胞内ROS浓度的调节是不清楚1]。

生物进化出了不同的抗氧化防御系统来保护自己免受活性氧毒性。抗氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)的歧化反应在H₂O₂这进而转化为H₂O数组的酶,如过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和酶类(插件可以)。最近,一直关注插件可以随处可见硫醇氧化酵素在古细菌和真核生物,包括人类。所有的插件可以共享一个共同的结构特点是硫氧还蛋白(硫氧还蛋白)褶皱2]。插件可以通常分为1-Cys插件可以或2-Cys插件可以,根据半胱氨酸残基参与催化。在2-Cys插件可以,第一个半胱氨酸位于n端,它被称为peroxidatic半胱氨酸(),而第二个半胱氨酸是解决半胱氨酸()。的坐落在糖基或不同的中央位置的下游吗(3,4]。H₂O₂氧化次磺酸(soh),进而凝聚形成二硫键。二硫还原系统,一般由硫氧还蛋白还原酶(TrxR) /硫氧还蛋白(硫氧还蛋白),是耦合的插件可以回收5]。插件可以在某些插件可以称为敏感,H₂O₂可以进一步氧化全音阶的活动形式,sulfinic (所以₂H)或磺酸(所以₃H)酸,从而防止二硫键的形成和灭活酶。这种敏感性的原因是由于特定的结构图案。具体来说,“GGLG”序列和YF c端扩展强化和稳定完全折叠(FF)活性部位,使酶更容易氧化过度(6- - - - - -8]。出于这个原因,真核插件可以称为敏感的与大多数原核的插件可以,这被认为是强大的,因为他们缺乏这些图案9]。这在进化期间获得的结构特征赋予敏感与附加功能插件可以超越基本的抗氧化活性,包括过氧化的能力调节信号在真核细胞10]。

数组bacterioferritin comigratory蛋白(bcp)的家庭,属于插件可以叫Bcp1 Bcp2, Bcp3, Bcp4,最近从hyperthermophilic archaeon硫化叶菌solfataricus(2,11- - - - - -13]。古细菌Bcp1表达大肠杆菌和特征4]。据报道,Bcp1再生通过一个不同寻常的耦合机制。具体来说,减少由之间的相互作用党卫军TrxR (Sso2416)和蛋白质二硫氧化还原酶(党卫军PDO) (Sso0192)(14- - - - - -16取代了标准的硫氧还蛋白。功能研究表明,Bcp1执行使用一种非典型2-Cys催化反应机制,在其中45形成了分子内二硫键50。的x射线结构C45S /网双突变体,代表完全减少酶的状态,决心分辨率为2.15,显示硫氧还蛋白折叠,类似于其他插件可以(4]。

本文表明,古插件可以在真核细胞可以作为一种抗氧化剂。具体来说,我们的数据显示Bcp1过氧化物酶活性在pH值和温度条件下典型的哺乳动物细胞。此外,我们表明,古插件可以是主动的,尽管真核回收系统(不同硫化叶菌)(14]。融合蛋白组成的艾滋病毒Transactivating转导(乙)肽(17)和Bcp1构建促进成H9c2细胞吸收。其可能的细胞毒性作用和能力降低H₂O₂在细胞水平也被评估。我们的结果表明在一个在体外细胞系统(即。,H9c2 rat cardiomyoblasts), the archaeal enzyme can (1) function as an antioxidant to reduce the endogenous peroxide levels and (2) decrease cellular apoptosis following H₂O₂全身的压力。

2。材料和方法

2.1。重组蛋白的表达和纯化大肠杆菌

2.1.1。Bcp1从美国solfataricus

大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)瑞来斯/ pETBcp1 [12)是增长到0.8在Luria-Bertani(磅)中补充了卡那霉素(10μ克毫升⁻¹)和氯霉素(34μ克毫升⁻¹在37°C)。Bcp1表达诱导与异丙基- 1毫米β-D-thiogalactoside (IPTG) (Inalco) 6 h在37°C。大肠杆菌包含重组蛋白的细胞被离心收获,颗粒从1 L文化是悬浮在20毫升的冰冷的20毫米Tris-HCl, pH值8.0,包含一个完整的EDTA-free蛋白酶抑制剂鸡尾酒(美国在罗氏公司)。蛋白质纯化使用先前描述的方法(11]。

2.1.2。硫氧还蛋白(y硫氧还蛋白)和硫氧还蛋白还原酶(yTrxR)酵母

大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)瑞来斯与pET17yTrx转换或pET17yTrxR [18)(唱赢康提供的慷慨,首尔大学、韩国)和培养1 L与氨苄青霉素(100磅中补充μ克毫升⁻¹)和氯霉素(34μ克毫升⁻¹在37°C)。的表达式y硫氧还蛋白和yTrxR与0.5毫米IPTG诱导16 h在37°C0.8。的大肠杆菌细胞被离心收获,每个颗粒悬浮在20毫升的冰冷的20毫米Tris-HCl, pH值7.5,10毫米氯化钠,德勤5毫米,1毫米EDTA和一个完整的EDTA-free蛋白酶抑制剂鸡尾酒和声波降解法而中断5分钟脉冲在20赫兹(30′′和30′′)。可溶性的分数得到超速离心法在160000 g×30分钟后在4°C。

细胞提取30分钟加热在75°C,离心机在4°C 15000×g为30分钟,然后集中(Amicon,微孔Corp .)、贝德福德,妈,美国)净化y硫氧还蛋白。示例加载在Superdex s - 75列(30厘米×1厘米,25毫升),平衡与50 mM Tris-HCl, pH值7.5和0.2 M氯化钾,并连接到一个AKTA系统(通用电气医疗集团)。洗脱的流量进行0.4毫升分钟⁻¹。

样品被加载到一个Hi-Trap DEAE FF列(7×25毫米,1毫升)在20毫米Tris-HCl, pH值7.5,1毫米EDTA与AKTA系统(通用电气医疗集团)净化yTrxR。蛋白质与线性梯度筛选了0 - 0.5 M氯化钠30分钟的流量0.5毫升分钟⁻¹。

蛋白质,分数都是汇集,通过sds - page分析,与20毫米Tris-HCl广泛渗出,pH值7.0。

2.2。酶的活动

2.2.1。y硫氧还蛋白和yTrxR活性测定

y硫氧还蛋白活性检测使用胰岛素沉淀试验(19),在一个包含0.1磷酸钠反应混合物pH值7.0,2毫米EDTA, 1毫克毫升⁻¹胰岛素,1毫米德勤5μM yTrx。吸光度的增加由于胰岛素B链的降水监测在50瓦里安卡里的650纳米生物紫外可见分光光度计。

y使用5 TrxR活动评估,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic酸)(DTNB)还原法20.]。的形成2-nitro-5-thiobenzoate产品监控spectrophotometrically的增加在30°C。反应混合物中含有0.1磷酸钾,pH值7.0,2毫米EDTA, NADPH 0.2毫米,0.05毫米时尚,DTNB 0.5毫米和0.2μM yTrxR。

2.2.2。Bcp1活性测定

Bcp1过氧化物酶活性测试的试验使用德勤[11]。反应混合物中含有0.1玫瑰,pH值7.0,德勤10毫米,0.1毫米H₂O₂,10μM Bcp1。孵化后5分钟在37°C,反应停止添加三氯乙酸溶液10% (w / v)。H的数量₂O₂剩下的被测量检测的purple-coloured ferrothiocyanate复杂,开发后的0.2毫升10毫米Fe (NH₄)₂(所以₄)₂和0.1毫升2.5 KSCN。

Bcp1活动pH值的影响进行了分析使用磷酸柠檬酸0.1米(pH值5.5 - -6.5)和0.1 M消息灵通的pH值(7.0 - -7.5)缓冲区和上面的情况分析报告。Bcp1也是评估的pH值稳定酶孵化后的缓冲区(pH值5.5 - -7.0)30分钟,1 h, 2 h, 4 h, 16 h,剩余的过氧化物酶活性在标准条件下决定。

过氧化物酶活性也评估使用NADPH / yTrxR /减少Bcp1 yTrx作为给电子体系统。分析混合物包含50 mM玫瑰,pH值7.0,1毫米EDTA、NADPH 0.2毫米,5 - 100μM yTrx, 0.1μ3.5 M yTrxR,μM Bcp1。在30°C预培养后2分钟,反应开始通过增加0.2毫米H₂O₂。NADPH氧化监测spectrophotometrically 340海里。

2.3。TAT-Bcp1:克隆、表达和纯化

的bcp1从pET30Bcp1向量编码序列是孤立的12)后消化的濒死经历我和Xho我限制内切酶。的bcp1片段被琼脂糖凝胶电泳纯化使用QIAquick凝胶萃取设备(试剂盒、米兰、意大利)和克隆到pTAT2.2表达载体(美国剑桥Addgene)。大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)瑞来斯主管细胞转化的向量,获得pTAT2.2-Bcp1,选择与卡那霉素(10磅琼脂板μ克毫升⁻¹)和氯霉素(34μ克毫升⁻¹)。选中的殖民地在LB培养基培养是相同的抗生素在37°C。细胞是一个长大的0.8和TAT-Bcp1的表达与1毫米IPTG诱导3 h 37°C。TAT-Bcp1 Bcp1纯化使用相同的条件描述。过氧化物酶活性评估使用德勤试验在37°C,作为Bcp1报道。

2.4。细胞培养和治疗

H9c2细胞(鼠胚胎心肌细胞,crl - 1446)从美国购买类型文化集合(写明ATCC)和生长在杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)补充10%胎牛血清的边后卫,4毫米谷酰胺,1% v / v (100 U mL青霉素、链霉素的解决方案⁻¹),1毫米丙酮酸钠(Euroclone、米兰、意大利)37°C公司5%₂孵化器。刚做好的H₂O₂(Sigma-Aldrich、米兰、意大利)股票溶液添加到细胞的最终浓度0.3毫米和1 h或3 h孵化诱导氧化应激。

2.5。内部化的TAT-Bcp1 H9c2细胞

H9c2细胞被播种在6-well板块2×10的密度⁵细胞/在2毫升的介质,然后TAT-Bcp1 (0.5−10μ米)添加到细胞和培养不同时间(1 h, 4 h、16 h和24小时)。控制,细胞培养介质的缓冲稀释。与trypsin-EDTA细胞被分离,离心收获,用PBS。20分钟的细胞细胞溶解在冰0.5% Triton x - 100在PBS包含一个完整的EDTA-free蛋白酶抑制剂鸡尾酒。在1500×g离心10分钟后在4°C,代表细胞质分数的上层清液由布拉德福德收集和量化方法(21)使用Bio-Rad蛋白质测定试剂(Bio-Rad,德国)。50微克的细胞质蛋白质分离,通过sds - page凝胶含有15%聚丙烯酰胺,然后检查通过免疫印迹分析使用辣根过氧化物酶(合)共轭anti-5X他标记抗体(mAb)(试剂盒)稀释1:2000年阻止缓冲区。化学发光检测执行根据制造商的建议(西方化学发光底物合止动剂,微孔,妈,美国)使用Chemidoc系统(Bio-Rad)。使用一个软件数量进行定量分析。

2.6。细胞生存能力分析

细胞生存能力评估使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)试验22]。H9c2细胞被播种在96 -孔板的密度3.5×10³细胞在0.1毫升的DMEM /好。24小时后,细胞孵育10μM TAT-Bcp1不同时期(1 h, 4 h, 16 h, 24 h, 48 h,和72 h)。控制,细胞培养介质的缓冲稀释。MTT的解决方案(Sigma-Aldrich、米兰、意大利)增加了0.5毫克毫升⁻¹在没有酚红的DMEM(0.1毫升/)。4 h孵化后37°C,盐酸甲瓒盐可溶性在0.04在无水异丙醇,通过测量细胞生存能力评估使用一个自动板读者分光光度计(VICTOR3™Multilabel计数器,珀金埃尔默,谢尔顿,CA,美国)。细胞生存被表示为百分数与控制的方法。每个样本一式三份分析和实验至少重复三次。

2.7。测量H₂O₂内容

H₂O₂水平决定使用过氧化荧光传感器(MAK164 Sigma-Aldrich),生成一个荧光产品与H₂O₂内容与H反应后₂O₂。

细胞内H₂O₂水平测量下(1)生理和(2)强调条件。(1)H9c2细胞进行预处理或有或没有增加浓度TAT-Bcp1 (1 - 20μ在37°C M) 60分钟。接下来,在PBS和细胞溶解,细胞被洗两次报道。然后,过氧化荧光传感器稀释的样本孵化工作解决方案根据制造商的指示和孵化为30分钟37°C。荧光强度是衡量使用多模读者协同HT校准在490 nm激发和发射在525海里。(2)与TAT-Bcp1 H9c2细胞进行预处理(10μM 16 h),然后强调与0.3毫米h₂O₂30或60分钟37°C。细胞被清洗和细胞溶解,最后是H₂O₂使用上面描述的荧光测定水平测定。每组实验包含四个复制。

2.8。细胞凋亡

H9c2细胞被播种在6-well板密度为1.5×10⁵细胞/在2毫升的DMEM和融合发展到近70%。10的细胞培养μM TAT-Bcp1不同时期(1 h, 4 h、16 h和24 h)在治疗h₂O₂1和3 h(0.3毫米)。

2.9。EB和AO染色试验

凋亡细胞检测到溴化乙锭(EB)和吖啶橙(AO)染色的核23]。AO渗透所有细胞和污点细胞核绿色,而EB只有纳入凋亡细胞,细胞核染色红色。

trypsin-EDTA的细胞分离,用冰冷的PBS, resuspended 50μ包含一个5 L (PBSμ克毫升⁻¹EB / AO染料混合物和孵化20分钟的37°C。荧光显微镜下的染色细胞可视化(尼康Eclipse e - 100)。图片在100 x放大。凋亡(红色)和活细胞(绿色)每个样本被算在五个微观领域。

2.10。PARP-1乳沟

核提取准备通过与trypsin-EDTA分离细胞,孵化冰块之上10分钟10毫米玫瑰,pH值8.0,包含10毫米氯化钾,1.5毫米MgCl₂、0.5毫米德勤和一个完整的EDTA-free蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)NP-40溶解它们通过增加0.1%,使离心1500 g×10分钟的溶解产物在4°C。颗粒的溶解在里帕缓冲区(50毫米Tris-HCl, pH值8.0,150毫米氯化钠,NP-40 1%, 0.5%钠脱氧胆酸盐,和0.1% SDS)含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒和孵化冰上30分钟。在1500 g×30分钟离心后在4°C,使用布拉德福德的核内蛋白浓度测定方法(21,30μg蛋白的提取分离10% sds - page。用化学发光法和免疫印迹分析以下抗体:保利(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1)马伯(C2-10,圣克鲁斯,CA)稀释1:2000年阻止缓冲区(5% BSA在TBS缓冲区包含0.1% v / v渐变20)或B23马伯(美国圣路易斯Sigma-Aldrich;1:2000稀释),加载控制核蛋白质。一个HRP-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白被用于检测(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。

2.11。统计分析

细胞生存能力和细胞凋亡的数据分析提出了意味着±SD的至少三个重复。使用双尾学生的统计分析t以及。一个值< 0.05定义为指示一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。序列比对Orthologues Bcp1的插件可以

CLUSTAL多个对齐Bcp1和人类插件可以(h这种破坏和hPrx2) [24(Dot5p)],插件可以酿酒酵母(25),而原核的插件可以属于创伤弧菌(Vv这种破坏和VvPrx2) [9使用肌肉(3.8)]了。如图1,Bcp1身份Dot5p和百分比最高hPrxI分别为35%和33%。第一个类似于Bcp1是典型2-Cys插件可以,和两种酶的特点是CxxxxxC主题,两个半胱氨酸残基和分别为(4,25),但它并不保留氧化过度的敏感主题(GGLG和欧美在糖基)。后者,属于典型的2-Cys插件可以,也有类似的百分比的身份,但敏感的主题,使它容易氧化过度。另一方面,Vv这种破坏和VvPrx2属于原核域,显示低身份Bcp1(25%和27%,分别地。),只有第一个提出了氧化过度的主题。这一分析表明原核Bcp1也可能是一个健壮的酶类,函数在所有真核生物的环境。

3.2。Bcp1过氧化物酶活动

Bcp1表示在大肠杆菌,纯化12),过氧化物酶活动先后在37°C和确定在不同pH值使用德勤在MM检测化验报告Bcp1过氧化物酶活性在典型的温度和pH值条件下的真核细胞。我们的研究结果表明,Bcp1可以去除100%的H₂O₂在37°C(数据未显示),实现最佳的过氧化物酶活性(图7.0 pH值2(一个))。此外,pH稳定性是由孵化Bcp1在不同pH值(5.5 - -7.0)不同时期,然后测量H₂O₂删除(图2 (b))。在pH值7.0 16 h孵化后,Bcp1保留100%的首次活动,在pH值为6.5,6.0,和5.5,酶保持60%,70%,和33%的首次活动,分别。在pH值为5.5,相对Bcp1活动减少47%的初始值在两小时的潜伏期。

前所述,Bcp1加上一个不寻常的氧化还原系统组成的党卫军TrxR与党卫军PDO回收(4]。我们监控Bcp1使用酵母硫氧还蛋白过氧化物酶反应系统(yTrxR /y硫氧还蛋白)和NADPH作为电子源验证Bcp1活动是由真核二硫化还原酶系统。该系统已成功用于测量的过氧化物酶活性h这种破坏和hPrx2 [18,24]。因此,我们表达和纯化yTrxR和y硫氧还蛋白从大肠杆菌并确定其减少活动,报道在毫米(数据未显示)。最初,Bcp1过氧化物酶活动是由测量NADPH的消费,这是揭示了吸光度下降在340纳米(图3(一个));然后,不同浓度的y硫氧还蛋白被用来确定动力学参数(图3 (b))。我们的结果表明Bcp1有值为54.9μ使用不同的系统。

3.3。代的纯TAT-Bcp1融合蛋白

先前的研究表明,当HIV Transactivating转导域(乙),一个简短的11个氨基酸残基的基本多肽,与靶蛋白融合它赋予能力渗透在细胞的脂质双分子层由于强烈的带正电的答域绑定到细胞表面的负电荷(17]。

我们生成TAT-Bcp1融合蛋白的克隆bcp1到pTAT2.2向量允许Bcp1内化进入细胞。重组质粒,pTAT2.2-Bcp1(图S1A),用于产生可溶性与乙域融合蛋白n端和他在糖基的标签。TAT-Bcp1被热处理后跟IMAC色谱纯化使用Bcp1[描述的条件4]。sds - page分析(图印地)显示一个乐队的~ 19 kDa,同意该预测分子量20.229 kDa。

纯化酶的功能特点。德勤进行试验,结果表明,类似于Bcp1, TAT-Bcp1能够减少所有的H₂O₂在相同的pH值和温度条件下(数据没有显示)。

3.4。TAT-Bcp1内化成H9c2细胞

它被广泛报道,H₂O₂导致心血管疾病的起始和进展,包括动脉粥样硬化(26]。我们选择H9c2老鼠cardiomyoblasts,良性的cardiac-like细胞通常用于研究分子反应氧化损伤(27),作为一个模型系统来评估TAT-Bcp1在细胞发生氧化应激的影响。首先,我们建立了最优条件TAT-Bcp1内化。因此,我们培养H9c2细胞和孵化它们与不同数量(清廉μ米)的融合蛋白1 h。如图4(一)胞质提取的免疫印迹分析显示,10μM TAT-Bcp1内化成H9c2细胞的最佳浓度。分析了之后,TAT-Bcp1内化在1 h, 4 h, 16 h和24小时(图4 (b))。融合蛋白的细胞中检测出后1 h(巷7,上半部分),而16%,49%,和69%减少观察4 h后,16 h和24小时(车道8 - 10,上半部分)。这种效应可能与普通蛋白质周转机制因为一个常数的TAT-Bcp1上层清液中不同的时间(图S2,网上道6 - 9(见补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/7424870))。没有检测到乐队当缓冲区被稀释到培养基(图4(一)巷1和图4 (b)、6巷上面板;图S2,巷5)。这些数据表明,TAT-Bcp1最佳传递到细胞10μM和后4小时内是稳定的。

3.5。TAT-Bcp1对细胞活力的影响

MTT试验进行评估TAT-Bcp1是否对H9c2细胞细胞毒性的影响。细胞在生长培养基培养,处理10μ16 M TAT-Bcp1 1 h, 4 h, h和24 h(图5)。1 h孵化后,细胞生长%,而16 h和24 h后,细胞生存略,但明显高于100% (和%,分别地;值< 0.01),表明TAT-Bcp1没有细胞毒性H9c2细胞。孵化也扩展到72 h(图S3),结果显示,95%和91%的细胞存活48 h和72 h,分别证实了上述数据。

3.6。TAT-Bcp1影响H₂O₂浓度H9c2细胞在生理或者压力条件下

内生H₂O₂内容以H9c2细胞溶解产物,对待TAT-Bcp1浓度的增加,或不受氧化应激建立的影响TAT-Bcp1 H₂O₂内容H9c2细胞。

在第一种情况下,H₂O₂水平H9c2细胞溶解产物测定孵化后越来越多(1 - 20μ米)的1 h TAT-Bcp1 37°C。H₂O₂过氧化水平溶菌产物测定使用荧光传感器(见部分2。7)。如图6(一),减少H₂O₂内容中检测出TAT-Bcp1方式存在剂量依赖的相关性,表明蛋白质能够配合内生减少系统H₂O₂去除。

在后一种情况下,我们研究了通过测量H TAT-Bcp1的抗氧化活性₂O₂在细胞受到氧化应激水平。如图6 (b),H₂O₂水平TAT-Bcp1进行预处理,强调细胞(见方法)相比显著降低未经处理的样品。总的来说,这些结果表明,TAT-Bcp1减少了H₂O₂内容H9c2细胞在生理和氧化应激条件下。

3.7。TAT-Bcp1保护H9c2 Cardiomyoblasts从H₂O₂全身的细胞凋亡

H9c2细胞使用10μM TAT-Bcp1不同孵化时间(24小时),然后暴露于0.3毫米h₂O₂1 h研究TAT-Bcp1在h的效果₂O₂全身的细胞凋亡。细胞凋亡分析EB和AO着色(图7(一))。

显著增加观察凋亡细胞的数量后诱导的氧化应激;H的百分比₂O₂对凋亡细胞高出大约三倍(%)(图7 (b),比轻细胞(Ctrl黑条)%)(图7 (b),Ctrl灰色栏)。对H预处理与TAT-Bcp1产生保护作用₂O₂全身的细胞凋亡在时间的方式。的确,与TAT-Bcp1 1 h和4 h孵化后,凋亡细胞的比例%,分别,8%压力条件下观察到的类似。相比之下,在16 h和24 h,凋亡细胞的比例显著降低1.6倍(%,%,职责)。此外,政府TAT-Bcp1轻细胞不诱导细胞凋亡的增加(图7 (b)灰色酒吧),与MTT测定的结果一致。

PARP-1乳沟被核提取物的免疫印迹分析检查确认TAT-Bcp1对H₂O₂全身的细胞凋亡(图8)。典型PARP-1乳沟检测引起的应力条件下孵化的细胞与0.3毫米H₂O₂3 h(图8与10巷2),而预处理μM TAT-Bcp1抑制PARP-1乳沟,显示一个模式类似于控制(图8道3 - 6)。特别是在压力条件下,全身的片段显示,减少了25%的水平相比,控制,然而,TAT-Bcp1预处理后,全长片段级的水平是94% 1 h和100% 4后,16日和24 h,显示细胞反应,在不同预处理时间相当。

符合EB的数据和AO化验,PARP-1劈理分析证实了在H TAT-Bcp1的凋亡效应₂O₂强调细胞。

4所示。讨论

插件可以最近收到更多的关注,因为他们非常有效地去除低浓度的H₂O₂由于他们的高数量低(~ 20μ米)(28,29日]。插件可以,这通常表示在不同的亚型,从古细菌的进化,比如美国solfataricus四种酶被广泛的特点,对人,六个同功酶与不同角色和亚细胞的本地化已确定。无处不在的插件可以和他们在不同的系统之间同源性守恒的域显示这些酶的重要角色除了过氧化物酶活动(30.]。尽管他们保留了硫氧还蛋白折叠描述这个家庭和过氧化物酶活性(2),这些酶实现了它们的功能通过插入一个敏感主题的结构实现微调过氧化水平,发挥监管作用的细胞。越来越多的证据表明,都毫无疑问的插件可以参与氧化应激反应和他们的角色在调节细胞内H₂O₂水平,负责细胞增殖、血管生成和细胞凋亡31日- - - - - -33]。此外,结果表明,氧化过度的敏感的主题,促进插件可以在真核和原核生物(独立进化而来的34]。

我们的研究主要集中在抗氧化活性的一个强大的插件可以开发新的抗氧化药物;我们选择原核的插件可以,Bcp1,从美国solfataricus缺乏敏感主题真核同行相比,具有更高的鲁棒性。从这些差异,我们首先评估是否Bcp1展出过氧化物酶活动的情况下,是典型的哺乳动物细胞和真核的存在回收系统yTrxR / yTrx。我们的研究结果表明,酶可以在37°C函数和pH值7.0和16 h孵化后仍稳定在这种情况下,强调的潜在使用这种酶在生物技术应用35]。与真核生物和细菌插件可以,Bcp1 TrxR / PDO[组成的一个奇怪的循环系统13)而不是TrxR /硫氧还蛋白减少系统通常使用的真核生物。因此,这不是明显Bcp1能否与yTrx混合再生系统。我们的结果不仅表明Bcp1是有效地减少H₂O₂水平的存在yTrxR /y硫氧还蛋白系统,但也表明其亲和力y硫氧还蛋白相媲美,报道人类插件可以(18),暗示可能Bcp1在真核细胞的活性。基于在体外描述,我们分析了Bcp1对H₂O₂全身的细胞凋亡在H9c2细胞,目的是分析可能使用的热点插件可以作为一种抗氧化剂。

我们设计了融合蛋白TAT-Bcp1调解其内化成H9c2细胞和分析Bcp1在细胞应激反应的影响。TAT-Bcp1在细胞中有效地检测到的1 h后管理和24小时后逐渐下降到70%,与蛋白质流动率在协议。此外,蛋白质并没有引起任何细胞毒性的影响,但它可能有一个cytoprotective效果,如图所示的轻微但显著增加细胞生存能力在16 h和24 h。这一研究获得的结果表明,TAT-Bcp1不仅有效地降低了H₂O₂水平H9c2细胞在生理和压力条件下,表明酶内生循环系统可以使用,但也可以减少细胞凋亡,EB / AO染色试验,如图所示7在图和PARP-1乳沟分析8。在一起,这些结果表明,TAT-Bcp1的抗氧化活性可能在保护细胞免受细胞凋亡中发挥作用。

5。结论

这项研究是第一个报道的古细菌酶交在哺乳动物培养细胞能够保护细胞不受氧化应激通过减少细胞内过氧化水平和细胞凋亡。Bcp1的内在稳定性及其修改,它提供了进入细胞的能力,使得TAT-Bcp1好候选人研究细胞中清除ROS的有效性。越来越多的证据表明是突出角色的插件可以在不同的疾病,从糖尿病到心血管疾病的神经障碍;因此,这项工作的目标是提供新的见解的可能性使用替代抗氧化酶的来源,比如从嗜热微生物。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢唱赢康博士,细胞信号传导研究中心和分裂分子生命科学、梨花女子大学,首尔,韩国,慷慨地提供质粒:pET17yTrx pET17yTrxR。支持的工作是由坎帕尼亚FSE 2007/2013, Progetto船底座杯B25B09000080007,和Sostegno Territoriale阿莱Attivita di Ricerca (STAR) 2014年,那不勒斯大学费德里科•二世杯E68C13000020003。

补充材料

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