产烷生物多样性在本土和介绍了青藏高原反刍动物物种

文摘

宿主因素被视为重要的塑造瘤胃中的古细菌社区但执行一些控制研究已经证明在宿主物种在相同的环境条件下。研究旨在调查的瘤胃产烷生物群落的结构两个土著(牦牛和藏羊)和两个介绍国内反刍动物(牛和羊杂交)物种提出在高海拔和美联储在类似条件下青藏高原。的methylotrophic Methanomassiliicoccaceae是所有动物的主要热点集团虽然Methanobrevibacter通常出现在全球更大的丰富反刍动物。此外,在Methanomassiliicoccaceae家庭成员Mmc。10组和Mmc。组4相比,主要在西藏高原反刍动物Mmc。12组在其他反刍动物研究发现最高。小反刍动物提出最多的序列属于Methanomassiliicoccaceae相比更大的反刍动物。虽然产烷生物群落结构不同在反刍动物物种中,在这种环境下动物之间有惊人的相似之处。这表明极端环境条件和饮食等因素在青藏高原会产生更大的影响瘤胃产烷生物社区相对于主机上的差异。

1。介绍

青藏高原(QTP)也被称为青藏高原,占地面积250万公里²和经常被称为地球的“第三极”,因为它是一个主要的司机的全球气候条件(1]。牧场覆盖总面积一半以上的高原和维持一个巨大的人口反刍动物包括土著物种如牦牛、藏羊(2]。牦牛是一个节能的反刍动物适应高原的恶劣的环境和相对较低的甲烷生产(3- - - - - -5]。肠内发酵和饲料生产是主要的贡献者为反刍动物甲烷排放,代表最大的温室气体(GHG)源从农业部门(6]。在瘤胃,古生菌产生甲烷主要来自减少二氧化碳(有限公司₂)和氢(H₂),来自细菌发酵(7]。肠道甲烷的形成作出了重要贡献,温室气体排放也代表一个损失2至12%的反刍动物饲料能量摄入(8]。

研究表明,古细菌种群的瘤胃会受到年龄的影响和物种的主机、饮食、季节,和地理区域(7,9,10]。据报道,牦牛的瘤胃微生物生态系统明显不同于牛(3]。

形状的因素研究瘤胃中的古细菌社区提供基础知识和可能导致策略减少甲烷排放量这些牲畜。出于这个原因,本研究旨在调查的瘤胃产烷生物群落的结构两个土著(牦牛和藏羊)和两个介绍国内反刍动物(牛和羊杂交)物种提出类似的极端条件下和美联储QTP。到我们所知产烷生物种群的差异和机制,控制这些变化没有在本土调查,介绍了在相同的环境条件下存在的反刍动物。我们假设,由于其适应严酷的QTP牧场土著牦牛和藏羊与一个独特的协同进化瘤胃热点人口时,不同于牛和羊杂交引入类似的饮食条件下检查。

2。材料和方法

2.1。动物,饮食,和实验设计

总共12被阉割的雄性动物(3.5 - 4岁)从两个土著和两个介绍反刍动物组用于实验。反刍动物用三个驯化牦牛(Bos grunniens)(BW:公斤);三家牛(牛)(BW:公斤);三个甘肃高山细羊毛羊(羊属白羊座)公斤;和三个西藏羊(羊属白羊座)(BW:公斤)。西藏牦牛和绵羊是动物QTP土著。甘肃高山细羊毛羊羊是一个介于西藏和新疆细羊毛羊而本地牛叫“黄妞妞”(黄牛)的十字架西门塔尔牛和驯化本地牛和已经成功地引入到高山牧场面积。实验周期前,所有的动物都cograzing夏末牧场在中国QTP组成大高寒草场和Kobresia云淡的草,Kobresia capillifolia,蓼属植物viviparum,大针krylovii,苔属植物moorcroftii作为主要草本植物物种,以及灌木柳树cupularis和Dasiphora后。

在实验期间所有的动物喂养随意吃燕麦干草:大麦(70:30)组笔(燕麦干草克/公斤的DM的化学成分:CP, 79;NDF, 561;ADF, 428;灰,80;DM, 905克/公斤新鲜;大麦在g / kg的DM化学成分:CP, 128;灰,22;DM, 865克/公斤新鲜)。14天的适应期后,90毫升的瘤胃液体收集通过胃管,四层过滤消毒纱布,立即转移到无菌瓶,并存储在液态氮,直到处理DNA和短链脂肪酸(SCFA)分析。所有动物管理和研究过程进行了下动物使用协议通过兰州大学(uni - 2010 - 1)。

2.2。短链脂肪酸的分析

短链脂肪酸(SCFA)分析瘤胃液体从不同的样本是由气相色谱根据郭et al。描述的方法(14]。气相色谱仪(型号6890 n / 5973 n,安捷伦科技,威尔明顿,美国)配备火焰离子化检测器和熔融石英毛细管柱(HP-20M 60 m×0.32毫米×0.3μ美国m,惠普,帕洛阿尔托,CA)被用于这项研究。

2.3。DNA提取、焦磷酸测序和量化

从300年总基因组DNA提取的一式两份μL整除的解冻瘤胃样本(酒和植物颗粒)使用QIAamp®DNA凳子工具包(试剂盒、德国)制造商的指示和后通过添加“冻结和解冻”过程(3次)之前提取。提取的DNA的产量和纯度是评估使用Nanodrop 8000分光光度计(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)和Quant-iT dsDNA BR工具包(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。

两步16 s rRNA基因编码PCR作为描述de Carcer et al。11)是与小修改,本研究使用罗氏454焦磷酸测序。DNA样本归一化到20 ngμl⁻¹PCR反应的混合(25μL)和主PCR 16 s rRNA基因目标使用一组特定引物的热点(A340F / A1000R) (12)(表1)。放大由最初的变性步骤在94°C 2分钟紧随其后的是32变性的周期为10 94°C;在57°C 45 s退火;72°C 45 s伸长;和最后一个伸长步骤10分钟的72°C。PCR产品核酸外切酶处理我和小牛肠碱性磷酸酶酶(新英格兰生物学实验室,马伊普斯维奇)37°C和80°C的20分钟每个紧随其后的第二个PCR与适配器链接器和条形码底漆(11)(表1)。在95°C进行了放大2分钟紧随其后10周期在95°C的变性;退火在55°C 30年代和68°C 1分钟;在68°C和最后一个扩展10分钟。铂Taq DNA聚合酶高保真(表达载体,卡尔斯巴德,CA)是用于中小学PCR反应。

最后PCR产品运行在1.5%琼脂糖凝胶,Gel-Doc视觉效果,和bands-quantified体积量的工具使用一个软件(Bio-Rad大力神,CA)。克分子数相等的数量的PCR产品汇集和凝胶使用试剂盒提取DNA凝胶萃取设备(试剂盒、希尔登,德国)。最终产品是测序Macrogen(首尔,韩国)使用454 GS FLX音序器(罗氏,布兰福德CT)。

实时定量PCR (qPCR)是用于绝对量化的Methanobrevibacter人口和瘤胃Methanomassiliicoccaceae家族成员(也称为瘤胃集群C;碾压混凝土),基于目标基因的拷贝数。使用ViiA定量PCR进行™在384 - 7实时PCR系统光学反应板(美国应用生物系统公司,CA)。用于实时PCR引物组描述表1。新引物检测物种的Methanobrevibacter属和Methanomassiliicoccaceae家庭被探测器匹配设计和分析工具的ARB软件(15)从绿色煤电使用16 s核糖体核糖核酸序列数据库16]。瘤胃Methanomassiliicoccaceae引物设计相比,本研究与一组引物由Jeyanathan和同事(13]。

验证新引物对目标基因的特异性集是由常规PCR(2.5毫米MgCl₂)与铂Taq在下列条件:在94°C 2分钟一个周期,40 94°C的周期30年代和60°C 15年代,68°C, 1分钟。从瘤胃PCR产品样本分析TA克隆(pGEM-T简单设备;Promega公司,麦迪逊,WI)和克隆测序证实了使用BigDye终结者v3.1工具包(应用生物系统公司,培育城市,CA)。

定量PCR分析建立了使用铂SYBR绿色qPCR SuperMix-UDG ViiA(表达载体)和执行™7实时PCR系统。实验条件优化引物,模板DNA和MgCl₂浓度,扩增子特异性分离曲线分析描述(17]。瘤胃微生物总DNA稀释1:10之前使用实时PCR检测减少抑制。每个反应(标准曲线和样品)进行了一式四份。

标准曲线的绝对量化Methanomassiliicoccaceae和Methanobrevibacter被稀释系列(生成10⁸到10²副本μl⁻¹)包含各自的16 s rRNA目标基因的质粒(18]。复制数字每毫克样品DNA计算基于质粒拷贝数的标准及其浓度来衡量Quant-iT工具包。丰富的分析Methanomassiliicoccaceae决心使用应用生物系统公司ViiA™7软件,然后根据标准曲线计算(> 0.99)。每个扩增的PCR效率在97%到104%范围内。

2.4。序列图和统计分析

序列数据处理软件包使用定量了解微生物生态学QIIME [19]。短暂,序列筛选平均最低质量分25在50个基点滑动窗口和修剪长度从300个基点,至600个基点。序列被分配给不同的样本使用各自的条形码。嵌合基因组序列被确定与在线数据库(黄金,版本4.0)使用UCHIME [20.]。序列分为操作分类单位(辣子鸡)0.99相似性阈值使用uclust [21]。误差修正的454测序读使用金合欢1.52执行22]。瘤胃产烷生物的分类任务执行辣子鸡对瘤胃和肠道Methanogen-DB (RIM-DB) [23]。OTU表受到α和β多样性的措施使用QIIME和通过Phyloseq和DeSeq2 R包进行进一步分析24,25]。热图和集群最丰富的日志将值从100辣子鸡使用正规化DeSeq2生成使用aheatmap NMF R的函数包(26]。沃德的最小方差法用于计算距离矩阵的层次聚类样本Jaccard不同指数的基础上OTU素食包中的数据(27]。本文获得的序列已经存入欧洲核苷酸存档(ENA)加入PRJEB13326数量。

短链脂肪酸和qPCR数据受到单向方差分析分析SPSS 15.0版(SPSS Inc .,芝加哥,IL)。治疗效果或差异被认为是重要的值< 0.05。

3所示。结果

3.1。瘤胃发酵

产生的SCFAs实验动物如表所示2。总SCFA牦牛和羊杂交浓度明显高于(牛和西藏羊相比)。SCFA作为醋酸的比例显著降低()比杂交和西藏牦牛羊(71.9%、74.1%和74.6%,分别地。)但不不同于牛。相反丙酸比例明显高于()比牛和西藏牦牛杂交羊羊(14.5%,15.02%,12.28%和12.97%,分别地)。因此,醋酸:丙酸比例较高(在牛和西藏羊(5.97和5.76)相比,牦牛杂交羊(4.98和4.94)。

3.2。古细菌群落结构

香农指数分析表明更高的多样性在西藏羊()和牦牛()()相比,杂交羊(和牛)(补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/5916067)。

古细菌的分类学分类社区(图1)透露的存在三个主要瘤胃Euryarchaeota家庭:Methanobacteriaceae Methanomassiliicoccaceae, Methanosarcinaceae。所有的动物拥有古生菌的优势种群隶属于Methanomassiliicoccaceae家族,这明显高于(在西藏羊(81.1%)和杂交羊(69.1%)与牦牛(57.9%)和牛(58.5%)。动物包含五个主要Methanomassiliicoccaceae分类群,组10和4一直被高度丰富的所有动物(图1)。第二大的家庭属于Methanobacteriaceae这人口明显高于()在牦牛(41.3%)和牛瘤胃(39.7%)相比,杂交羊(30.8%)和西藏羊(18.7%)。在Methanobacteriaceae家庭最观察分类法被分配到Methanobrevibacter gottschalkii进化枝,紧随其后的是Mbr。ruminantium对所有的动物进化枝。牦牛还有一个高比例的序列关联密切相关Mbr。woesei和Mbr。sp。RT进化枝(图1)。对所有的动物除了牛主Methanosphaera分类主要是分配给Msp。sp。ISO3-F5,而对于牛Msp。stadtmanae。的相对丰度Methanosarcinaceae低在所有组(牦牛,0.69%;牛,1.79%;西藏羊,0.19%;杂交羊,0.01%)和主要分配给相关的分类Methanimicrococcus blatticola。

的总体组成和亲缘瘤胃产烷生物种群在OTU级动物之间是不同的;然而,牛和牦牛杂交羊一样共同的相似度和聚在一起和西藏羊(图2)。β多样性的措施的比较瘤胃产烷生物群落结构显示分离的小反刍动物和大型反刍动物集团解释方差的第一轴(25.5%),而一个小比例的方差从牛和观察牦牛样品沿着第二轴(16.1%)(补充图2)。

最丰富的辣子鸡的杂交羊和西藏羊是相关的Mmc。10组,而牛最丰富OTU是相关联的Mbr。gottschalkii和牦牛最丰富的一个是一个OTU被确认为是隶属于Mbr。sp。rt,在所有的动物最丰富的两个Mbr。gottschalkii辣子鸡是一样的是他们的等级次序。更多的方差排序是观察Methanomassiliicoccaceae辣子鸡。然而,所有的动物都是由相同的Mmc。组4和Mmc。集团10辣子鸡。最丰富的辣子鸡隶属于一个变化Mmc。组12观察动物牛、牦牛具有不同人口的西藏杂交羊羊(图2)。分析这些辣子鸡特定动物的丰度变化成对比较提出了补充数据和统计证实了观察如图2为进一步的细节(补充图3 - 8)。此外辣子鸡共同所有的动物作为显示在图2没有发现明显不同(补充图3 - 8)成对比较。

Methanomassiliicoccaceae成员和丰富Methanobrevibacter物种与qPCR测量提出了表3并同意16 s测序数据。西藏羊有更高的丰度()Methanomassiliicoccaceae古生菌相比其他反刍动物群体而牦牛显示显著()更多Methanobrevibacterspp。两套qPCR底漆用于目标Methanomassiliicoccaceae产生了类似的丰度没有显著不同的估计。

4所示。讨论

基于全球分析32反刍动物物种不同的饮食、瘤胃古生菌的多数(~ 74%)的成员Mbr。gottschalkii和Mbr。ruminantium演化支(28]。一群知之甚少瘤胃古生菌参与Methanomassiliicoccaceae家族的成员在一起Methanosphaerasp.其他主导瘤胃古生菌(~ 9%)7,10,28]。

虽然最近出版的全球瘤胃普查数据发现的存在古Methanomassiliicoccaceae平均13.5%的人口,在目前的研究中,Methanomassiliicoccaceae是所有动物的主要组织和代表超过一半的序列表明人口众多的产甲烷菌在反刍动物QTP地区尚未功能特征。除了更高比例的Methanomassiliicoccaceae序列在这项研究中,占主导地位的分类也不同于报道全球瘤胃的人口普查,这主要是分配给分类法Mmc。12组。动物在QTPMmc。10组和Mmc。组4主导的重大贡献Mmc。12组和Mmc。组9。西藏和杂交羊提出最多的属于Methanomassiliicoccaceae序列相比,较大的反刍动物,牦牛和牛,更少的序列属于进化枝。结果是按照黄等。3]还发现Methanomassiliicoccaceae作为主导产烷生物群体在QTP牦牛和牛。然而,大量的Methanomassiliicoccaceae序列在研究牦牛和牛(80.9%和62.9%,分别地。)高于当前的报告。这可能是由于使用的引物和测序方法等因素,饮食,或宿主因素。其他研究也报道大量的高Methanomassiliicoccaceae瘤胃集群在一些山羊(23%)(29日)、牛(63%)(30.],羊(81%)[31日]。

瘤胃Methanomassiliicoccaceae似乎附属的产甲烷古菌属于拟议中的新秩序Methanoplasmatales [32- - - - - -35]。最近,Padmanabha et al。36孤立的一个产烷生物从这个家庭和证明他们是专性H₂端依赖methylotrophic产甲烷菌,还预测从metatranscriptomic研究瘤胃[34),从基因组分析家族的成员33]。

此外,Methanimicrococcus blatticola,一个专性依赖于氢methylotrophic Methanosarcinaceae家族内产烷生物,利用甲醇和主要(37也观察到这些动物。他们更普遍的牛和牦牛物种和几乎缺席杂交羊。

methylotrophic产甲烷菌的存在可能是指示性的饮食富含甲基化合物,例如,水平较高的果胶或osmolytes [28]。这些植物的微生物发酵底物在动物QTP可能是驾驶甲基化合物的提供更高的收益率,从而促进这些methylotrophic产甲烷菌的丰度。有一个广泛的多样性的植物被擦伤了QTP包括莎草和福布斯其中许多可能包含这些甲基化合物(2]。进一步研究细菌数量的变化与甲基化复合途径目前正在进行。

第二个主要热点集团在西藏反刍动物属于家庭Methanobacteriaceae(38.8 - -41.4和18.6 - -30.8%,大型和小反刍动物,职责。),按照其他的研究,表明其重要性在反刍动物一般(3,10,28]。虽然Methanobrevibacter(17 - 39%)Methanosphaera(1 - 2%)显著的数量在所有西藏反刍动物,它们的相对丰度低于报道更常见的在其他反刍动物(76和8%,分别地。)28]。一些作者认为可能降低瘤胃产甲烷菌和甲烷的多样性之间的联系,尤其是与Methanomassiliicoccaceae的丰富的产甲烷菌(3,30.,38]。然而,还需要进一步的研究来证实,降低甲烷排放特征的动物有更大的人口Methanomassiliicoccaceae相关产甲烷菌。以前Methanomicrobium瘤胃社区的报道作为主要成员与最近分析表明他们可能代表产烷生物大约5%的人口7,28]。与此同时他们只在杂交羊在一个非常低的比例(0.04%)。因此,在西藏反刍动物瘤胃产甲烷菌的多样性模式相对相似的在四个反刍动物物种中对他们独特的差异报告反刍动物一般。然而,人口仍然隔离到那些可能表明从小型和大型反刍动物宿主基于瘤胃的大小的影响。

丰度差异及存在特定的辣子鸡、被确定与特定的宿主动物。特别是两个辣子鸡被识别为属于密切相关Mbr。woesei和Mbr。sp。RT只出现在牦牛瘤胃样品和反刍动物似乎是唯一的。辣子鸡都牦牛的主要产烷生物的物种,而不是其它反刍动物中发现的筛选。类似的研究中,黄等。3)还发现了克隆相关Mbr。woesei牦牛和没有报告这些产甲烷菌在全球32反刍动物物种的分析在不同的饮食28]。

最伟大的多样性的热点辣子鸡QTP发现土著人群,西藏牦牛和绵羊。虽然研究中的聚类分析显示不同产烷生物群落结构在大型(牦牛和牛)和小反刍动物(羊杂交和西藏),占主导地位的辣子鸡是四个反刍动物物种之间共享。因此,我们得出结论,地理位置和饮食影响可能有更大的影响力比宿主因素产烷生物种群的多样性。我们推测,海拔(气压)的结合,低温,在这种极端环境中原生植物,和相对隔离的动物种群与其它动物接触可能是驱动因素,维持这些微生物种群;然而这些假设需要进一步测试。这个假设不符合一些研究表明寄主专一性的影响在产烷生物的社区结构(13,39]。然而,明显不同的微生物群落结构可能出现的分子技术用于研究环境的人群。目前,下一代测序(上天)允许更深入和更精确的分析微生物群落与其他分子技术相比,在以往的研究中使用。这或许可以解释为什么更多的独特的辣子鸡牦牛和牛相比,本研究中发现了与另一个报告的分析是基于一个图书馆大约400个克隆(3]。

丰富的Methanomassiliicoccaceae也量化了qPCR使用两套引物,一个来自Jeyanathan et al。13本研究)和另一个专门设计的。我们的研究结果表明,两种底漆Methanomassiliicoccaceae为目标,集显示更高的富足的家庭样本藏羊和牛相比,牦牛和羊杂交。丰富的Methanobrevibacter牦牛是明显高于牛、藏绵羊,杂交羊。这些估计的大量使用qPCR按照相对丰富模式提供的16 s rRNA基因序列分析。

相对于瘤胃发酵模式,更高水平的丙酸和异戊已报告和总SCFA牦牛(3,40),这可能是更有效的消耗,从而降低甲烷生成氢代谢途径。我们按照这些研究结果,显示类似的显著差异在发酵模式在西藏牦牛与牛和羊。然而,牦牛杂交羊表现出类似的发酵模式,显著降低醋酸丙酸比与西藏绵羊和牛相比,这可能是由于杂交效果,提高其适应这个环境。

总之,目前的研究描述了反刍动物的瘤胃产烷生物社区QTP放牧。虽然产烷生物群落结构不同的反刍动物物种,有惊人的相似之处是截然不同的动物瘤胃古细菌群落结构的观察到在全球瘤胃普查(28]。这表明的极端环境和饮食等因素QTP可能对瘤胃产烷生物群落结构的影响大于宿主差异。Methanomassiliicoccaceae家族的成员主导产烷生物的人口从QTP反刍动物,和他们的特定的角色和功能在瘤胃中值得进一步调查。

缩写

QTP:	青藏高原
qPCR:	定量聚合酶链反应
短链脂肪酸:	短链脂肪酸
OTU:	操作分类单位。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有利益冲突的研究。

确认

这项工作是支持的研究经费来自国家自然科学基金委(31500101),中央大学的基础研究基金(lzujbky lzujbky - 2013 - 78 - 2015 - 262),和中国奖学金委员会。作者欣然承认Stanislas Mondot博士的技术援助。

补充材料

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