古菌和细菌适应高总氨产甲烷反应器治疗猪浪费

文摘

抑制由铵浓度高于1000 mgN / L是伤害的厌氧消化产甲烷阶段。我们厌氧消化猪的浪费,取得了稳定状态的cod去除率效率约52%没有脂肪酸或H₂积累。由于厌氧微生物群落适应总氨氮(NH的逐渐增加₃- n)来mg / L,细菌和古细菌社区变得不那么多种多样。Phylotypes hydrogenotrophic最密切相关Methanoculleus(36.4%)和Methanobrevibacter随着acetoclastic (11.6%)Methanosaeta(29.3%),成为了最丰富的古细菌序列在适应环境。这是伴随着急剧增加的相对丰度phylotypes大多数产乙酸菌和脂肪酸生产商密切相关(梭状芽胞杆菌,Coprococcus,Sphaerochaeta)和syntrophic脂肪酸细菌(Syntrophomonas,梭状芽胞杆菌,Clostridiaceae物种,和Cloacamonaceae物种)丁酸和丙酸发酵代谢功能,以及反向acetogenesis。我们的研究结果提供证据对抗主流理论acetoclastic时选择性地抑制产甲烷菌的总氨氮浓度大于~ 1000 mgN / L。相反,acetoclastic和hydrogenotrophic产甲烷菌共存于总氨氮的存在~ 2000 mgN / L与脂肪酸发酵,通过建立syntrophic关系以及homoacetogens能够进行正向和反向acetogenesis。

1。介绍

动物粪便产生的贡献超过一半再浪费在美国(1,2]。动物粪便中的有机碳可能是一个可再生能源的主要来源,如果它被捕获的甲烷气体。许多动物粪便,包括猪浪费,还富含有机氮(N)由于动物的饮食中蛋白质含量高。厌氧水解和发酵有机氮转化为氨氮(NH)₃- n)。而典型的NH₃- n(即。,unionized NH₃和)国内污水污泥在厌氧消化器治疗浓度650 - 1100毫克⁻¹(3),在猪肥料浓度高达8000毫克⁻¹(4- - - - - -6]。挑战出现治疗这些废物(并最终捕捉有机碳能源)北半球₃L - n高于1000毫克⁻¹是有毒的许多微生物组(7,8),包括产甲烷古菌(9,10]。

在厌氧系统由NH没有抑制作用₃- n、有机酸产生acidogenesis发酵醋酸和H₂,典型的分布的电子流甲烷是67%通过醋酸和33% H₂(11,12]。相应地,acetoclastic产甲烷菌在厌氧消化器通常占主导地位的< NH 1000毫克₃- n L⁻¹(13,14]。相反,绝大多数的研究从猪浪费甲烷生成报告,主要从acetoclastic切换到hydrogenotrophic甲烷生成途径。几项研究[15- - - - - -19)报道,甲烷产量与高NH厌氧反应器处理废物₃通过hydrogenotrophic - n主要发生甲烷生成,因为acetoclastic产甲烷菌抑制和淘汰。acetoclastic产甲烷菌在生物反应器的损失提出了质疑的命运产生的醋酸发酵。之前推测的损失acetoclastic产甲烷菌被syntrophic补偿“醋酸氧化”有限公司₂和H₂(更准确地称为反向acetogenesis)加上hydrogenotrophic甲烷生成(20.]。具体地说,所产生的醋酸发酵转化为H₂和有限公司₂通过反向acetogenesis, H₂和有限公司₂是利用hydrogenotrophic甲烷生成。所涉及的反应syntrophy反向acetogenesis加上H₂转换成与它们相应的甲烷说明表1方程(1)和(2),分别。反向acetogenesis醋酸可能不是唯一的机制,允许当治疗high-ammonium废物转化成甲烷。甲烷生成是可能的如果一些acetoclastic产甲烷菌能够适应high-ammonium浓度和避免被冲毁。事实上,Westerholm等人发现acetoclastic产甲烷菌在增加NH产甲烷反应器的操作₃L - n浓度(从800到6900毫克⁻¹)[21]。因此,适应一段时间可能是至关重要的发展中一个微生物群落acetoclastic产甲烷菌能够容忍NH高₃- n。

微生物群落适应的另一个关键方面是H的清除₂在发酵生产和反向acetogenesis。众所周知,丙酸发酵(方程(1 b)在表1)和丁酸(方程(1 c))是加上hydrogenotrophic甲烷生成(22- - - - - -24]。这些脂肪酸的高吸能自然发酵实例意味着他们只能发生在非常低的分压的H₂(< 10⁻⁴atm),这就需要严格syntrophic伙伴关系与H₂拾荒者,如hydrogenotrophic产烷生物,维持负面对发酵进行(25]。

厌氧反应器处理高NH的微生物生态学₃- n废弃物得到了有限的关注(15,26- - - - - -28),和可能syntrophies在不同古菌发酵细菌,homoacetogens还知之甚少。高通量测序结合统计分析可以用高NH照射微生物动力学₃- n浓度通过识别关键古生菌和细菌参与syntrophic脂肪酸转化成甲烷。在这项研究中,我们使用高通量测序,参数相关,qPCR(定量聚合酶链式反应)来分析古细菌和细菌群落的变化在启动阶段(前105天)的厌氧消化池成功治疗猪肥料生成甲烷和乙酸没有显著积累或H₂。与之前的解释NH的影响₃L - n浓度高于1000毫克⁻¹,acetoclastic产甲烷菌甲烷生产中发挥着重要作用。我们的结果指出涉及acetoclastic产甲烷菌,syntrophies hydrogenotrophic产甲烷菌,homoacetogens和其他syntrophic acid-fermenting开发启动期间产甲烷细菌生物反应器能够与NH函数₃NH - n大于~ 2000毫克₃- n L⁻¹。

2。材料和方法

2.1。厌氧生物反应器设置和操作

1 l的生物反应器由玻璃船不断搅拌在170 rpm和运营37°C和pH值为6.9 - -7.6。反应器接种1:2厌氧消化污泥的体积比猪浪费,确保NH的浓度₃L N - N低于1100毫克⁻¹。西北废水的厌氧消化池污泥得到复垦植物(美国亚利桑那州梅萨)和猪废料客户食品(美国亚利桑那州雪花)。

生物反应器是在批处理模式为35天,在此期间甲烷生产达到一个高原。手术之后,改用半连续模式通过日常删除和添加33毫升无菌注射器的猪饲料浪费在激烈的N₂鼓泡。水力停留时间(HRT),等于固体保留时间(SRT), 35天(表示“循环”的手稿数据)。生物反应器是半连续运行105天。

2.2。化学分析

化学分析是用来描述数组输入猪浪费和监测厌氧反应器的性能通过从反应堆的均相液体样本内容。道达尔和可溶性化学需氧量(TCOD和SCOD),可溶性总氮(TN)和北半球₃- n与哈希化验®工具使用分光光度计波长的吸光度620年,410年和655海里。可溶性浓度测定过滤后通过0.45样例μm膜过滤器。

气体样品(200μL)于500年退出了生物反应器顶部空间使用μ上海黄金交易所L气密注射器(瑞士),量化甲烷(CH₄)和氢(H₂2010年)浓度使用气相色谱仪(GC,日本岛津公司)配备热导检测器和填充柱(ShinCarbon圣100/120网,Restek公司)。N₂是载气供应405 kPa的恒压和恒流率10毫升最小⁻¹注入的温度条件,列,和探测器是110,140,和160°C。

2.3。DNA提取

四种生物质样本获得的培养液和废水的厌氧生物反应器的批处理操作,第一和第二周期结束时的半连续操作,当系统处于稳定状态根据COD去除CH₄。废水样品颗粒状使用埃普多夫微型离心机5810 r(纽约Hauppauge) 13200 rpm。DNA提取0.25 g(湿重)的两个小球每个采样点使用该款PowerSoil®DNA提取工具包(CA)卡尔斯巴德。DNA复制丸合并排序。

2.4。高通量微生物群落分析

确定细菌群落结构的半连续反应堆启动过程,我们使用Illumina公司MiSeq DNA测序平台在明尼苏达大学基因组学中心(http://www.health.umn.edu/research/resources-researchers/genomics-center)。细菌引物是V4F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和V6R (5′-ACAGCCATGCANCACCT-3′),该放大V4-V6 16 s rRNA基因的变异度高的地区。读取paired-end,和两端的DNA片段由300个基点(2×300个基点)。在处理之前读取使用QIIME 1.8.0管道(29日),我们正向和反向序列配对使用PANDASeq [30.]。读取后重叠的平均长度是551个基点。

古细菌社区测序DNA先生(http://www.mrdnalab.com/美国,Shallowater TX) Illumina公司MiSeq遵循制造商的指导方针。16 s rRNA引物349 f - 806 r,与底漆,条形码是用来放大的V3和V4高变区高度保守的基因(31日]。读取paired-end,和两端的DNA片段由300个基点(2×300个基点)。读取后重叠的平均长度是449个基点。细菌和古细菌的原始序列提交NCBI序列读取存档和可用下加入以下数字:SAMN04481086-SAMN04481094。

序列至少有下列特征之一是省略的下游分析:短于200个基点,与质量得分为25或以下,与任何底漆或条形码不匹配,和超过6均聚物。的序列,通过过滤质量,辣子鸡选择基于97%序列相似性使用UCLUST算法(32]。每个集群的最丰富的序列被选为代表序列。使用PyNAST序列对齐的方法(33)和过滤去除空白和嵌合体(使用ChimeraSlayer [34])。UCLUST算法(32)是用于指定分类的最丰富的序列每个OTU通过比较最丰富的序列的每个绿色煤电数据库(35]。OTU表每个细菌和古细菌序列(1)产生的代表序列不包括嵌合体。辣子鸡单序列(单件)从OTU表中删除。为了避免偏见,抽样时出现各种物种在一个社区,OTU表是子样品(稀薄)使用伪随机数生成器(PRNG) NumPy,梅森素数PRNG的实现(36]。最后辣子鸡人数3275 776细菌和古生菌。高质量的数字读取每样细菌和古生菌分析25000年和90000年序列,分别平均。

2.5。样本的多样性

我们计算示例物种多样性(α多样性)评估PD -(系统距离)树形和observed-species指标使用QIIME 1.8.0管道(29日]。为此,我们执行多个二次抽样(稀疏)OTU表(分别细菌和古生菌)的深度100年10复制序列,我们分析了稀疏的措施序列号每样都是平等的(每样18000序列32000细菌和古生菌)。

2.6。实时定量PCR (qPCR)

我们在20 qPCR执行μL反应,每个都包含6μL PCR级水,0.04μL TAQMAN探测器(200海里),1μL的正向和反向引物(500海里),10μL TAQ PCR SuperMix (1 x)或SYBR绿色混合(1 x)和2μ归一化DNA 10 ng / L模板μL(130海里)。使用TAQMAN化验,我们使用了qPCR引物和前面描述的条件37,38)的放大16 s rRNA古生菌的基因,产甲烷订单(Methanomicrobiales、Methanobacteriales Methanococcales),和家庭Methanosaetaceae Methanosarcinaceae。我们还利用qPCR目标细菌的16 s rRNA基因(39)和高度保守的甲酰tetrahydrofolate合成酶(FTHFS)基因通过执行SYBR homoacetogens绿色化验,使用前面描述的方法(38]。

2.7。统计分析

使用社会科学统计软件包(SPSS)软件,我们进行皮尔逊的感兴趣的参数变量之间的相关性:甲烷生产,总N和北半球₃- n浓度、关键发酵syntrophs, hydrogenotrophic acetoclastic产甲烷菌识别通过测序分析。这些变量是基于假设NH挑选出来的₃- n会影响微生物群落结构,特别在产甲烷菌,修正为多个比较没有执行。被认为是重要的。

3所示。结果与讨论

3.1。鳕鱼是转化成甲烷生物反应器操作期间尽管北半球₃- n > 2000 mg / L

我们监控总可溶性COD、NH₃- N和总N,甲烷和沼气生产定期利率在启动阶段的产甲烷反应器治疗猪浪费。总结了结果数据1和2和S1,在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/4089684;表S1好的鳕鱼文件质量平衡在四个取样的时间关闭。根据COD去除CH₄,反应器的性能接近pseudo-steady第1周期状态的半连续操作,与大约52%转换。CH₄是沼气,H₂浓度低于检测水平(< 0.5% (v / v)在整个实验。在半连续操作,污水可溶性COD(由相对较小,可生物降解的分子(39)只代表的入渗TCOD或≤L g鳕鱼⁻¹。这种低SCOD浓度意味着短链脂肪酸(包括丙酸、丁酸、乙酸),主要包括SCOD,没有积累,因为他们被微生物代谢导致甲烷产量和生物合成。

图2(一个)显示NH₃- n的增加从mg NH₃- n L⁻¹在批处理操作mg NH₃- n L⁻¹在半连续操作。可溶性总氮的浓度(NH的总和₃NH - N和有机N)平行₃- n和总NH高出约50%₃- n。这增加有机N和NH的释放₃- n表明蛋白质的水解和发酵的动物粪便后增加启动和稳定周期2。图2 (b)表明甲烷生成正持续增加为周期3,尽管水解和发酵的蛋白质稳定。高甲烷生成输入TCOD周期3中是可能的,因为增加的批猪浪费使用周期;输入N没有增加并行输入TCOD因为喂猪的粪便收集不统一整个实验周期。

3.2。古菌和细菌的多样性随NH增加而降低₃- n浓度

表2总结了这两个指标的系数用于分析样品中的多样性。PD-whole-tree基于系统树,使用多样性的分支长度作为衡量;observed-species度量计算所有样本中独特的辣子鸡(40]。古菌和细菌指标都有类似的下降趋势随着时间的推移北半球₃从684毫克NH - n浓度上升₃- n L⁻¹在反应器的启动mg NH₃- n L⁻¹并以批处理操作mg NH₃- n L⁻¹连续操作。这些显著的降低表明选择性富集的微生物NH宽容₃- n。

3.3。Hydrogenotrophic和Acetoclastic产甲烷菌在~ 2000毫克NH丰富₃- n L⁻¹

我们分析了古细菌微生物群落在反应堆启动期间使用高通量测序,以评估如何acetoclastic产甲烷菌(分组在Methanosarcinales)或hydrogenotrophic产甲烷菌(分组Methanobacteriales下,Methanomicrobiales、Methanococcales和E2顺序)是NH宽容₃L - n浓度的~ 2000毫克⁻¹。图3比较培养液中的古细菌社区与社区在批处理和半连续操作。在门Phylotypes Euryarchaeota(即。,Methanomicrobiales, Methanobacteriales, E2 group, and Methanosarcinales) and those of the order pGrfc26 (within Crenarchaeota) [41在半连续操作期间增加mg NH₃- n L⁻¹,而不明phylotypes从38.6下降到1.5%。这些结果证实浓缩在逐渐适应高和total-ammonium浓度增加。

hydrogenotrophic的相对丰度和acetoclastic产甲烷菌增加。这个同意增加甲烷产量,低废水SCOD测量(包括醋酸),也没有检测H₂在半连续操作。图3 (b)显示了8种不同的属hydrogenotrophic产甲烷菌鉴定,包括Methanoculleus,Methanogenium,和Methanobrevibacter。尽管属Methanosaeta是唯一acetoclastic产烷生物由高通量测序,确定其相对丰度从批处理操作的14%上升到25%在半连续操作。相对丰度的增加可能是由于增加的绝对丰度Methanosaeta或减少在其他丰富的表型。qPCR结果(总结在图S2)与图一致3和建议Methanomicrobiales是最丰富的产甲烷菌Methanosaetaceae最后由Methanobacteriales紧随其后。

很可能第一个35 d的批处理操作,与< 1100毫克N-NH₃L⁻¹,提供了一个适应时期acetoclastic产甲烷菌,NH ~ 2000毫克₃- n L⁻¹没有足够高的抑制Methanosaeta,选择第三个周期,相对于其他古生菌。这对应于发现她和Nordberg NH 3000毫克₃- n L⁻¹抑制NH₃-N-acclimatedMethanosaetaspp。18),这个家庭并没有发现在厌氧消化器治疗鸡和3400毫克以上NH废物₃- n L⁻¹(42]。然而,最近的一项研究报告说,北半球₃-N-acclimated Methanosaetaceae种虫害是最丰富的acetoclastic产甲烷菌在实验室规模增加NH厌氧消化器操作₃L - n浓度高达4000毫克⁻¹(43]。

3.4。产乙酸菌发挥了关键作用在甲烷生产NH ~ 2000毫克₃- n L⁻¹

在家庭和最丰富的细菌phylotypes属水平在图进行了总结4。在属级,phylotypes代表生产者的关键短链脂肪酸(如乙酸、丙酸和丁酸)是在暴露于高NH丰富₃- n。这些细菌在面板(b)进行了总结。最丰富phylotypes是(我)Coprococcus,丁酸和acetate-producer Lachnospiraceae家庭(44),(2)Sphaerochaeta螺旋体科内(家庭),醋酸、甲酸和乙醇生产商(45),(3)密螺旋体属,乙酸微生物螺旋体科内的家庭,(iv)不明phylotypes细菌性的,梭菌的订单(反映在紫色和蓝色,职责),已知的微生物可发酵的碳水化合物和蛋白质短链脂肪酸(46- - - - - -48]。

详细说明产乙酸菌,我们使用qPCR量化高度保守的甲酰tetrahydrofolate合成酶(FTHFS)基因homoacetogens [49,50)和reverse-acetogens(有时称为“醋酸syntrophic氧化剂”)(6,21]。图5显示了一个FTHFS基因的稳定增长;量化FTHFS基因增加约两个数量级从实验开始到105年天尽管相对恒定的细菌数量16 s rRNA基因。这表明有不仅增加homoacetogenic细菌的比例也相对增加细菌社区,揭示与增加homoacetogens NH的浓缩₃- n浓度。

低SCOD的污水,没有检测H₂,高数量的acetoclastic hydrogenotrophic产甲烷菌意味着醋酸和H₂有效地回收生产CH₄。homoacetogens的存在意味着醋酸水槽在半连续操作可能是产甲烷途径之一或两者兼而有之。Homoacetogens可以acetogenesis一直在做,在这种情况下acetoclastic乙酸产甲烷菌清除,或一直在做反向acetogenesis, hydrogenotrophic产甲烷菌以H₂和有限公司₂来自醋酸。

Syntrophic acetate-utilizers是由phylotypes属梭状芽胞杆菌在Clostridiaceae家庭。他们的相对丰度从培养液的0.72%增加到5.6%和3.5在批处理和半连续操作,分别。一些菌株(包括c . ultunense(51)和菌株相似c .肉毒,c . sticklandii,c . beijerinckii(52)已报告执行反向acetogenesis产甲烷社区(51,52]。NH高₃- n浓度,这些acetate-utilizers常见在syntrophy hydrogenotrophic产甲烷菌等Methanoculleus(13,53),最丰富的产烷生物识别在我们的反应堆。因此,它是可能的,一些梭状芽胞杆菌种虫害的反应堆造成甲烷生产通过反向acetogenesis加上hydrogenotrophic甲烷生成。

3.5。Syntrophic脂肪酸发酵在~ 2000毫克NH蓬勃发展₃- n L⁻¹

除了syntrophic acetate-utilizers梭状芽胞杆菌中,丙酸和butyrate-fermenters生长在syntrophy hydrogenotrophic产甲烷菌也被发现在4.5%和1.2之间的相对丰度半连续操作。发现phylotypes在属水平SyntrophomonasW22和W5。Syntrophomonas(在Syntrophomonadaceae)丁酸发酵醋酸和H₂在syntrophic协会hydrogenotrophic产甲烷菌和硫酸盐还原22,54]。Cloacamonas,代表属Cloacamonaceae,获得能源的发酵氨基酸和醋酸丙酸发酵,H₂、有限公司₂与H syntrophy₂和醋酸的消费者(55,56]。这个syntroph命名Candidatus Cloacamonas acidaminovorans,虽然它没有种植,其基因组已经被宏基因组(重建55]。比较序列(300个基点)与W22和W5属可用的序列相关(NCBI爆炸)显示,这些属分享相似度高达96%Candidatus c acidaminovorans。因此,有可能Cloacamonaceae和Syntrophomonadaceae导致甲烷生产mg NH₃- n L⁻¹通过发酵丁酸和丙酸H₂、有限公司₂和醋酸syntrophy hydrogenotrophic和acetoclastic产甲烷菌。

3.6。之间的相关分析支持Syntrophies Acetoclastic与产乙酸菌和产甲烷菌Hydrogenotrophic产甲烷菌与Syntrophic脂肪酸发酵

为了理解NH的效果₃N - N和总浓度甲烷生产和微生物群落结构,我们计算皮尔逊的R系数中甲烷生产速度,NH₃N - N和总浓度和发酵,syntrophs, hydrogenotrophic acetoclastic产甲烷菌鉴定在四个时间点治疗猪废物厌氧反应器的操作。参数相关分析的结果在图进行了总结6。Hydrogenotrophic产甲烷菌(Methanoculleus,Methanogenium,Methanobrevibacter,和一位身份不明的属Methanomicrobiales)和acetoclasticMethanosaeta呈正相关,与总氮和NH吗₃- n浓度(在某些情况下,相关性是重要的在0.05级)。这些积极的相关性表明,hydrogenotrophic和acetoclastic产甲烷菌与增加NH蓬勃发展₃- n浓度达到mg NH₃- n L⁻¹当pH值6.9 - -7.6,荷尔蒙替代疗法是35 d。此外,产乙酸菌发酵Coprococcus,Sphaerochaeta中,一位身份不明的属Porphyromonadaceae与NH呈正相关₃- n和几乎所有的产甲烷菌,因此,相关与甲烷生产是正面的。这些正相关性强调产乙酸菌的重要作用NH甲烷产量高₃- n。

身份不明的Clostridiaceae由几个短链脂肪酸生产商,和梭状芽胞杆菌有正相关性acetoclastic吗Methanosaeta,这支持乙酸生成产乙酸菌和homoacetogens。然而,不明Clostridiaceae也显示正相关与身份不明的hydrogenotrophic Methanomicrobiales hydrogenotrophsMethanogenium和Methanoculleus。这支持homoacetogens Clostridiaceae中有可能进行反向acetogenesis。因此,参数分析支持homoacetogens的一个重要的角色,但它不能确定他们是否正向或反向acetogenesis表演。

4所示。结论

成功治疗猪的粪便厌氧反应器运行证明细菌和古细菌社区可以适应总NH稳步增加₃- n浓度达到mg NH₃- n L⁻¹。这两个社区变得不那么多种多样。NH₃- n宽容phylotypes丰富包括(1)acetoclastic产甲烷菌(Methanosaeta);(2)已知正向和反向acetogenesis(梭状芽胞杆菌梭状芽胞杆菌和Clostridiaceae spp。);(3)脂肪酸生产商(Coprococcus和Sphaerochaeta);(4)hydrogenotrophic产甲烷菌(Methanoculleus,Methanobrevibacter,Methanogenium);和(5)syntrophic脂肪酸发酵(Syntrophomonas,梭状芽胞杆菌,Clostridiaceae spp。,可能Cloacamonaceae物种)。我们的研究结果表明,北半球的逐渐增加₃- n浓度导致微生物群落总NH适应高₃浓度与动物粪便的厌氧消化。总结,如图7,acetoclastic和hydrogenotrophic产甲烷菌可以在NH共存₃L - n浓度~ 2000毫克⁻¹通过建立与丙酸和butyrate-fermenters syntrophic关系,以及homoacetogens能够进行正向和反向acetogenesis。

信息披露

任何意见、发现和结论或建议在这种材料中表达作者的,不一定反映美国国家科学基金会。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

索非亚Esquivel-Elizondo和Prathap Parameswaran贡献同样这项工作。

确认

这项工作是由美国国家科学基金会支持部分职业计划(批准号1053939)。

补充材料

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