文摘

古生菌修复尿嘧啶和次黄嘌呤,出现由胞嘧啶脱氨基作用和腺嘌呤,分别由三个酶:Uracil-DNA-glycosylase (UDG,承认尿嘧啶);核酸内切酶V (EndoV承认次黄嘌呤);和核酸内切酶Q (EndoQ),(承认尿嘧啶和次黄嘌呤)。两个古细菌DNA聚合酶,Pol-B Pol-D,抑制了脱氨基基地模板链,这一领域的独特功能。因此,三个修复酶和两个聚合酶显示重叠的特异性为尿嘧啶和次黄嘌呤。这是表明绑定Pol-D primer-templates包含脱氨基基地抑制UDG的活动,EndoV, EndoQ。同样Pol-B几乎完全关闭EndoQ,延续先前的工作证明,Pol-B降低催化UDG和EndoV。Pol-B被观测到一个更强有力的抑制剂的酶而Pol-D。虽然Pol-D直接抑制模板链尿嘧啶,存在Pol-B Pol-D进一步抑制任何剩余的活动,到接近于零的水平。结果是兼容Pol-D作为复制的聚合酶和Pol-B功能主要是监护人防止脱氨基base-induced DNA突变。

1。介绍

胞嘧啶和嘌呤碱基的DNA可以脱氨基尿嘧啶、次黄嘌呤生成U: G和H: T不匹配,,复制后,导致突变后代(1,2]。脱氨基作用,一个简单的水解反应加速了高温(3),预计将在hyperthermophilic尤其突出生物,如许多古生菌。正如所料,古生菌拥有数量的DNA修复系统专用脱氨基基地(4,5]。关键球员包括尿嘧啶和次黄嘌呤DNA糖基化酶,减少N-glycosidic债券连接这些受损的脱氧核糖核苷糖,启动基地切除修复(BER) [4,6,7]。还存在于大多数古生菌酶V (EndoV),削减第二磷酸二酯键的3′端次黄嘌呤,开始选择切除修复(AER) [8- - - - - -10]。最近一种新的核酸内切酶,EndoQ,被发现在古菌的一个子集。这种酶减少尿嘧啶磷酸基因5′,次黄嘌呤,再步行不能的网站,开始修复途径。EndoQ显示活动单-和双链DNA脱氨基基地但步行不能的网站只有有效地减少当出现在双螺旋DNA (11,12]。最近已经证明EndoQ与增殖细胞核抗原(和刺激,13]。除了这些DNA修复酶,古细菌DNA聚合酶识别脱氨基基地拥有独特的能力。古family-B聚合酶(Pol-B)紧密结合尿嘧啶、次黄嘌呤和失速复制当遇到这些基地,防止他们的复制和传播的变异后代(14- - - - - -17]。与脱氨基基地似乎局限于热点聚合酶,未发生与细菌或真核酶(18]。使用酶来源于海床furiosus两个系统/爱尔兰酶之间的相互作用,Uracil-DNA-glycosylase (UDG)和EndoV,和Pol-B调查(19]。聚合酶时一定会尿嘧啶存在于DNA模板链,UDG抑制;同样,聚合酶绑定到次黄嘌呤EndoV放缓。在这两种情况下的最大抑制PCNA是必要的。建议遇到的尿嘧啶/次黄嘌呤在复制过程中聚合酶抑制的误码率/ AER,过程中遇到不合适当这些脱氨基基地单链DNA (19]。除了family-B聚合酶,存在于所有古生菌(20.,21],许多成员这一领域也拥有family-D酶(Pol-D) [20.- - - - - -24]。基因缺失的研究表明,在一些热点,Pol-B是可有可无的,而Pol-D至关重要,这表明后者可能是主复制的聚合酶(25,26]。基于生化证据已经提出,Pol-D可能引发酶行动开始后不久,在后期切换Pol-B变得负责前导链的复制,而Pol-D继续处理后随链(27,28]。最近在体外实验暗示,Pol-D可能负责大部分的基因组复制、与Pol-D Pol-B填充小空隙冈崎片段是接近29日]。Pol-D沿着模板链的发展放缓的尿嘧啶,通过一种机制尚未完全阐明,但明显不同的family-B酶(30.]。最近它已经证明了次黄嘌呤还能抑制Pol-D [31日]。在此发表任何family-B和family-D DNA聚合酶的影响海床furiosusUDG活动,EndoV EndoQ,以及两者之间的相互作用聚合酶,被评估。结果表明,Pol-B强烈抑制所有三个误码率酶,而Pol-D干扰与这些活动更弱。此外,Pol-B取消了uracil-containing剩余活动Pol-D演示模板。这些结果扩展以前的观测和给一个更完整的画卷这些古细菌蛋白质的行为如何脱氨基的存在基地(19]。

2。材料和方法

2.1。Oligodeoxynucleotide和蛋白质制备

Oligodeoxynucleotides取自ATDBio(南安普顿,英国)和脱盐和HPLC-purified。的净化海床furiosus蛋白质前所述了合适的质粒被用来直接超表达大肠杆菌)以下:Pol-B、野生型和3′5′核酸外切酶-变体D215A (32);Pol-D,野生型(大、小亚基组成),和3′5′核酸外切酶缺陷变异的突变H441A小亚基(30);PCNA (19);UDG (19);EndoV (9);和EndoQ (11)。Primer-templates准备通过混合两个长串(比率荧光oligodeoxynucleotide: nonfluorescent oligodeoxynucleotide1:在50 mM Tris-HCl pH值1.25)8,100毫米氯化钾,加热在90°C之前缓慢冷却到室温。与会primer-templates存储冻结在−20°C。测量值primer-templates使用实时PCR仪器(Corbett rg - 6000)。25μL适当的DNA(200海里)的50 mM Tris-HCl pH值8,100毫米氯化钾,添加到25岁μQuant-iT L 1: 200稀释™PicoGreen(表达载体)。PicoGreen的股票的解决方案,提供溶解在二甲亚砜,稀释使用50 mM Tris-HCl pH值8,100毫米氯化钾。由此产生的温度50μL的解决方案是增加从30到95°C,超过30分钟价值观决定使用PicoGreen荧光下降作为DNA链融化了。

2.2。抑制酶Pol-B和Pol-D的误码率

任何抑制影响存在的DNA polymerase-B polymerase-D EndoQ活动,EndoV, UDG于100年调查了μL(50毫米Tris-HCl pH值100毫米氯化钾,MgCl 1毫米德勤,1毫米₂,0.01% (v / v)渐变20时50°C。primer-template浓度10纳米以下序列使用(十六进制= hexachlorofluorescein和X =胸苷(控制)、尿嘧啶、次黄嘌呤):5′-HEX-GGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGC-3′3′-- - - - - -- - - - - -- - - - - --CCCCTAGGAGATCTCAGCTGGACGACCXTTCGTTCGAACAGAGTACCTGGCTAT-5′Pol-B和PCNA的水平(使用时)200 nM和反应是由添加EndoQ / EndoV或UDG(200海里)。为实验和EndoQ EndoV 20μL能整除的是在适当的时间(在数据删除1和2)和反应停止添加同等体积的95%甲酰胺含有10毫米EDTA连同大量过剩的“竞争对手”oligodeoxynucleotide(双工的竞争对手能隔绝nonfluorescent组件,确保荧光DNA运行着一长串(16])。淬火样品在95°C加热10分钟和冰迅速冷却。25μL冷却的样品应用于17%变性聚丙烯酰胺凝胶(8 M尿素)和运行4瓦为2.5小时。凝胶分析使用一个台风FLA9500成像仪与ImageQuant软件(通用电气医疗集团)。UDG削减尿嘧啶的糖苷键,需要额外的治疗在碱性条件下开发链。因此与UDG添加氢氧化钠的反应是停止(最终浓度0.1米)其次是加热15分钟的95°C。样品被蒸发干燥使用SpeedVac和重新溶解在20μL反应缓冲+ 20μL甲酰胺/ EDTA /“竞争对手”之前分析EndoQ / EndoV。

2.3。抑制Pol-D Pol-B

调查任何抑制DNA的DNA polymerase-D polymerase-B primer-template扩展进行。100年进行的实验μL(50毫米Tris-HCl pH值100毫米氯化钾,1毫米德勤,1毫米,200μ4米的核苷酸和0.01% (v / v)渐变20时50°C。primer-template浓度20 nM以下序列,哪些地方尿嘧啶4基地primer-template结之前,使用(Cy5 = cyanine-5):5′-Cy5-CCCACTGCAATGGTAAGTAACGTTACGAGATTCGAGTCATGCCAGAATTGCAGGA-3′3′-- - - - - -- - - - - -- - - - - --GGGTGACGTTACCATTCATTGCAATGCTCTAAGCTCAGTACGGTCTTAACGTCCTGGA (T / U) AGGAAGAGATCAGATCAATTTGGGTCAATAGGCTTACTGACTGGACGACCC-5′反应是由添加聚合酶(200海里)(当Pol-B和Pol-D一起使用的同时添加了蛋白质和运行时间图所示3)。终止反应20μL整除添加到同等体积的95%甲酰胺含有10毫米EDTA和混合物加热在95°C前10分钟快速冷却在冰上。25μL冷却的样品应用于17%变性聚丙烯酰胺凝胶(8 M尿素)和运行4瓦为2.5小时。这种凝胶是由循环水加热到50°C,升高温度确保分离的两条线。上面给出的凝胶被分析为EndoQ / EndoV / UDG实验。

3所示。结果

3.1。抑制EndoQ Pol-B

尽管众所周知,Pol-B抑制UDG和EndoV活动(19),EndoQ尚未发现这些实验进行时。任何影响Pol-B EndoQ减少DNA的能力包含尿嘧啶或次黄嘌呤使用评估使用化学合成primer-template(图1)。这种基质,包括24-base引物退火54-base模板,定位受损的基地+ 4的位置在模板,Pol-B强烈互动的网站与尿嘧啶和次黄嘌呤(14]。所有的调查,这些thermophile-derived酶,进行了50°C。然而,primer-template证明的°C缓冲条件下使用(数据未显示),因此,主要存在于双链形式。Pol-B导数禁用校对工作的核酸外切酶活性,D215A,用于实验32),涉及primer-templates长孵化项目相对高浓度的聚合酶核苷酸的缺失。野生型,精彩⁺,变异退化的荧光观察模板由于校对工作活动,混淆的结果。这种房屋⁻D215A变种不妥协脱氨基基绑定(14,15]。当uracil-containing primer-template与EndoQ孵化,完全水解后观察到的(图1小时1(一))。次黄嘌呤的大约75%的衬底之间被摧毁(图1和图2小时1 (b))。重复这些实验在Pol-B面前显示,尿嘧啶和次黄嘌呤基板完全稳定2小时(数字1(一)和1 (b))。显然存在Pol-B几乎完全破坏的活动EndoQ尿嘧啶和次黄嘌呤;如此深刻的是几乎没有额外的空间的抑制提高增殖细胞核抗原(数据的存在1(一)和1 (b))。扫描这些凝胶更明显地照亮Pol-B提供的巨大程度的屏蔽(图1 (c))。

3.2。抑制UDG、EndoV EndoQ Pol-D

复制通过古DNA polymerase-D时抑制尿嘧啶、次黄嘌呤在模板链,表明这种酶,像Pol-B,能够明确承认脱氨基基地(30.,31日]。因此,我们想知道如果Pol-D干扰DNA修复酶这一过程这两个基地,以类似的方式Pol-B介导抑制EndoQ, UDG, EndoV [19]。primer-template这些调查,采用以上的Pol-B实验,把尿嘧啶/次黄嘌呤+ 4,使用。然而,比Pol-B Pol-D更宽容对受损基础位置,被尿嘧啶抑制100基地primer-template结(之前30.]。影响Pol-D的存在对UDG切除修复酶的活动基地,EndoV, EndoQ如图2。这里凝胶显示的主要数据连同扫描凝胶,给衬底primer-template剩余的数量随着时间的推移,。再次Pol-D变体缺乏校对工作(H445A)使用核酸外切酶活动(30.]。四个组合测试的结果非常相似;UDG /尿嘧啶(图2(一个)),EndoV /次黄嘌呤(图2 (b)),EndoQ /尿嘧啶(图2 (c)),和EndoQ /次黄嘌呤(图2 (d))。在每个实例包含Pol-D放缓的速度修复酶作用于基质的可测量的量。图中给出的调查2,额外的实验探索细胞核抗原的影响,添加Pol-D一起进行。然而,任何增殖细胞核抗原很边缘,这种蛋白质的影响几乎没有提高Pol-D单独提供的屏蔽。这与早些时候结果看到Pol-B和UDG / EndoV;这里PCNA大大增强了所提供的保护,聚合酶(19]。尽管Pol-D抑制UDG、EndoV EndoQ,很明显,它提供保护比Pol-B少得多。这是比较明显的影响Pol-B和Pol-D EndoQ活动本出版物中描述;Pol-B几乎完全抑制EndoQ;Pol-D仅仅减缓酶(数据1,2 (c),2 (d))。UDG EndoV表现相似;早前发表了深刻的抑制Pol-B [19),对比更温和的影响Pol-D(数据2(一个)和2 (b))。

3.3。抑制Pol-D Pol-B

DNA的复制和古细菌Pol-B Pol-D受到模板链尿嘧啶的存在,与基础表演更有说服力地Pol-B [14- - - - - -17,30.]。鉴于UDG的强烈抑制,EndoV EndoQ Pol-B活动,我们想知道如果Pol-B可能进一步延迟,已经阻碍了,通过uracil-containing Pol-D模板的过程。控制primer-template,缺乏尿嘧啶,有效地延长了Pol-B和Pol-D,与这两种酶的混合物和单个组件(图的行为相似3(一个))。与primer-template有单一的尿嘧啶四个基地primer-template结之前,Pol-D能够产生完全扩展产品(图3 (b))。正如预期的那样,不过,uracil-containing DNA的复制速度慢于观察和控制。相比之下Pol-B完全无法复制uracil-bearing DNA,强调更强大的抑制尿嘧啶对这种酶。Pol-D和Pol-B的混合物,没有聚合是观察,清楚地说明Pol-B抑制任何剩余的活动,Pol-D显示对尿嘧啶存在(图的模板3 (b))。

4所示。讨论

修复酶,作用于尿嘧啶、次黄嘌呤DNA聚合酶是常见的所有生物,但不寻常的是,古细菌聚合酶B和D家庭还能感觉脱氨基基地(14- - - - - -17,30.,31日]。这种重叠在底物特异性酶相互作用提出了质疑和早些时候Pol-B观察抑制UDG(尿嘧啶)和EndoV(次黄嘌呤),与PCNA增强效应(19]。这份出版物增加我们的知识关于古细菌数量/爱尔兰酶和聚合酶相互作用。结果表明,Pol-B强烈抑制活性的EndoQ尿嘧啶和次黄嘌呤,抑制如此深刻的PCNA几乎没有机会进一步增强作用。我们延长观测Pol-D,证明这里UDG缓慢,EndoV,程度较轻,EndoQ。一般Pol-D似乎是一个较弱的基本切除修复酶的抑制剂Pol-B相比,至少UDG和EndoV PCNA扮演小额外的角色。终于看到Pol-B几乎完全妨碍Pol-D沿着uracil-containing模板的进展。Pol-D本身就是直接抑制DNA但Pol-B的存在强烈的尿嘧啶强化脱氨基基础的影响。

最有可能的是深刻的抑制UDG, EndoV, EndoQ, Pol-D起源于紧和特定绑定的Pol-B脱氨基基地,强烈盾牌DNA从其他酶的作用。这些酶复合物之间没有检测到高吞吐量的屏幕,建议直接作用的蛋白质相互作用抑制模式观察(33,34]。之前它已经被证明Pol-B结合uracil-containing primer-templates值约1海里[14),次黄嘌呤的1.5 - -4.5倍的弱相互作用(35]。控制primer-templates绑定少1000倍强(14,35),这表明大部分的绑定是通过强相互作用介导脱氨基基地。Pol-B 200纳米水平的使用在这些研究中,充分结合DNA基质。的结构Pol-B绑定尿嘧啶和次黄嘌呤,它证实了深刻的交互与这些基地,已确定(15,17),它的抑制作用可以合理化。考虑到DNA模板链,有效Pol-B盾牌脱氨基糖苷键的基地UDG(目标),邻近的5′磷酸EndoQ(目标),和磷酸二酯两个位置3′方向EndoV(目标)。闭塞的5′磷酸,高度保守的酪氨酸(15),尤为明显,解释EndoQ的非常深刻的抑制。或者,这可能只是出现更高浓度的Pol-B(200海里)比在前面这里使用调查与UDG EndoV(100海里)。的底漆,Pol-B切断最后deoxynucleotide的3′-哦,Pol-D的起始点。

Pol-D还能抑制UDG、EndoV EndoQ但明显比Pol-B较小程度上。早前的一项研究表明,Pol-D绑定primer-templates包含尿嘧啶大约5海里,再推断Pol-D水平的200海里应该足够的完全饱和primer-templates (30)。然而,有一个关键区别Pol-B的礼仪和Pol-D与脱氨基基地。与Pol-B控件绑定1000倍更弱,兼容强相互作用与脱氨基基地。与Pol-D控件绑定少只有2倍(30),建议多绑定的一般特征的DNA只有边际附加与脱氨基的交互的基础。这个特性都解释了为什么Pol-D促成扩展不太敏感的脱氨基的存在基础和符合抑制低的误码率/爱尔兰酶与Pol-D和Pol-B。不幸的是,没有结构用于Pol-D所以抑制误码率酶的性质不能合理化Pol-B一样的程度。大概虽然简单的位阻,尽管不太明显比观察Pol-B,构成Pol-D介导抑制蛋白质的误码率。

总DNA之间的相互作用脱氨基基地,古细菌DNA聚合酶,和基本切除修复酶总结在图4。基于这些观察我们建议Pol-D replisome存在,负责大部分的新创合成的引领和滞后链(29日]。Pol-B不作为复制酶但服务主要是为了防止脱氨基base-induced突变。类似的场景最近还提出基于与PCNA [EndoQ之间的相互作用13]。履行这样的角色Pol-B可能replisome组件,定位前Pol-D准备拦截尿嘧啶和次黄嘌呤。然而,Pol-B似乎让一些直接与replisome组件交互33,34]。更有可能Pol-B,相对丰富的古细菌蛋白(26),结合这些基地直接从解决方案呈现单链复制解旋酶的作用。减缓Pol-D在它接近这些基地将增加Pol-B绑定Pol-D到来之前的机会。一旦绑定到尿嘧啶、次黄嘌呤Pol-B深刻地抑制促Pol-D基因组复制、停滞的复制叉,允许回归到一个“chicken-foot”结构(5]。这种策略暂时还原脱氨基基地原有的双链的位置/爱尔兰允许准确的误码率。排除系统/爱尔兰从脱氨基酶基地单链模板将购买时间叉回归,通过防止长串修复,避免DNA链断开和永久分离目的。数量/爱尔兰在任何情况下,包括这里描述,需要完成的数量有限的DNA合成修复过程和在这里的聚合酶活动Pol-B可能发挥作用。这样一个简单的尿嘧啶/次黄嘌呤结合蛋白抑制复制和修复将是一个低效率的解决方案相比,聚合酶有额外的功能。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持英国BBSRC(批准号BB / K005359/1)和由日本下边了(批准号26242075)。Sonoko Ishino部分发酵研究所的支持下,日本大阪(IFO)。