一种新颖的高耐热性的多功能Beta-Glycosidase CrenarchaeonAcidilobus saccharovorans

文摘

我们表达了假定的β牛乳糖Asac_1390从hyperthermophilic crenarchaeonAcidilobus saccharovorans在大肠杆菌和纯化的重组酶。Asac_1390由490氨基酸残基,显示高序列相似性家庭1糖苷水解酶在各种高温Crenarchaeota。观察到的最大活动pH值6.0和93°C。酶的半衰期为90°C约7个小时。Asac_1390显示高公差葡萄糖和展品对纤维二糖和各种芳基糖甙水解活动。的水解活性p-nitrophenyl (pNP)基质后订单pNP型-β-D-galactopyranoside U(328毫克⁻¹),pNP型-β-D-glucopyranoside U(246毫克⁻¹),pNP型-β-D-xylopyranoside U(72毫克⁻¹),pNP型-β-D-mannopyranoside U(28毫克⁻¹)。因此,酶实际上是一个多功能β糖苷酶。因此,利用Asac_1390可能有助于促进高效降解木质纤维素的生物质,帮助提高生物转化过程。

1。介绍

木质生物质,主要由纤维素、半纤维素和木质素,是地球上最丰富的可再生资源,其降解为可溶性糖是一个关键问题biobased化学品和生物燃料的生产。纤维素和半纤维素由多糖,由于他们的固执,这些底物的酶转化成单糖需要许多步骤。

能够降解纤维素的微生物具有三种类型的酶协同作用[1,2):(1)内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4), (2) exoglucanases也称为cellobiohydrolases (EC 3.2.1.91),和(3)β-glucosidases (EC 3.2.1.21)。内切葡聚糖酶随机分裂的内部债券纤维素材料,发布各种长度的寡糖,从而产生新的多糖链的末端。cellobiohydrolases行为逐渐在这些链结束生成短cellooligosaccharides或纤维二糖。β-Glucosidases水解cellooligosaccharides葡萄糖和纤维二糖单位(3,4]。半纤维素分解成可溶性木糖或其他类型的单糖通过半纤维素酶,如endo-1 4 -β木聚糖酶(EC 3.2.1.8),β木糖苷酶(EC 3.2.1.37),α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) endo-1 4 -β-mannanase (EC 3.2.1.78),β甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25),β牛乳糖(EC 3.2.1.23) [5]。

的存在β-glucosidases纤维素水解过程中是非常重要的,因为他们执行病原反应一步防止纤维二糖的积累,抑制的活动大多数endo - exoglucanases [6]。此外,大多数β-glucosidases由葡萄糖抑制(7]。因此,β-glucosidases,特定的活动和葡萄糖耐量,高可以提高纤维素酶复合物的效率。

耐热性的酶木质纤维素降解过程中有几个优势,因为它们能够承受的高温反应条件,并允许细长的水解时间由于更高的稳定性和降低污染的风险。高温促进高这些酶的活动,增加底物的溶解度在水相。尽管一些耐热性的β-glucosidases已确定(8- - - - - -16),只有几个例子glucose-tolerant耐热性的β-glucosidases [13,14]。

Acidilobus saccharovorans345 - 116705 (DSM)是一种厌氧、organotrophic thermoacidophilic crenarchaeon pH值的范围从2.5到5.8(最佳pH值3.5 - 4)和温度范围从60到90°C(最佳80到85°C),隔绝的酸性温泉Uzon火山口,俄罗斯堪察加半岛(17]。完整的基因组答:saccharovorans测序(18),和额外的基因的存在,细胞内糖苷水解酶相关的增长答:saccharovorans在碳水化合物。特别是基因Asac_1390编码假定的β牛乳糖(EC 3.2.1.23)被确认18]。在本文中,我们报告克隆,表达,这种酶的生化特性出现多功能β糖苷酶。

2。材料和方法

2.1。克隆答:saccharovorans基因Asac_1390

的β牛乳糖基因Asac_1390放大答:saccharovorans基因组DNA通过PCR引物F2_NcoI (TTCCATGGCAGTTACCTTCCCAAA)和R2_BglII (5′ttAGATCTGGATCTACCAGGCGCT-3′);PCR产品消化NcoI和BglII插入pQE60(试剂盒)NcoI和BglII网站,质粒pQE60_Asac1390屈服。

2.2。表达和纯化的重组酶Asac_1390

质粒pQE60_Asac1390变成了大肠杆菌应变DLT1270携带质粒pRARE2 (Novagen)。重组菌株生长在37°C Luria-Bertani介质(磅)补充与氨苄青霉素和诱导表达重组木聚糖酶通过添加异丙基-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)在OD的最终浓度1.0毫米_600年大约0.6和孵化进一步在37°C为20小时。种植细胞被离心收获5000 g在4°C为20分钟,洗0.1钠磷酸盐缓冲剂,pH值7.0,resuspended 20毫升的同一个缓冲区和溶菌酶(1毫克/毫升)。这些细胞被孵化30分钟在4°C,然后声波降解法而中断。不溶性残渣被在5000 g离心20分钟在4°C。上层清液的培养在水浴30分钟在75°C,然后30分钟在85°C(双重热处理)和冰上冷却。变性蛋白质的大肠杆菌在12000克被离心20分钟在4°C。样本的蛋白质渗出对25毫米磷酸盐缓冲剂(pH值7.0)在4°C 3 h。

纯化蛋白的纯度检测sds - page(10%)和它的浓度是由布拉德福德方法使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准。

2.3。化验的β牛乳糖活动

的β牛乳糖活动进行了分析使用o-nitrophenyl -β-D-galactopyranoside (oNPGal)作为底物后修改怯懦的方法(19]。1.076毫升的基质溶液(0.7毫克/毫升oNPGal 0.1钠磷酸盐缓冲剂,pH值7.0)5分钟preincubated在适当的温度下,反应是由酶的添加0.05毫升(0.08μ克)。0.375毫升的反应是停止冷1 M Na₂有限公司₃解决方案。一个空白,包含0.05毫升的0.1米磷酸钠缓冲区,而不是酶解,被用来纠正oNPGal的热水解。发布的数量o硝基酚测定420海里。一个单位(U)的酶活性被定义为所需的酶解放1μ摩尔的o硝基酚在描述条件下每分钟。

2.4。重组酶的生化特性Asac_1390

检查pH值和温度的影响β牛乳糖活动,pH值变化从3.0到8.0在80°C使用0.1米醋酸缓冲(pH值3.0 - 5.0)和0.1米钠磷酸盐缓冲剂(pH值6.0到8.0)。同样的,β牛乳糖试验是在不同温度(50 - 100°C)和pH值7.0确定Asac_1390活动的最佳温度。

Asac_1390的耐热性是评估preincubating酶在90°C钠磷酸盐缓冲剂,pH值7.0。样本收集所需的时间间隔和剩余的化验β牛乳糖活动0.1钠磷酸盐缓冲剂(pH值7.0)在50°C。

使用oNPGal Asac_1390决心的底物特异性,p-nitrophenyl -β-D-galactopyranoside (pNPGal),p-nitrophenyl -β-D-glucopyranoside (pNPGlu),p-nitrophenyl -β-D-xylopyranoside (pNPXyl)和pNP型-β-D-mannopyranoside (pNPMan)。2.21毫米的反应进行每个衬底0.1钠磷酸盐缓冲剂(pH值7.0)在93°C和活动以释放pNP型(405 nm)和废纸(420海里)。

纤维二糖作为底物时0.5% (w / v)的葡萄糖释放量决定了蔗糖、葡萄糖、果糖工具包(R-Biopharm AG)、德国)根据制造商的协议。0.1米的纤维二糖水解反应进行了钠磷酸盐缓冲剂(pH值6.0)在50°C。在这个试验,1 U的活动被定义为所需的酶的释放1μ在测试条件下葡萄糖的摩尔每分钟。

各种浓度的oNPGal, pNPGal、pNPGlu pNPXyl, pNPMan(从0.277到2.21毫米oNPGal, pNPGal, pNPGlu,从0.074到1.23毫米和pNPMan pNPXyl) Asac_1390用于确定动力学参数。反应进行的0.1钠磷酸盐缓冲剂(pH值7.0)在93°C。酶动力学参数,(毫米)(U /毫克),(c⁻¹),,从Hanes-Woolf块Michaelis-Menten方程计算。

葡萄糖的影响β牛乳糖活动进行了葡萄糖的浓度从10到100毫米使用2.21毫米oNPGal在80°C 0.1磷酸盐缓冲剂(pH值7.0)。相对活动被定义为相对价值的最大活动没有葡萄糖。抑制的类型和对葡萄糖抑制常数测定拟合Cornish-Bowden和迪克逊情节(20.使用不同浓度的葡萄糖(从0到400毫米)与不同浓度的oNPGal(从0.05到0.5毫米)作为衬底。

3所示。结果与讨论

3.1。酶基因克隆和表达

氨基酸序列的一个假定的β牛乳糖Asac_1390从答:saccharovorans表现出54 - 71%身份与糖苷水解酶的嗜热古菌属Caldivirga,硫化叶菌,Vulcanisaeta,Thermoproteus,Ignisphaera,热原体属,Thermosphaera,Picrophilus,Thermococcus,海床,标注为β-galactosidases或β-glucosidases。Blastp搜索Asac_1390表明,氨基酸序列的残留1-46包含签名的糖基水解酶(GH)家庭1 (Pfam00232)。特别是Asac_1390 63%是相同的β糖苷酶从硫化叶菌acidocaldarius发现对展览活动β糖甙,β-galactosides,β-fucosides [15]。结果表明,这种酶可以广泛的底物特异性。Asac_1390没有预测分泌信号表明这种酶的胞内行动。

Asac_1390基因的序列一样报道基因库(CP001742)克隆和表达大肠杆菌。重组酶表达的产量约30%的总可溶性蛋白并纯化从原油大肠杆菌通过两步热处理提取的纯度在95%以上。纯化蛋白出现在sds - page分析作为一个乐队的分子质量大约55 kDa(图1),符合的计算值55521 kDa基于Asac_1390 490氨基酸残基。

3.2。pH值和温度对酶活性的影响

的β牛乳糖活动检查/ pH范围为3.0到8.0在80°C。观察最大活动在钠磷酸盐缓冲剂的pH值6.0。在pH值为5.0和7.0,活动是大约70%的最大(图2(一个))。温度对酶活性的影响研究在0.1钠磷酸盐缓冲剂,pH值7.0(图2 (b))。最大的活动被记录在93°C;在100°C的温度最大的活动大约是80%。

Asac_1390的热稳定性是研究通过测量活动随着时间的推移在90°C。样本撤回在不同的时间间隔和化验0.1钠磷酸盐缓冲剂(pH值7.0)20分钟(图的50°C3)。Asac_1390酶似乎极耐热性的;酶的半衰期为90°C约7个小时。

这些值的温度和pH Asac_1390是典型的最适条件β-galactosidases和β-glucosidases hyperthermophilic古生菌,包括酶硫化叶菌solfataricus(95°C和pH值6.5,21]),海床furiosus(100°C和pH值5.0,22]),美国acidocaldarius(90°C和pH值5.5,15)),Thermococcus kodakarensis(100°C和pH值6.5,23])。热失活,Asac_1390是其中一个最耐热性的β-glycosidases 7 h的半衰期在90°C。它显示出更高的稳定性β-glycosidases从美国solfataricus和美国acidocaldarius比,但较低的稳定p . furiosus(85 h在100°C)t . kodakaraensis在90°C (18 h)。

3.3。葡萄糖对Asac_1390的活性的影响

葡萄糖的影响β牛乳糖活动oNPGal水解研究在不同浓度的葡萄糖。添加10、50和100毫米的糖Asac_1390的活动减少到80%,76%,和65%,分别。因此,葡萄糖水解活性几乎没有影响。

Cornish-Bowden和迪克逊情节展示了一种混合型抑制Asac_1390的葡萄糖。EIS复杂的离解常数(毫米)明显低于EI复杂(毫米)。葡萄糖是报道的竞争性抑制剂β糖苷酶从美国solfataricus(21)的抑制常数96毫米,而它几乎没有影响β葡糖苷酶从海床furiosus一个明显的300毫米的22]。

3.4。底物特异性和Asac_1390动力学

的水解活性Asac_1390研究各种芳基苷(表1)。pNP型基质的活动观察pNPGal最高,其次是pNPGlu和pNPXyl。pNPMan的水解是最有效的。酶的活性为pNPGal oNPGal是一样的,表明酶同样有效地水解β1 - 2,β1 - 4的联系。Michaelis-Menten常数(),营业额数字()和催化效率(oNPGal, pNPGal、pNPGlu pNPXyl, pNPMan展示在表2。的价值为获得pNPGlu远远高于pNPGal,表明Asac_1390不是β牛乳糖注释,而是一个β葡糖苷酶。

Asac_1390酶具有较高的具体β牛乳糖和β葡糖苷酶活性(246 - 328 mg⁻¹在不同的底物),高亲和力与衬底(毫米pNPGlu)和高催化活性(年代⁻¹毫米⁻¹pNPGlu)。这些值中最高的古细菌这类的酶。一些更积极的β-galactosidases从嗜热细菌是已知的,但通常他们不耐热性的(例如,30400 U毫克⁻¹和半衰期为1.5 h在90°C的β葡糖苷酶Thermotoga petrophila(24])。

考虑到一些微生物gh的家庭β为纤维二糖-glycosidases比活度较低,我们调查的水解活性Asac_1390自然β葡糖苷酶底物。的观察活动Asac_1390纤维二糖和pNPGlu在50°C和pH值6.0 68 U毫克⁻¹U和53毫克⁻¹,分别。通常,glucose-tolerant微生物β-glucosidases大大降低特定的活动比pNPGlu纤维二糖,而已知的异常(例如,β葡糖苷酶从Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)不如Asac_1390耐热性的14]。

的广泛的底物特异性Asac_1390这种酶是一个有趣的和重要的特征。尽管最初注释β牛乳糖,这对纤维二糖水解酶展览活动和各种芳基糖甙:高活动pNPGal pNPGlu,跟着pNPXyl和pNPMan。这种广泛的底物特异性β-glycosidases已知在古生菌(25),包括美国acidocaldarius和美国solfataricus(15,26]。最近的分析确定三维结构Asac_1390 [27)将有助于揭示分子特性定义酶的底物特异性。

多功能性Asac_1390使得它非常有前途的应用酶法水解木质纤维素生物质。β-Xylosidases和β-glucosidases负责的最后步骤水解木聚糖和纤维素:乳沟的xylobiose木糖(28)对葡萄糖和纤维二糖(1]。的活动β甘露糖苷酶也很有用因为这种酶参与的生产可发酵糖hemicellulosic材料的另一个组件,甘露聚糖(29日]。例如,木霉属reesei是一个著名的cellulase-overproducing丝状真菌分泌几个纤维素分解酶。然而,β葡糖苷酶的活动t . reesei部分mycelium-bound显然限制了酶性能在商业t . reesei准备工作(30.]。补充的酶产生的复杂t . reesei与高度活跃β葡糖苷酶,也表现出β木糖苷酶,β甘露糖苷酶,β牛乳糖水解活动,可以提高效率的处理木质纤维素生物质。Asac_1390特别适合这些目的由于其抗抑制的主要反应产物葡萄糖。

4所示。结论

在这项研究中,我们为特征的表达和耐热性的重组糖基水解酶Asac_1390答:saccharovorans。这种酶最佳活跃在高温(93°C)和pH值6.0和高度耐热性的。Asac_1390是多功能的β糖苷酶的展示活动β葡糖苷酶,β牛乳糖,β木糖苷酶,β甘露糖苷酶。广泛的底物特异性和电阻来抑制葡萄糖使新的应用程序在酶促降解木质纤维素的酶有前途的材料。

信息披露

瓦迪姆博士的礼物地址m . Gumerov中欧理工学院,马萨里克大学,捷克布尔诺。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持的项目“分子和细胞生物学”的俄罗斯科学院和教育部和科学俄罗斯联邦(项目16.512.11.2234和RFMEFI57514X0001)。

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