用气相色谱-质谱和核磁共振表征Crenarchaeota的脂肪酸

文摘

脂质组成的浓缩isoprenyl单元连接到甘油醚联系骨干的古生菌的特点。数据表明,与线性烃链脂肪酸存在于一些古生菌已经出现了几十年。然而,缺乏基因和生化代谢机制的证据合成和降解所需脂肪酸已经离开了球场不清楚这潜在的重要生化方面。因为脂质能量货币和细胞信号分子,它们的存在对理解古古菌是重要的生物学。最近的一次大规模的生物信息学分析重燃的辩论中脂肪酸的重要性古生菌通过遗传证据所需的酶的合成代谢和分解代谢的脂肪酸代谢在古域。在这里,我们现在直接生化证据从气相色谱分析-质谱法(gc - ms)和核磁共振(NMR)谱中脂肪酸的存在两个Crenarchaeota的成员,硫化叶菌solfataricus和Ignicoccus hospitalis。这是第一个报告提供生化数据存在的脂肪酸在这些Crenarchaeota,开放新的讨论能量平衡和潜在的新发现的酶耐热性的行业。

1。介绍

脂肪酸有两种截然不同的生物作用。一方面,他们是能源丰富的分子,另一方面,他们发挥了重要作用,膜的结构组件的细菌和真核细胞(1- - - - - -6]。最简化形式的碳,饱和脂肪酸高能分子,但足够稳定存储长时间用最小的退化(2,4- - - - - -6]。脂肪酸进行β氧化,将长链脂肪酸转化为碳acyl-coenzyme(乙酰辅酶A)分子,然后用于能源生产的柠檬酸循环(7,8]。脂肪酸也是原核和真核细胞的膜组件,起着重要的作用在细胞结构和完整性。

古生菌的发现生活在1970年代早期的第三域显示一个新类的脂质类异戊二烯(半个9- - - - - -11]。这些类异戊二烯脂质有20 (archaeol)或40 (caldarchaeol)碳通常为一个循环分子(图有关1)[12]。而不是线性碳链和大多数的这些存在于原核和真核细胞,古细菌脂质是支每四碳,用一个甲基与每一个碳原子。古细菌脂质也有不同的连杆甘油,拥有一个醚键而不是一个酯键,因此也称为脂肪醚脂质(12]。醚键的稳定性的关键这些油脂在高温环境下的许多第一古细菌生物被孤立和特征。这些脂肪醚联系随后发现存在于植物,共价结合叶绿素,组件的血小板激活因子在哺乳动物13- - - - - -15]。Ether-linked脂质可以组装一个脂双分子层与两个archaeol分子或环化形成四醚脂质有两个甘油分子组成整个脂质膜(12,16]。两个链的链接也对碳的位置不同甘油支架两个链链接:古细菌脂质有碳链连接到1号和2号位置,而原核或真核脂质有链与第二和第三位置的甘油骨干(图1)[3,17]。

直到最近,人们认为大多数古生菌拥有只ether-linked(脂肪醇)脂质。醚键具有更大的稳定性比一个酯键,在高温和机械的蛋白质合成和分解脂肪酸未被确认的18- - - - - -20.]。的研究hyperthermophilic euryarchaeon海床furiosus确定18脂肪酸,包括饱和、不饱和,二元羧酸脂肪酸(20.]。然而,一般在热点支持这一发现广泛的基因组注释的形式现在才开始变得可用。近70古生物体基因组分析揭示了基因序列类似编码能够进行脂肪酸代谢的酶在细菌和真核生物21]。使用细菌β氧化模型,据透露,四个脂肪酸代谢需要的酶,和随后的搜索的热点使用齿轮基因组数据库显示基因编码酶β在古细菌生物氧化。两种生物的基因组分析Dibrova et al。(Ignicoccus hospitalis和硫化叶菌solfataricus)以前在功能基因组学研究水平,为理解古细菌生物学模型极端微生物和对压力的反应21- - - - - -25]。即hospitalis感兴趣的一直因其简约基因组及其不寻常的与另一个archaeon互动,Nanoarchaeum equitans(24- - - - - -28]。假定美国solfataricus包含多个酶为每个步骤所必需的脂肪酸的新陈代谢,使脂肪酸这archaeon一个极好的目标分析。另一方面,简约的基因组即hospitalis被预测为脂肪酸缺乏一些必要的机械β氧化,基因编码酶进行分解的三个步骤,但缺乏预测同系物的acyl-coenzyme发起的(CoA)脱氢酶β氧化(21]。Dibrova等人推测,一个遥远的相同器官酰coa脱氢酶(ACD)可能引发反应的进行即hospitalis,进一步说明该基因是其他近端β氧化基因(21]。此外,据报道,扬等人即hospitalis可以为能源、醋酸coutilize提供证据表明,脂肪酸的分解代谢可以作为替代能源(29日]。然而,作者无法确认如果醋酸在脂肪酸代谢过程中发挥作用[21]。与基因证据表明酶的存在所必需的脂肪酸代谢,我们着手调查在两个古细菌生物使用他们的存在在体外生化方法。

在这项研究中,结合气体色谱与质谱(gc - ms)和解决方案使用核磁共振光谱(NMR)分析的脂肪酸含量两个hyperthermophilic古生物体。生物都是门的成员Crenarchaeota但不同于另一个美国solfataricus长耗氧,而即hospitalis是一个严格的厌氧生物生活在一个高度减少环境中,这将表明,脂肪酸β氧化是一个相对昂贵的精力充沛的承诺为这个有机体。然而,的过程β氧化还原环境中可能考虑到等超嗜热菌Archaeoglobus fulgidus一些脂肪酸β与硫酸盐还原(氧化30.]。脂肪酸的存在被证实即hospitalis和美国solfataricus,提供新的见解热点生物学和能量的形式如何脂肪酸可能是存储和用于这些微生物。确认这些古细菌生物含有脂肪酸表明小说架构支持,古生菌的脂肪酸代谢和基因对生物技术有一定的影响。

2。材料和方法

2.1。材料

购买作为高效液相色谱检测代谢物的所有溶剂萃取品位,包括甲醇、丙酮、己烷和EMD化工有限公司(Gibbstown,新泽西),并从Avantor氯仿(中心山谷,PA)。男朋友₃在甲醇(Supelco 33020 - u)衍生化的脂肪酸从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州)。的混合脂肪酸标准(" GLC 538)用于gc - ms和NMR分析从Nu-Chek准备购买Inc .(快乐的、锰)。DSS (4 4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic酸)用于核磁共振化学位移引用和代谢物定量购买从Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。所有溶剂被用作提供没有进一步净化。

2.2。细胞培养

美国solfataricus(P2)准备在批处理文化如前所述24]。简单地说,细胞182年DSMZ从有氧锻炼成长的媒体,添加0.1%葡萄糖,在pH值3,80°C。这些实验,50毫升细胞培养在late-log收集阶段,最大的细胞密度。细胞是在液态氮冷却到零上之前由离心造粒(20000 g×15分钟)和存储在−80°C到分析。

文化的即hospitalis和即hospitalis- - - - - -n equitans准备(如前所述)(27,31日,32]。简单地说,文化是增长了24小时1 L包含250毫升瓶0.5 x中小企业中,硫(10 g / L),和H₂有限公司₂(80 - 20%)气相(15 psi),在85°C。细胞培养被冷却到室温之前收获,然后进一步冷冻冰,,最后,离心收集的细胞(8000 g×20分钟)。细胞颗粒是用冷洗净,厌氧0.5 x中小企业中、埃普多夫管整除,瞬间冷冻与液态氮N₂天然气,储存在−80°C到分析。

2.3。提取脂肪酸

脂肪酸提取使用修改后的Bligh-Dyer方法(33]。简单,细胞颗粒resuspended在磷酸缓冲盐(PBS)和转移到玻璃小瓶。在2000×g离心细胞颗粒状。离心后,PBS删除,增加了体积的甲醇(甲醇)等于细胞颗粒的三倍。使用组织均质器细胞细胞溶解,加入氯仿(CHCl紧随其后₃在同等体积的甲醇。最终的解决方案是放置在一个旋涡混合器在+ 4°C和摇动慢慢45分钟。细胞碎片被离心分离颗粒状2000×g和得到的上层清液转移到一个新的玻璃小瓶。甲醇/ CHCl的清洗解决方案₃被加入到细胞碎片,涡短暂颗粒状,导致液体结合以前收集的上清液。这个解决方案中,冷丙酮添加和瓶在−80°C一夜沉淀蛋白质。离心沉淀蛋白质被移除的2000×g和上层清液转移到另一个玻璃小瓶和干下N₂用于存储。样本保存在−80°C到用气相色谱-质谱和核磁共振分析。

2.4。制备脂肪酸甲酯(饥饿)

代谢物从细胞中提取脂肪酸标准在己烷混合物转移到2毫升玻璃GC瓶和干下N₂。每个瓶,400年μ我的男朋友₃甲醇是补充道。解决方案在60°C加热15分钟来促进脂肪酸的酯化。在200年的反应就熄了μL H₂O,紧随其后的是200μ500年饱和氯化钠溶液和LμL己烷。瓶是漩涡,然后离开站15分钟直到溶剂层明显分离。顶层由己烷和疏水分子被转移到一个新的玻璃GC瓶。第二次提取的饱和氯化钠溶液在500年使用一个额外的执行μ己烷,加上原来的500 LμL分数。这个提取过程确保了脂肪酸甲酯衍生品的最大恢复(饥饿)。最后,由此导致的饥饿的解决方案是干下N₂气体,在100年被resuspended之前μL己烷和转移到150μL玻璃GC插入的GC - ms分析。

2.5。gc - ms数据采集和分析

分析了饥饿的安捷伦7890 a gc - ms配备一个安捷伦7693 Autosampler和一个安捷伦5975 c惰性XL EI / CI MSD三轴探测器(CA)圣克拉拉,操作使用安捷伦MSD ChemStation软件(CA)圣克拉拉。一个Zebron ZB-FFAP列长度为60米,内径0.25毫米,膜厚度(nitroterephthalic酸改性聚乙二醇阶段)为0.25μ米被用于分离(Phenomonex托兰斯,CA)。参数采集如下:1μL(样本注入上海黄金交易所的- 092010分流/不分流进样衬(得克萨斯州奥斯汀市)入口温度为250°C和氦气流62.5毫升/分钟。GC烤箱包含扔下石英护柱,连接到分析柱的总长度65米。GC烤箱的温度在整个运行如下:120°C的初始温度,4分钟,每分钟6.5°C的温度斜坡到170°C,然后每分钟2.75°C的斜坡为9分钟,250°C的总运行时间50分钟。溶剂延迟4分钟前就确定收购女士开始了。把线从GC列被设置为250°C,女士源230°C,和四极150°C。碎片是由电子电离源(EI) 70 eV,扫描范围35阿姆河450年阿姆河(相对原子质量),和扫描速度每秒1.80扫描。使用安捷伦数据可视化质量猎人工作站定性分析软件。手动匹配对脂肪酸被证实,通过搜索NIST数据库使用NIST质谱搜索程序(34]。

2.6。核磁共振数据采集和分析

为¹H 1 d NMR分析、代谢物提取和脂肪酸标准(见上图)在500年resuspended混合μL(氘氯仿(CDCl₃)和转移到5毫米NMR管。核磁共振光谱是使用一个600 MHz (¹H拉莫尔频率)皇冠三世解决核磁共振谱仪从力量Daltonics (Billerica, MA)配备一个5毫米三重共振(¹H,¹⁵N,¹³C)氦冷却TCI冷冻器,使用上旋的光谱处理软件3.2版本(力量)。¹H NMR光谱被记录在298 K (25°C)使用Bruker-supplied“zgesgp”与256瞬变脉冲序列数字化到32 K数据点,光谱宽度为9615赫兹。每个光谱手动分阶段和基线校正,指数谱线增宽(EM)的0.5赫兹应用功能。

2.7。测试其他脂肪酸的来源控制实验

细胞培养媒体之前和之后的细胞生长受到整个提取过程。此外,溶剂空白,没有媒体或细胞,也是分析以确保CHCl等溶剂₃没有污染的脂肪酸或其他杂质。媒体和溶剂derivatized并用气相色谱-质谱使用相同的分析方法用于细胞。在高炉进一步测试₃甲醇也进行了。没有脂肪酸可以在媒体发现,溶剂,或衍生剂。作为额外的控制,细胞提取、溶剂、和媒体derivatized 1 -(三甲基硅烷基)咪唑(TMSi),它是另一种常见的试剂derivatizing脂肪酸,并用gc - ms进行分析。这些实验还表明,脂肪酸只从细胞提取物中恢复过来。最后,重复分析在不同的时间不同的细胞培养和分析个月产生类似的结果。

3所示。结果

评估的脂肪酸含量代表古生物体,从文化的疏水小分子美国solfataricus,即hospitalis,即hospitalis-N。equitanscocultures从细胞中提取小球,衍生化,采用气相色谱分析。氯仿和甲醇的混合物被用来提取疏水小分子,使用修改后的Bligh-Dyer方法,疏水性等小分子脂肪酸容易溶于有机相(33]。色谱分离之前,分子对待男朋友₃在甲醇(男朋友₃甲醇)与负电子的氧原子反应羧酸组,通过附加一个甲基化学修改它们。甲基除了降低分子的极性和沸点,促进,并用gc - ms分析。除了分析细胞提取的混合脂肪酸标准与酰基链从14到24个碳也是derivatized男朋友₃甲醇。为了确定分子的身份,保留时间和质量标准和样本的光谱模式与参考光谱从NIST数据库访问(34]。

将包含一个完整的基因编码酶能够代谢脂肪酸,我们开始寻找在有氧生物脂肪酸美国solfataricus。代谢物的摘录美国solfataricuscellstreated与男朋友₃甲醇在没有针对性的屏幕显示和分析采用气相谱峰分裂模式,显示女士的特征间距14阿姆河,典型的烃链(35]。随后的gc - MS分析脂肪酸标准使用相同的条件产生了保留时间和女士分裂模式匹配的棕榈酸(0)和硬脂酸(C18:0)(图2)。基于特征碎片女士模式,一些不饱和脂肪酸也观察到,但由于信号强度很低,无法证实这些高的信心。这是符合最近发表的基因组分析、预测美国solfataricus有基因编码酶代谢脂肪酸的能力(21]。考虑到美国solfataricus培养了一个未定义的媒体(酵母提取物),深入分析细胞培养基和试剂都是执行。在所有情况下,这些都是不利于脂肪酸,表明美国solfataricus脂肪酸的来源是由气相。

扩大我们的搜索在古细菌脂肪酸生物,我们把我们的努力即hospitalishyperthermophilic厌氧菌。即hospitalis预测是一组完整的酶需要进行脂肪酸代谢,然而多脂肪酸被验明正身根据保留时间和分裂模式已知的标准,包括十四酸(C14:0), 0, C18:0, 9-octadecenoic酸(C18:1)(图3)。其他几个不饱和脂肪酸如C18:2 (9, 12-octadecadienoic酸)和C18:3 (9、12、15-octadecatrienoic酸)被发现在低丰度但无法证实高的信心。C18:1表明证实存在即hospitalis可以产生不饱和脂肪酸,这表明它还可以合成C18:2 C18:3脂肪酸,这一发现与之前的研究一致表明中不饱和脂肪酸的存在吗p . furiosus(20.]。即hospitalis生长在一个定义的最小无机盐组成的媒体,没有酵母提取物和乙酸现在和控制实验媒体没有显示脂肪酸的存在,又支持这些脂肪酸起源于生物(32,36]。

当即hospitalis是生长在coculturen equitans用气相色谱-质谱(图观察,类似的脂肪酸3 (b))。以前,我们已经表明,当即hospitalis是coculturedn equitans能源“税”是对的即hospitalis(28]。确定的脂肪酸在这里可能是一个有价值的能源是否可用β氧化,产生的乙酰辅酶a可以穿梭的三羧酸循环和ETS ATP生产。为即hospitalis研究,收集到的数据是半定量的,使用电池的质量即hospitalis独自一人,即hospitalis-N。equitanscoculture。的gc - ms分析产生这些不同的细胞培养的脂肪酸内容显示在脂肪酸含量略有减少n equitans生长在coculture,表明脂肪酸作为能源促进增长的n equitans。

积极识别脂肪酸种类、碎片离子生成气从IDs假定的脂肪酸进行了分析并与参考光谱的标准。当确定脂肪酸,更高质量(m / z)碎片是重要的建立酰基链的长度,而较小质量碎片帮助识别无支链的碳氢链,以及确定是否有不饱和碳碳键酰基链。特征源自每一个独特的脂肪酸,从而能够积极识别0提取从所有三个文化(图4)。控制实验验证这些发现没有脂肪酸污染物在溶剂被发现,媒体,或衍生剂的解决方案(数据没有显示)。确认脂肪酸也通过匹配已知标准与洗脱峰的保留时间引起的细胞培养提取物(数字2和3)。总结发现的脂肪酸在细胞中提取表所示1,包括脂肪酸不能明确地证实了由于其低丰度。

一般来说,核磁共振是高度互补为代谢物分析和质谱分析提供了额外的自信程度在分析小分子样品时,如脂肪酸(37,38]。脂质提取美国solfataricus分析了利用核磁共振和披露的存在(archaeol)脂肪醇和脂肪酸。代谢物提取美国solfataricus在CDCl resuspended₃进行核磁共振分析。混合物包含21个脂肪酸标准CDCl也进行了分析₃产生的参考谱核磁共振脂质分析细胞的提取。一维(1 d)¹H光谱记录在美国solfataricus细胞提取样本和脂肪酸标准显示大量的核磁共振信号的特征脂肪酸(图5和补充图在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/472726)。分析即hospitalis和即hospitalis-N。equitans细胞提取物不能由NMR由于有限的细胞群所提供的这些细胞培养。

一维的分析¹H核磁共振显示之间的光谱匹配数量的细胞提取和脂肪酸标准,提供进一步的证据表明,脂肪酸存在于古生菌(图5)。一个广泛的核磁共振信号出现约1.25 ppm (¹H质子化学位移范围)来源于亚甲基相连的碳链脂肪酸分子。共振的宽泛,可能对应于轻微的差异¹H亚甲基质子之间的化学变化来自脂肪酸碳链的长度。额外的¹H共振在1.75 ppm, 2.40 ppm来自质子上β和α碳(质子贴上“b和a”图5),其信号分成多重态和三重态,分别(图5)。从甲基质子在ω脂肪酸链的产生一个核磁共振信号在0.90 ppm,分成一个多重态模式(见图5、质子贴上“d”)。核磁共振光谱的脂肪酸标准混合物,不饱和脂肪酸有助于¹H为4.00 ppm信号。同样的信号中观察到¹H NMR谱美国solfataricus细胞提取,虽然信号略在前场的转向¹H化学位移的位置3.80 ppm。额外的,尽管微弱,¹H质子信号所附着在碳碳双键的不饱和脂肪酸是观察¹氢的化学位移值大约5.50 ppm。

观察到的分裂模式¹H NMR光谱符合脂肪酸谱模式,验证的积极识别在这两个古细菌脂肪酸生物通过质谱分析。在¹H NMR谱美国solfataricus细胞提取物,¹H共振1.25 ppm,因脂肪族质子,比相应的更广泛的观察到的信号¹H NMR谱脂肪酸标准的混合物。这个扩大归因于archaeol脂质存在的已知存在于古生物体。由于规模庞大,archaeol脂质不能,并用gc - ms检测;因此,气不能用于验证核磁共振结果在这种情况下。

4所示。讨论

脂质在生物学中是高度多样化的角色。脂类是生物膜的基本要素,是稳定和有效的能源储存分子,也可以作为有效的信号分子。他们的存在在古细菌细胞,即使在少量,是值得注意的。这项工作表明,两个hyperthermophilic古生菌,美国solfataricus和即hospitalis,含有脂肪酸。证实这些生物使用ether-linked脂肪油脂(脂肪含酒精)分子膜组件,由于增加了这些脂质膜的热稳定性的结构。近期热点的基因组分析表明,除了脂肪醇,极端微生物拥有基因可能编码蛋白质合成和分解脂肪酸的能力(21]。使用gc - ms和NMR的组合,我们已经清楚地展示了脂肪酸的生物存在。这些数据提供的证据表明,这两种生物,有不同的代谢需求和环境(例如,有氧和厌氧)、脂肪酸代谢所需的酶的机械。

在美国solfataricus发现,饱和脂肪酸相对大量的保留时间和碎片匹配模式采用气相色谱和核磁共振。以前的膜脂质含量的分析美国solfataricus没有透露任何脂肪酸的存在,而是显示isoprenoid-based ether-linked脂质(28]。本研究采用气相不确定脂肪醇,因为用来产生饥饿的方法不容易水解的醚联系archaeol脂质。此外,完整archaeol脂质本身太大,gc - ms分析考虑到他们的分子量高于气相色谱分析的实际工作范围和电子电离用于gc - ms研究。脂肪酸的存在美国solfataricus表明该生物具有其生物合成所需的酶的机械和强烈表明,这些脂质可以异化作为能源。

严格的厌氧菌,即hospitalis和n equitans提供了一个完全不同的角度对脂肪酸代谢的热点领域。日益增长的高度降低的条件下和高压力,有限公司₂作为唯一碳源,我们预计能源来自H₂和元素硫。这两个生物原型的一种简约的生活方式。这个携带他们的基因组包含一组降低的基因和不列入古生菌预测包含所有必要的脂肪酸代谢的蛋白质机械。因此,我们的身份的脂肪酸即hospitalis和i hospitalis-N。equitanscocultures令人惊讶和支持的想法nonorthologous酶可能存在已酰coa脱氢酶(ACD)功能(21]。除了饱和脂肪酸,观察到美国solfataricus、不饱和分子物种也确定了。不饱和脂肪酸机械需要额外的酶的合成包括desaturases生成碳碳双键。

在一起,结果脂质提取的gc - ms和NMR分析证实,古生菌的脂肪酸的存在。我们发现基因是一致的证据表明,生产和消费所需要的代谢途径脂肪酸存在于美国solfataricus,表明失踪酶即hospitalis(ACD或同族体所显示Dibrova et al。)必须出现(21]。灵感来自我们的生化数据,position-specific爆炸搜索的基因组即hospitalis进行搜索即hospitalis从其他古生菌酶匹配酰coa脱氢酶。没有匹配的序列或其他酶与预测电子商务数字进行这个反应被发现的能力。这个发现支持Dibrova等人提出的一个替代ACD酶可能存在即hospitalis。此外,基因组分析即hospitalis和美国solfataricus未能连接与膜脂肪酸代谢系统参与电子传递,如细胞色素和视紫红质中描述的其他系统(21]。

鉴于这种生物生活在一个能源有限公司环境和过程最小基因组,很可能即hospitalis发展一种酶能够执行多个生物合成的反应,包括对脂肪酸的代谢。是一个有趣的假设即hospitalis包含一个酶系统工程没有催化偏向于生物合成或β氧化。这样一个系统可以用反应物和生成物的浓度(酰coa和脂肪酸、职责)调节脂肪酸代谢的合成代谢和分解代谢的方向。这个概念是一致的想法Dibrova等人提出的在他们提出的脂肪酸代谢的机制21]。

识别新的潜在的代谢能量来源这些hyperthermophilic上的嗜酸生物对生物的作用提出了疑问。鉴于脂肪酸类似发现在这项研究中被发现在其他热点生物,很可能会被用来作为一种能源,可储存的脂肪酸,碳水化合物产生能量的两倍重量(9千卡/克和4千卡/克,职责),和可能是一个非常重要的能源来源古细菌生物经常energy-depleted的居住环境(39]。不像美国solfataricus在有氧环境中生活,即hospitalis可能需要一个厌氧环境,利用硫酸耦合减少执行脂肪酸氧化(30.]。此外,即hospitalis是一种专性chemolithoautotrophic有机体,认为仅能在减少能源生产的硫。与酶的识别能力进行脂肪酸代谢和脂肪酸分子自己,值得重新审视脂肪酸的代谢能力和潜在价值的生物生活在恶劣,能源有限公司环境。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究受到了美国能源部的资助,生物和环境研究办公室(DE-SC0006654)和美国国家科学基金会MCB 1022481。NMR实验记录在蒙大拿州立大学力量DRX600解决方案NMR谱仪,购买部分资金来自美国国立卫生研究院共享仪器格兰特(SIG)(批准号1 s10-rr13878-01)和最近升级到一个皇冠三世控制台和低温冷却TCI探针(批准号1 s10-rr026659-01)。MSU质谱设备接收来自默多克慈善信托基金资助和NIH 5 p20rr02437图的程序。作者要感谢LECO他们的帮助公司分析和识别脂肪酸样本。作者感谢哈拉尔德博士胡贝尔(德国雷根斯堡大学)提供一个生物反应器的样本即hospitalis-N。equitans用于初始方法开发。

补充材料

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