文摘

一个基因编码一个cyclodextrinaseThermococcus kodakarensisKOD1 (CDase-Tk)识别和特征。基因编码656个氨基酸残基的蛋白质分子质量为76.4 kDa窝藏四个保守地区的所有成员α淀粉酶的家庭。一种重组酶被离子交换色谱法纯化,及其催化性能研究。酶是活跃在广泛的pH值条件(小灵通4.0 - -10.0),7.5的最佳pH值和温度的最优65°C。纯化酶水解β环糊精(CD),但不是α——或者γcd,可溶性淀粉、支链淀粉。最终产品的βcd是葡萄糖。的 和 U值分别为3.13±0.47毫克−1和2.94±0.16毫克毫升−1为βcd。CDase-Tk的独特的特点,讨论了催化温度和底物特异性低,淀粉利用率的途径在广泛的温度也提出了。

1。介绍

环糊精(CDs)的循环maltooligosaccharides至少5或更多α-D-glucopyranoside单位联系通过α(1、4)糖苷键如发现直链淀粉(淀粉)的片段。最常见的cdα- - - - - -,β- - - - - -,γcd, 6、7或8 D-glucopyranoside单元,分别为(1]。面向所有的cd中羟基的外环,而非交换性钾糖苷氧气和两圈氢原子是指向的内部空腔。这种组合提供了cd疏水内腔和一个亲水表面2]。腔使CDs的疏水环境形成包含复合物与许多不溶于水的化合物有许多有用的应用在食品、制药、药物输送、化学工业以及农业和环境工程(3]。增加应用程序的cd显示不同程度的抵抗常见的淀粉酶水解的刺激感兴趣的研究CD-degrading酶(4]。CD的行动可以从淀粉获得cyclomaltodextrin glucanotransferase (CGTase)的一员α淀粉酶家族的糖基水解酶(家庭13)。CGTases通常分为3组(α- - - - - -,β- - - - - -,γ-CGTases)根据不同的CD的特异性α- - - - - -,β,或γcd (5]。例如,CGTase海床furiosus是一个β-CGTase [6]。第一个嗜盐古细菌从嗜盐archaeon CGTase孤立Haloferax mediterranei主要生产αcd紧随其后βcd和γcd的比率1:1,1:0.6,和1:0.3,分别由分光光度分析(7]。

CD-degrading酶,包括cyclomaltodextrinase (CDase EC 3.2.1.54)、糖化酶(EC 3.2.1.133)和neopullulanase (EC 3.2.1.135),被分为糖苷水解酶家族中的一个常见亚科13 (GH13)和已报告能够水解全部或两种基质下列三种类型:CD,支链淀粉,淀粉1]。CDase是一种独特的酶,这种酶催化水解的cd更快比支链淀粉和淀粉形成的线性低聚糖α1、连杆和它可以释放物质从CD包含复合物(1]。自从CDase从芽孢杆菌macerans在1968年首先报道,许多研究已经进行了cdas各种细菌和古细菌来源。许多cdas细菌特征,如酶芽孢杆菌(1),Thermoanaerobacter ethanolicus39株e [8),黄杆菌属sp。9),而克雷伯氏菌oxytoca应变M5a1 [10]。古生菌cdas已经从特征Archaeoglobus fulgidus(11),Thermococcussp。B1001 [12),Thermococcussp。CL1 [13),Thermofilum立案(14),而海床furiosus(15]。在这些cdas, CDase的结构黄杆菌属详细sp.特点是(16]。这个结构建议Arg464函数作为一个女伴指导从溶剂基板到活动中心,和Glu340开始水解打开环(16]。从古生菌由于其高温特点,cdas吸引了研究兴趣和工业应用潜力巨大。

Thermococcus kodakarensisKOD1嗜热厌氧archaeon的全基因组序列已被报道(17]。作为一个hyperthermophilic厌氧菌deep-vent环境中生活,t . kodakarensisKOD1微生物研究超嗜热菌的模型,它是一个潜在的工业酶来源。t . kodakarensisKOD1产生CGTase (Tk2172)主要催化的形成βcd (18]。在这里,我们报告CDase的净化和催化特性t . kodakarensisKOD1 (CDase-Tk;Tk1770)水解βcd。结合多糖降解数据,利用多糖的代谢途径t . kodakarensisKOD1提出。

2。材料和方法

2.1。微生物和媒体

t . kodakarensisKOD1,请把由日本收藏的微生物,理研生物资源中心,日本,用于隔离基因组DNA,它在280年被培养Thermococcus介质(17]。

2.2。克隆CDase-Tk从t . kodakarensisKOD1

PCR使用t . kodakarensisKOD1基因组DNA为模板进行隔离CDase-Tk使用下面的寡核苷酸引物:转发:5′- gGAATTCATGTATAAGGTTTTCGGG-3′和反向:5′20CTCGAGCTATTCCTGCAGGTCTG-3′(强调基地表明限制性内切酶(生态国际扶轮和Xho我网站)。PCR产物和pET28——(a)向量被限制性内切酶消化。结扎产品变成了大肠杆菌BL21 (DE3)细胞电穿孔和测序证实了。

2.3。CDase-Tk表达和纯化

大肠杆菌BL21 (DE3)细胞包含pET28a-CDase-Tk质粒在2 L培养包含30磅的肉汤μ克毫升−1卡那霉素在37°C 3 h。当OD600年达到0.7,异丙基-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)添加到1毫米的最终浓度诱导蛋白表达。4 h后文化与颤抖,细胞在6000转离心收获而10分钟在4°C。细胞颗粒resuspended在裂解缓冲(50毫米Tris-HCl, pH值8.0),干扰声波降解法,在14000转离心20分钟在4°C。上层清液被加载到一个Macro-prep DEAE支撑柱与裂解产物(美国Amersham生物技术)缓冲区。结合蛋白被筛选了50 mM Tris-HCl缓冲区(pH值8.0)逐步增加浓度的氯化钠从50到500毫米。活跃CDase-Tk中筛选了200毫米氯化钠分数。蛋白质浓度估计的布拉德福德方法使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准19]。

2.4。化验CDase-Tk活动

CDase-Tk活动是通过使用来衡量的α- - - - - -,β- - - - - -,γcd、可溶性淀粉和支链淀粉为基质。简单地说,适量的纯化酶(约0.80μg)被添加到反应混合物(200μ底物L)包含0.5% 20毫米Tris-HCl缓冲区(pH值7.5),和1 h反应是孵化65°C。还原糖的浓度从酶反应混合物中解放出来是spectrophotometrically量化3 5-dinitrosalicylic酸试剂在OD = 540 nm紫外可见分光光度计(日本岛津公司、日本)20.]。一个单位的酶活性被定义为的酶量版本1μ米每分钟还原糖。

pH值的影响CDase-Tk活动决心使用上述协议除了Tris-HCl缓冲替换为50毫米醋酸钠(pH值3.0 - -5.0),50 mM MES (pH值5.0 - -7.5),50 mM玫瑰(pH值8.0 - -8.5),或50 mM甘氨酸(pH值9.0 - -10.0)21]。所有化验在最佳温度下进行。

动力学研究,考察了酶促反应的初速度不同环糊精的浓度(从1到10毫克毫升−1在最优条件下)。的米歇利斯常数( )值和最大速度( σ)是通过数学计算使用图(12.5)软件。参数由三个独立的实验。

2.5。薄层色谱法

薄层色谱法(TLC)的酶法水解不同基质的产品进行与butanol-ethanol-water比4:4:3硅胶板的流动相。板块浸入溶液含有0.3% N - H (1-naphthyl)乙二胺和5%2所以4在甲醇。水解产品可视化通过加热10分钟的板块在110°C。

3所示。结果与讨论

3.1。CDase-Tk序列分析、表达和纯化

CDase-Tk有656个氨基酸,推导出兆瓦76.4 kDa的π5.5 (http://web.expasy.org/compute_pi/)。CDase-Tk没有预测分泌信号。与基因库中可用的CDase序列相比,CDase-Tk序列相应基因的高度相似,例如,基因从压力ThermococcusYP_006424883.1 sp。CL1 (59%),ThermococcusBAB18100.1 sp。B1001 (53%),海床furiosus(56%,NP_579668.1),Thermofilum立案YP_920858.1 Hrk 5(52%)(图1)。氨基酸序列的一个UNIPROTKB Blastp搜索CDase-Tk建议残留200 - 600包含一个签名的典型糖基水解酶(GH)家庭13,也被称为α淀粉酶的家庭。所有的四个保守地区GH13淀粉水解酶CDase-Tk序列被确定。图1显示了一些高度相似的氨基酸序列比对GH13家族蛋白质的氨基酸Asp411, Glu437, Asp502 CDase-Tk对应高度保守的催化残基在GH13 CDase。


图1
CDase-Tk的序列和结构分析。Cyclodextrinase序列t . kodakarensisKOD1 (CDase-Tk Tk1770),Thermococcussp。CL1 (CDase-Tc YP_006424883.1),Thermococcussp。B1001 (CDase-Tb BAB18100.1),海床furiosus(CDase-Pf NP_579668.1)Thermofilum立案Hrk 5 (CDase-Tp YP_920858.1)是一致的。实线表示的四个地区守恒GH13家族达成共识。星号显示三个活跃网站的位置。每个残留的保护水平是由上面的酒吧的高度表示每个残留。的数量在每一行的结尾氨基酸表明氨基酸残基的数目。

1971 - bp的片段CDase-Tk基因从基因组DNA放大t . kodakarensis和结扎KOD1 pET28a向量的生态国际扶轮和Xho我网站生成质粒pET28a-CDase-Tk。大肠杆菌细胞转化pET28a-CDase-Tk种植和推荐的最优条件下诱导表达的基因。这种酶被DEAE柱层析法纯化。分离出蛋白质的纯度和大小进行了分析通过sds - page(图2)。CDase-Tk迁移附近~ 76 kDa的预测分子量。


图2
CDase-Tk净化。上层清液总蛋白的重组大肠杆菌被加载到一个DEAE柱,结合蛋白被逐步氯化钠添加筛选了。分子质量标准显示在左边。从noninduced细胞巷1,粗蛋白提取;从IPTG-induced细胞巷2,粗蛋白提取;车道3和4,蛋白质的50 mM氯化钠筛选了DEAE柱;巷5、蛋白质筛选了100毫米氯化钠;6巷、蛋白质筛选了200毫米氯化钠。
3.2。底物特异性CDase-Tk

评估的范围的底物选择性CDase-Tk,五基质降解包括监测被选中α光盘,β光盘,γcd、可溶性淀粉和支链淀粉。图3(一个)显示了相对活动的cdβcd - 100。CDase-Tk首选βcd作为最活跃的基质,对支链淀粉水解活动γ大约20%的cdβcd。总的来说,CDase-Tk的衬底的偏好是CD≫支链淀粉≫淀粉。这个订单有点类似的衬底偏好cdas从其他嗜热古菌一样都喜欢CD最佳底物(表1)。然而,不同的高温cdas喜欢不同的cd。例如,CDasep . furiosus更喜欢αcd作为衬底,CDaset .立案倾向于降低γcd(表1)。此外,CGTaset . kodakarensisKOD1主要催化的形成βcd (18],CDase-Tk的底物特异性是依照CGTase催化属性有效淀粉利用率。

表1
比较CDase-Tk的生化特性和其他cdas古生菌。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图3
温度对活动的影响和影响的pH值CDase-Tk的活性和稳定性。(一)水解活动CDase-Tk支链淀粉,淀粉、环糊精。(b) CDase-Tk的最佳温度。(c) CDase-Tk的最佳pH值。不同的缓冲区被用于不同的pH值本试验中使用的解决方案。醋酸钠是用于小灵通3.0、4.0和5.0;MES缓冲区用于小灵通5.0到7.5;消息灵通的缓冲区用于小灵通8和8.5;甘氨酸缓冲用于小灵通9.0和10.0。缓冲区的浓度是50毫米。
3.3。pH值和温度最适条件

完整的重组酶活性高于30°C,活动增加与温度升高,水解的催化活性最高βcd可以达到65°C(图3 (b)),这是远低于最佳生长温度(85°C)t . kodakarensisKOD1。CDase-Tk显示高氨基酸序列的相似性,cdas其他嗜热古菌,包括Thermococcussp。CL1 (CDase-Tc),p . furiosus(CDase-Pf),Thermococcussp。B1001 (CDase-Tb),t .立案Hrk 5,但CDase-Tk的最佳温度远低于这些酶对大多数(大约90°C)(表1)。然而,CGTaset . kodakarensisKOD1水解淀粉的最佳温度为80°C,也低于最佳生长温度为t . kodakarensisKOD1 [18]。

CDase-Tk活动对pH值的依赖关系是决定使用不同的缓冲区(50毫米NaAc, pH值:3.0 - -5.0;50 mM MES, pH值:5.0 - -7.5;50 mM玫瑰,pH值:8.0 - -8.5;甘氨酸和50毫米,pH值:9.0 - -10.0)。水解的最大活动βcd被发现在pH值为7.5,这是不同于其他高温cdas显示他们的最佳活动在酸性环境下包括小灵通从4.5到5.5(表1)。CDase-Tk也活跃在pH范围从4.0到10.0,89.6,91.5,95.9和86.0%最大活动小灵通4.0,5.0,7.0,和10.0,分别(pH值设置为100%,报7.5)(图3 (c))。这个结果表明,CDase-Tk可以水解底物广泛的pH值范围,它应该更适合t . kodakarensisKOD1环境适应。

3.4。动力学和产品分析

重组CDase-Tk的动力学进行了分析βcd作为底物通过改变它的浓度。执行的反应是在Tris-HCl缓冲区(pH值7.5)65°Cβcd毫升浓度从1到10毫克−1。Michaelis-Menten方程被用来计算动力学参数(图4)。CDase-Tk催化βcd与 = 3.13±0.47毫克毫升−1和 U = 2.94±0.16毫克−1。薄层色谱结果表明CDase-Tk的作用结果的形成葡萄糖在使用βcd作为底物(图5)。其他cdas显示广泛的底物和产品。例如CDase-Pf GH13 cyclodextrinase,具有的特点α淀粉酶和cyclodextrin-hydrolyzing酶。类似于典型的α-amylases CDase-Pf水解maltooligosaccharides和淀粉,主要生产麦芽三糖和maltotetraose。然而,这种酶可以降解支链淀粉和攻击βcd (15)(表1)。


图4
底物浓度的影响在CDase-Tk cyclodextrinase的速度。检测进行中描述的材料和方法。据参数这里有三个决定的方式。

图5
薄层色谱法(TLC)水解产品βcd由CDase-Tk生成的。巷1:1%βcd,通道2到4:CDase-Tk反应底物在1%浓度在65°C, 30或60分钟。性病表明低聚糖标准包含1%葡萄糖,麦芽三糖,maltopentaose, maltoheptaose。

4所示。结论

在室内的cyclodextrinase从hyperthermophilic archaeont . kodakarensisKOD1 (CDase-Tk)属于GH13家庭是不同的过表达大肠杆菌和生化特征。CDase-Tk首选βcd作为最活跃的底物,但其活动对其他基质是很难衡量的。在这项研究中,我们发现,酶活性的最适温度为65°C,和最高的活动被发现在pH值为7.5的小灵通(从4.0到10.0)。CDase-Tk水解的特点βcd在相对较低温度和nonneutral pH值应该在的生存发挥重要作用t . kodakarensis在低温条件下KOD1 (65°C)。

以前,我们报道,两个细胞外支链淀粉酶t . kodakarensisKOD1 (Tk0977和Tk1774)可以水解支链淀粉和淀粉的低聚糖最佳温度高达100°C。Tk0977是765个氨基酸的蛋白质与假定的22-residue信号肽。这种蛋白质有四个主题和催化三分子的共识GH13家庭推导氨基酸序列。Tk0977可以有效地水解淀粉生产麦芽糖和麦芽三糖。Tk1774是一种有机溶剂,洗涤剂,和耐热性的amylopullulanase属于GH57家族的蛋白质,而且只生产麦芽三糖(21,22]。这些麦芽三糖产品可能会经由ABC-type麦芽糊精运输系统,进一步进入糖酵解途径。在这项研究中,CGTase和CDase通路组成t . kodakarensisKOD1催化细胞外形成的β从淀粉cd,随后细胞内降解。CGTase-CDase通路显示最佳的催化特性在较低的温度。基于这些观察结果,我们提出四种酶(Tk0977, Tk1770 Tk1774, Tk2172)协同参与的过程中淀粉利用率与广泛的温度范围为细胞代谢提供葡萄糖(图6)。


图6
提出了淀粉的退化模型t . kodakarensisKOD1。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

应的太阳,小民Lv和李Zhengqun同样对本文亦有贡献。

确认

这项工作得到了中国自然科学基金(31201485,31201485),吉林省科技发展计划(20130522063 jh)和专门研究高等教育的博士项目基金(20120061120103)。