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古生菌
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古生菌/2015年/文章
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体积 2015年 |文章的ID 267570年 | https://doi.org/10.1155/2015/267570

舞妓田边,Yoshizumi Ishino,鸠山Nishida, ”从结构分析为实际应用DNA连接酶的蛋白质工程”,古生菌, 卷。2015年, 文章的ID267570年, 20. 页面, 2015年。 https://doi.org/10.1155/2015/267570

从结构分析为实际应用DNA连接酶的蛋白质工程

舞妓田边,1 Yoshizumi Ishino,2 和 鸠山Nishida1

1中央研究实验室,日立公司(Hitachi Ltd .), 1 - 280 Higashi-koigakubo,国185 - 8601年,日本东京

2生物科学与生物技术、生物资源和生物环境科学研究生院学院农业,九州大学,6-10-1 Hakozaki, Higashi-ku, Fukuoka-shi,福冈812 - 8581,日本

学术编辑器:弗雷德里克Pecorari
收到了 2015年2月20日
接受 2015年5月18日
发表 2015年10月05

文摘

在所有活细胞DNA连接酶是不可或缺的和无处不在的器官。DNA连接酶广泛应用于分子生物学研究领域,如基因工程和DNA测序技术。这里我们回顾各种DNA连接酶的利用率在体外基因操作,在过去的几十年里发展起来的。在此期间,更少的蛋白质工程尝试进行DNA连接酶,作为DNA聚合酶相比。我们总结最近进展的说明DNA结扎机制得到的三级结构解决了迄今为止,结扎的每一步反应计划。我们还将展示一些例子工程DNA连接酶,由其三维结构的观点。

1。介绍

DNA连接酶DNA复制和修复酶至关重要;他们被广泛应用于分子生物学和生物技术应用,例如克隆和下一代DNA测序(1,2]。DNA连接酶催化的加入相邻3′羟基和5′磷酸化DNA双螺旋DNA末端。所有DNA连接酶接受割进dsDNA同源,凝聚力的结束作为基质,尽管效率所需的最小长度的重叠结扎差别很大。一些连接,尤其是T4 DNA连接酶,也接受完全碱基(钝端)基质在体外结扎的反应。

DNA连接共享一个共同的机制和高度的结构相似性nucleotidyltransferase家族的其他成员,包括RNA连接酶和RNA-capping酶(3]。像其他nucleotidyltransferases, DNA连接酶利用ATP分子激活酶,因此DNA连接酶准备与DNA反应底物(4]。

每一步的细节在DNA结扎反应序列已经被许多努力澄清由众多的研究者。最重要的是,舒曼的小组做出了大量贡献的说明DNA结扎机制(5]。我们描述了例证DNA结扎计划特别是,在本文的第二部分。

自从发现DNA连接酶,这种酶已广泛应用于多种类型的分子生物学和生物技术的应用程序。DNA连接酶常常利用结合限制性内切酶在DNA重组实验。酶已被应用于DNA测序方法在不同方面,利用DNA连接酶的事实不需要核苷酸作为其功能基板,因为大量的核苷酸在解决方案,总体形势DNA聚合酶反应,有时抑制有效测量和引起误解。DNA连接酶也用于分析蛋白质相互作用的方法,是由Landegren et al。6]。这些方法被广泛应用的快速和有效的原位蛋白质相互作用的调查7]。我们将描述的细节在几个方面利用DNA连接酶基因工程技术和分子和细胞生物学在第三部分。

自从第一次报告的x射线晶体结构ATP-dependent从噬菌体T7 DNA连接酶8)、古细菌和真核的晶体分析ATP-dependent DNA连接酶随后被报道在新世纪的第一个十年(9- - - - - -11]。ATP-dependent DNA连接酶从古细菌和真核生物包括三个领域,但是,令人惊讶的是,三个领域的相关安排互相完全不同于在这些报告9- - - - - -11),反映出动态域运动序列的3步结扎。基于这些结构转换结扎序列,几次改善酶反应是由突变酶。在第四和第五部分,我们总结关于DNA连接酶的结构信息和mutation-based改进酶的功效。

2。DNA连接酶反应的基础

据传,雷曼兄弟、理查德森和赫维茨实验室在1967年和1968年发现DNA连接酶(12- - - - - -15]。通过加入3′-哦,5′磷酸末端(缺口)形成磷酸二酯键,DNA连接酶发挥重要作用在维持基因组的完整性。他们是必不可少的在所有生物体DNA复制和修复(16,17]。此外,DNA连接酶一直是发展的一个关键试剂分子克隆和DNA的生物技术后来许多方面。

所有DNA连接反应需要顺序nucleotidyltransfer步骤(18]。反应机理可分为三个不同的催化事件:第一(步骤1),通过共价酶的激活增加AMP守恒连接酶的催化赖氨酸,伴随着PPi的释放或烟酰胺单核苷酸辅因子(ATP或河畔+);第二(步骤2),绑定的ligase-adenylylate衬底DNA和AMP的转移从连接酶5′磷酰基集团尼克的DNA;第三个(步骤3),磷酸二酯键的形成与随之而来的释放的自由AMP DNA-adenylylate中间(图1)。所有三个化学步骤依赖于二价阳离子。DNA连接酶分为两个家庭,根据反应的代数余子式的依赖。ATP-dependent DNA连接酶在病毒、细菌、真核生物和古菌(18,19),而NAD+端依赖DNA连接酶主要存在于细菌和病毒entomopox [19,20.]。


图1
原理图的三步反应催化ATP-dependent DNA连接酶。三步反应催化DNA连接酶(酶)的串行传输AMP(腺苷5′一磷酸)一个活跃的站点赖氨酸(步骤1),然后到5′po4DNA(步骤2)。在步骤3,第二个DNA链的3′-哦结束攻击5′po4释放AMP和生成结扎,DNA的产品。

DNA连接酶的序列分析显示,他们分享六个主题(III a我,第三,四,五,六世),也是守恒的nucleotidyltransferase总科成员,包括RNA连接酶(21),tRNA连接酶(22],mRNA-capping酶(23),除了主题VI。ATP-dependent DNA连接酶,这些酶中六个主题一致从病毒、噬菌体、古细菌,真核生物,没有长时间的空白或插入(图2)。ATP-dependent DNA连接酶的序列表明,氨基酸在图案我,三世,III a, IV, V,和VI联系基质,AMP或DNA。个别氨基酸的重要作用在这些图案是由丙氨酸扫描突变研究和验证确认所必需的一个或多个步骤的结扎通路(24]。例如,主题我(KxDGxR)包含变得共价的赖氨酸与AMP在连接酶反应的第一步25,26]。此外,精氨酸和赖氨酸侧链主题VI (RxDK)东方PPi离去基水相对于攻击主题我赖氨酸,在第1步酶nucleotidylation反应(27,28]。


图2
保守序列的元素定义一个共价nucleotidyltransferases总科。6共线序列元素,指定为主题,三世,III a, IV, V和VI守恒限制酶和连接酶。DNA连接酶的氨基酸序列是一致的小球藻病毒(ChV)、噬菌体T7 (T7),海床furiosus(空斑形成单位),硫化叶菌solfataricus(Sso),和人类(胡)。干预氨基酸残基的数量表示。守恒的残留物用红色突出显示(nucleotidyltransferases)和蓝色(DNA和RNA连接酶)。

3所示。利用DNA连接酶基因研究技术

的在体外操纵DNA已经被广泛应用于分子遗传学的研究,微生物学,免疫学,肿瘤以及实际应用在临床化验(29日]。这种技术被开发以DNA-related酶,研究发现DNA的复制和修复的分子机制。DNA复制是由DNA引物酶,它综合小RNA引物随后细长的DNA聚合酶(30.]。基于其引物延伸活动,可以利用DNA聚合酶聚合酶链反应(PCR),这加剧了一个复制的DNA在短暂的几个数量级在体外反应(31日]。此外,期间加入冈崎片段的DNA连接酶扮演一个角色后随链成熟(32]。根据其活动加入两个DNA链在体外DNA连接酶,导致DNA重组技术,例如,DNA克隆(33]。此外,DNA连接酶是广泛用于ligase-mediated突变检测方法和DNA测序。

3.1。寡核苷酸结扎试验(OLA)

DNA连接酶只能连接两个DNA链时完全杂化一个互补DNA序列。甚至单个碱基对之间的不匹配两股显著降低链加入反应的效率(34]。1988年,寡核苷酸结扎试验(OLA)开发,作为一个有用的方法来检测目标DNA的基因型,利用这个特征(6,35]。这是发展的第一个例子的方法通过使用DNA连接酶基因分析。

OLA包含两个步骤。首先,两个探针杂交与目标DNA序列的直接兴趣必须说谎相邻。在这种情况下,探针必须包含一个记者集团32P -或荧光标记,另一个必须包括识别组固定,如生物素集团可能被链霉亲和素固定在一个坚实的支持。第二,邻近探测目标完全杂化的DNA序列的利益受到DNA连接酶的加入。然后,结扎信号随后被链霉亲和素,检测到放射自显影法或荧光照相术(图3)。本试验利用酶精度的两个事件,探针的杂交和DNA连接酶的加入,导致可靠的临床基因型分析。


图3
原理图的寡核苷酸结扎试验(OLA)。从正常的DNA片段类型和突变类型(在单核苷酸多态性(SNP)网站)显示为反应模板。(1)变性:样本被加热到85 - 95°C的几分钟变性DNA(分离成单股)目标。(2)杂交:两个寡核苷酸探针5′生物素标记探针和3′荧光或放射性标记的探针,这是互补的正常型目标,目标DNA片段杂交。(3)结扎:相邻探针完全互补的目标(左)是由DNA连接酶连接。(4)绑定支持:荧光标记结扎样品固定链霉亲和素和荧光照相术只有探测到的结扎生物素化的寡核苷酸,可以绑定到链霉亲和素(左)在一个坚实的支持。

实际应用的突破OLA发生在1990年,当PCR耦合分析结扎前反应(PCR-OLA) [36]。PCR-OLA放大只有目标DNA的增强的敏感性试验,使OLA非放射性检测的结果。最近,一个敏感的、具体的和高通量OLA开发的检测基因型人类免疫缺陷病毒1型(hiv - 1)抵制食品和药品管理局批准了蛋白酶(37]。这份报告显示,OLA可用于检测的hiv - 1基因型(野生型和突变体)基因诊断方法。

3.2。DNA Ligase-Mediated自行车结扎的反应

进一步蔓延的DNA ligase-mediated技术是通过循环结扎反应,如PCR,使用DNA连接酶耐热性的,在1990年成为商业上可用。耐热性的DNA连接酶使自行车OLA反应。OLA反应方法和热循环过程由使用耐热性的DNA连接酶往往特别称为结扎检测反应(LDR)(图4)。通过重复变性、退火和结扎,目标信号放大线性(38- - - - - -40]。结扎连锁反应(LCR) [38,39,41)和结扎扩增反应(政治)42]也由重复循环的热变性的DNA模板包含目标序列,探针的退火,结扎过程。退火后第一组两个相邻寡核苷酸探针到目标DNA序列以一种独特的方式,第二套互补的寡核苷酸探针杂交顺序相反的到目标应用DNA序列(图5)。此后,耐热性的DNA连接酶共价链接每一对相邻的探测器,是完全杂化邻探针交界处。通过重复的连续过程,包括变性、退火和结扎,目标信号放大成倍增长。这些方法需要一个耐热性的DNA连接酶允许结扎在温度条件下发生,防止不匹配组合形式可接受的基质。耐热性的DNA连接酶做了这个试验用于DNA遗传疾病的诊断检测在临床实验室。ligation-mediated检测热稳定的点突变的DNA连接酶目前用于检测乙型肝炎病毒(HBV)突变体(43- - - - - -45),结肠肿瘤微卫星序列变化(46),负责缺牛白细胞粘附的突变(47),AZT-resistance艾滋病毒突变体(48),突变拉家族的致癌基因(49),扩展频谱β内酰胺酶抗性细菌(50],ganciclovir-resistant巨细胞病毒突变体(51]。


图4
结扎检测反应原理图(LDR)过程。从正常的DNA片段类型和突变类型(在单核苷酸多态性(SNP)网站)显示为反应模板。(1)变性过程在图是一样的3(1)(2)杂交:两个寡核苷酸探针,补充正常型目标,目标DNA片段杂交。(3)结扎:相邻探针完全互补的目标(左)由DNA连接酶连接,和热循环线性放大产品形成的数量。突变类型的模板,在结单碱基错配的存在抑制了结扎,因此没有结扎异地恋探针形成(右)。

图5
原理图的结扎连锁反应(LCR)和结扎扩增反应(政治)流程。(在这里,我们描述电感电容电阻测量)。从正常的DNA片段类型和突变类型(在单核苷酸多态性(SNP)网站)显示为反应模板。(1)变性过程在图是一样的3(1),(2)杂交:四个寡核苷酸探针,补充正常型目标,目标DNA片段杂交,和(3)结扎:相邻探针完全互补的目标(左)是由DNA连接酶连接。结扎电感电容电阻测量探针从第一轮结扎成为目标的后续使用另一个探头组(虚线)补充第一集。因此,结扎电感电容电阻测量探头的数量成指数增加。突变类型的模板,在结单碱基错配的存在抑制了结扎,因此没有结扎电感电容电阻测量探针形成(右)。
3.3。挂锁探针和滚环放大(RCA)

挂锁探针和RCA替代方法检测已知序列DNA的变异,特别是检测单核苷酸多态性,用DNA连接酶耐热性的。挂锁探测器目标识别序列位于两个5′和3′端,连接一个干预序列可以包含序列的检测。当探针杂交目标序列,两端是彼此相邻,然后热稳定的DNA连接酶共价连接的两端和公布调查。这个环状调查目标链缠绕的方式类似于挂锁,由双链DNA的螺旋性质(52)(图6)。这个探针用于信号的定位原位分析。例如,一个挂锁探测器能够探测alphoid重复序列在中期染色体在一个活细胞,证明其效用原位研究[53- - - - - -55]。RCA也被称为一个简单、高效的等温酶过程,利用链置换DNA和RNA聚合酶,像Phi29, Bst,和发泄exo-DNA聚合酶为RNA, DNA和T7 RNA聚合酶生成单链DNA和RNA含有成千成百上千的串联重复序列,是互补的圆形模板(56- - - - - -58]。挂锁原理结合RCA突变检测,在连接器的引物退火区域启动滚动圆复制(图6),因为挂锁方法本身并不足以检测单核苷酸差异在一个单一的基因副本原位(59- - - - - -61年]。点突变在囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道,p53, BRCA1基因,基因治疗在间期细胞核和DNA纤维可视化RCA (62年]。这些结果表明,ligase-mediated突变检测方法加上RCA能够揭示单核苷酸差异在一个细胞。的能力来检测突变细胞环境对癌症研究和诊断有重要意义。


图6
的示意图表示target-primed滚动循环放大(RCA)的环状挂锁调查。(1)5′3′exonucleolysis:目标DNA限制消化3′目标序列和不可逆转的单链由strand-specific 5′3′exonucleolysis。(2)杂交:挂锁探针(红色)与标签序列(绿色)杂化目标序列。(3)结扎& 5′3′exonucleolysis:相邻挂锁探针完全互补的目标(左)由DNA连接酶连接,从而锁定探测到目标分子。结扎后,RCA发起Phi29 DNA聚合酶,通过将目标分子转化为引物的3′5′exonucleolysis的3′末端突出超出了挂锁探针杂交的网站。然后挂锁探针作为DNA合成的模板。RCA产品(黑)检测通过荧光标记探针的杂交(绿色)标记序列挂锁探针所特有的。箭头指示的3′端RCA的反应。

在RCA结扎方法的另一个方面,接近结扎试验(PLA)而闻名的一个强有力的技术检测单个蛋白质或蛋白质复合物原位利用抗体与参与结扎和随后的RCA连接DNA链反应(63年]。解放军可用于检测反应取决于两个目标识别的分子识别事件。形成一个适当的目标复杂结果的形成一个环状DNA链通过体内DNA连接酶补充道。这个环状DNA用于模板本地限制RCA反应,生成一个延伸ssDNA卷取一个球时,可以检测出杂化与fluorescence-labeled探测器(7]。绑定到目标相互作用的复杂的由两个不同的抗体分别连接寡核苷酸(称为距离探测器)是紧随其后的两个寡核苷酸,然后结扎成环状DNA链通过DNA连接酶的功能。环状DNA链模板化的寡核苷酸连接抗体(图7)。接下来,抗体的寡核苷酸作为底漆使用成功的RCA反应,导致ssDNA滚动圆的一代产品。滚动圆是共价连接到邻近的调查。60分钟RCA Phi29 DNA聚合酶的结果在100元的1000倍放大DNA循环,产生一个100 kb左右滚动圆的产品(63年]。然后滚动圆产品可视化fluorescence-labeled互补的寡核苷酸杂交的探针检测原位。


图7
的示意图表示原位接近结扎试验(PLA)。(1)蛋白质相互作用:复杂目标之间形成蛋白质(浅蓝色和粉红色)。(2)邻近探测绑定:抗体(黑)与个别接近探针(glay)绑定到每个目标蛋白复合物。(3)杂交的连接器oligo-DNAs:目标蛋白质复杂的服务模板的杂交连接器oligo-DNAs(红色)。(4)连接,形成完整的DNA循环:相邻连接器完全互补的寡核苷酸是由DNA连接酶连接到目标模板。(5)滚动循环放大(RCA)和检测:结扎后,RCA Phi29发起的DNA聚合酶,通过将目标分子会被距离探测器之一。RCA产品检测通过荧光标记探针的杂交(绿色)。箭头指示3′末端,圆意味着与2′,3′端修改O甲基RNA。
3.4。通过使用DNA连接酶下一代DNA测序

最近,下一代测序(上天)技术,如454年FLX pyrosequencer(罗氏)[64年),Illumina公司基因组分析仪(Illumina公司)65年)和序列的寡核苷酸结扎和检测(固体)音序器(技术)66年),已经彻底改变了基因组和遗传研究。虽然这些平台非常多样化,在测序生物化学和序列检测,他们的工作流概念上类似于对方。数组是由随机DNA碎片,紧随其后在体外结扎共同适配器的序列DNA连接酶。DNA片段与适配器是由DNA聚合酶放大和检测平台。检测平台依靠测序DNA合成方法,即串行扩展的模板。这种酶推动DNA合成可以是DNA聚合酶或DNA连接酶。454年FLX Pyrosequencer和焦磷酸测序(Illumina公司分析仪使用DNA聚合酶的方法67年分别和可逆的染料终结者技术(68年]。相比之下,固体使用DNA连接酶和一个独特的方法序列扩增片段(69年]。杂化适配器的通用引物互补序列的扩增子数组。每个周期的测序包括退化的结扎,荧光标记8-mer探头设置(图8)。八聚物混合物的结构和类型的核苷酸(A、T、G、C)在特定的位置在8-mer探针组与荧光标签的类型。结扎后8-mer探测、图像获得的四个通道,导致测序数据的有效采集的3′末端位置探测所有template-bearing珠子。然后,八聚物之间化学裂解职位3和4,将荧光标签。进步的八聚物结扎使每5日基地的测序(如基地1、6、11、16的模板链)。经过几个周期的探头连接反应的,扩展的底漆是变性重置系统。随后这个过程的迭代可以应用于一组不同的位置(例如,基地0、5、10和15的模板链),通过使用不同的八聚物混合物在不同位置的核苷酸与标签的颜色。这个平台的一个附加特性包括两种基本的使用编码,纠错方案两个相邻的基地,而不是一个基地,与标签。每个基本立场是然后查询两次(一套2 bp审问在给定周期),因此误称可以更容易识别70年]。


图8
ligase-mediated测序方法序列的寡核苷酸结扎和检测(固体)音序器(技术)。(1)图书馆准备:两个不同的适配器的结扎剪基因组DNA。(2)乳液聚合酶链反应:乳液聚合酶链反应进行了使用磁珠来生成“珠克隆”,每个包含一个核酸的物种。(3)珠沉积:珠子是附着在载玻片表面。(4)测序结扎:ligase-mediated测序开始通过退火共享适配器通用引物序列在每个放大片段(我),然后提供DNA连接酶以及特定荧光标记8-mers,两个基地的3′末端连接荧光探针进行编码的。每个结扎一步是紧随其后的是荧光检测(ii),之后的再生步骤消除了基地的结扎8-mer(包括荧光集团)(3),与此同时准备延长探针新一轮的结扎(iv-vii)。因为每个荧光集团在结扎8-mer识别两种基本组合,生成的序列读取可筛查base-calling错误与真正的多态性或删除单基地,通过调整个人读到一个已知的高质量的参考序列。

4所示。结构转换序列DNA连接酶的反应

节2,我们显然表明,序列比对发现几个ATP-dependent DNA连接酶和核糖核酸之间的同源区域限制酶的五个守恒的主题(我,第三,III a、IV和V)在这些蛋白质。这一事实表明,nucleotidyltransferase总科成员,包括ATP-dependent DNA连接酶,可以共享类似的蛋白质折叠和一个共同的反应机理。接下来,我们将介绍一系列ATP-dependent DNA连接酶的晶体结构和描述的结构和功能了解酶的机制。

4.1。结构的研究ATP-Dependent DNA连接酶

ATP-dependent DNA连接酶表现出相当大的分子大小的变化,包括41 kDa(噬菌体T7) [71年]102 kDa(人类DNA连接酶我(hLigI)) (72年]。尽管如此宽的大小变化,很明显从序列比对,较小的酶构成共同核心结构是守恒的所有ATP-dependent连接(73年]。ATP-dependent DNA连接酶的晶体结构,如噬菌体T7 DNA连接酶(T7Lig)和ATP (8,74年),小球藻病毒DNA连接酶(ChvLig)共价结合AMP (75年),解决了(图9(一个),最高)。这些DNA连接酶采用常见的体系结构两个不同的领域:腺苷酰化作用域(添加)和寡核苷酸/ oligosaccharide-binding-fold域(OBD),共同称为催化核心领域。的催化核心域最小实体nick-joining活动,如ChvLig和T7Lig酶(8,75年]。添加包含催化与AMP赖氨酸残基形成共价键,这是源自于衬底ATP。T7Lig Lys238和Lys240残留物(Lys188和Lys186 ChvLig)内腺苷酰化作用和尼克密封的添加是必不可少的活动(76年,77年]。Lys240残留形式的photo-crosslinking加合物5′末端核苷酸的尼克,暗示其直接参与绑定的磷酸尼克(78年]。OBD是连接到通过守恒的主题添加V (5,79年)和其他类似于DNA和RNA结合蛋白(80年,81年]。OBD nucleotidyltransferase观察到的相关,信使rna限制酶小球藻在催化病毒,经历opened-closed构象变化。酶被发现的OBD领域走向添加并关闭nucleotide-binding口袋(80年,81年]。

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(b)
图9
ATP-dependent DNA连接酶的晶体结构。(一)病毒性和细菌性ATP-dependent DNA连接酶小球藻病毒(左,蓝色)和噬菌体T7(对,黄色)是两个域连接。这些连接了两个截然不同的领域的常见结构,指定为腺苷酰化作用域(AdD)和寡核苷酸/ oligosaccharide-binding-fold域(OBD),共同称为催化核心领域。在这两个结构、催化核心域采用开放形式。DNA连接酶的物种三域分类结构的特点是古细菌(硫化叶菌solfataricus:SsoLig(橙色,左)和海床furiosus:PfuLig(蓝色,右))和真核生物(人类:hLigI(绿色、中心)DNA连接酶。添加包含大部分催化残留物和协助下两个侧翼也与DNA结合域,氨基(DBD)和c端OBD DNA结合域。每个c端螺旋以黄色突出显示(SsoLig)、红色(hLigI)和红色(PfuLig)。这个数字是准备使用嵌合体[105年]。(b)结扎小机制的原理图。结扎前后反应,DNA连接酶采用扩展的构象,如预期的SsoLig晶体结构。在步骤1中,封闭的构象的催化核心领域的羧基末端PfuLig创建一个小隔间,其中包含一个共价结合安培分子。在步骤2中,DNA与衬底的交互必须稳定酶采用结构紧凑,见hLig1绑定到nicked-DNA的晶体结构。最后,DNA链的结扎和随后释放AMP和DNA链DNA连接酶发生在步骤3。

相比之下,三个大型ATP-dependent DNA连接酶的晶体结构,主要结扎冈崎片段之间的缺口在真核生物和古菌DNA复制,和一个额外的氨基端DNA结合域(DBD),已报告(图9(一个),底部)9- - - - - -11,82年,83年]。这种额外的域不是hLigI必不可少的活动在体外(84年,85年),但被认为是关键的检测单割进dsDNA [9]。这两个古细菌DNA连接酶的结构海床furiosus(PfuLig)和硫化叶菌solfataricus(SsoLig)测定在封闭的11)和扩展形式(10),分别。hLigI在复杂的DNA的结构9)表明,这种酶完全环绕nicked-DNA。所有这些DNA连接酶通常由三个领域(DBD、添加和OBD) N C末端的序列。虽然每个域的蛋白质折叠是惊人地相似的三个DNA连接酶,相对域方向在每个酶有很大的不同。

4.2。DNA连接酶分子的结构转变在每个反应步骤

基于上述晶体结构,结扎的机制,提出了示意图如图9 (b)。在解决方案中,DNA连接酶部分采用扩展的形式,如预期SsoLig晶体结构和小角x射线散射(粉煤灰)分析10]。没有DNA和AMP, SsoLig的OBD是转过身来添加在一个开放的构象,类似的晶体结构的紧凑,两个域(AdD-OBD) DNA连接酶小球藻病毒和T7(图9(一个))。封闭的构象的催化核心领域,代表了步骤1的活性构象,观察到在PfuLig的晶体结构,正如前面提出的(10,11]。在步骤2中,酶与底物之间的紧密绑定DNA发生时,所显示的hLigI-DNA复杂晶体结构(9]。这些结构描述三个不同磷酰基转移反应,和灵活的多畴的结构的DNA连接酶促进过程中采用不同的酶构象的反应(图9 (b))[10]。PfuLig叠加的补充道,SsoLig, hLigI透露,OBD的安排相对于每个连接酶的添加明显不同。值得注意的是,的OBD PfuLig紧密绑定到添加和替换在hLigI bound-DNA衬底(图10 ())。带图的添加hLigI PfuLig,连同相邻衬底的表面表示DNA (hLigI)和主题VI (PfuLig),如图所示10 (b)。添加面临的主题VI表面静电分布是负的,说明主题VI是传入的DNA的分子模拟底物(11]。这一发现表明,结扎就可以完成简单的光滑替代基质之间的DNA和主题VI。事实上,在PfuLig的封闭结构,主题VI方法的活性部位没有DNA,而它占据了一个位置在该地区上游hLigI带切口的DNA结构的。

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(b)
图10
叠加带图。PfuLig (a)带状图(2 cfm,蓝色),hLigI (1 x9n,绿色),和SsoLig(2艾滋病、橙),每个连接酶的添加在最大限度地互相重叠。从hLigI DBD和SsoLig都被省略了,清晰。OBD的安排相对于每个连接酶的添加明显不同。值得注意的是,的OBD PfuLig紧密绑定添加和被hLigI bound-DNA衬底(灰色)。(b)的腺苷酸域叠加图PfuLig hLigI,两侧的表面表示主题VI (PfuLig)和基质的上游地区DNA (hLigI),静电分布(正电荷,蓝色;负电荷,红色)映射到分子的表面。由于静电分布在表面附近的添加主题VI和DNA都是带负电荷的,更换主题VI与DNA容易发生。
4.3。接口的强制性域(添加和OBD)酶反应

ATP-dependent DNA连接酶,酶捕获ATP adenylylate赖氨酸残基的第一步,在这主题VI(也是必不可少的27]。主题VI PfuLig提供了几个基本的残留坐落在AMP绑定的口袋里。这个电子密度有利于形成陷阱安培分子(图的隔间11)。特别是R531 K534第六主题,具体在古细菌,真核生物DNA连接酶,导致口袋内的基本的表面(图11)[11]。


图11
上图:AMP-binding口袋里从里面的分子。创建solvent-accessible表面没有绑定AMP,最后精制AMP模型叠加。共价结合安培是被困在一个封闭的车厢,这符合安培分子的形状。在洞底:表面表征活性部位的口袋里。表面图案VI是彩色的青色。绑定AMP被描绘成一个球体模型。磷酸(磷、橙色;氧气,红色)组可见通过一个小“退出”。

AdD-OBD相互作用表面的静电势分布(图12)透露,主要的电荷分布在每个表面电荷相反,这可能参与稳定的封闭构造两个催化核心域(11]。有一个小口袋的退出关闭两个域(图的构象11),出口的直径大约是5.5,可以容纳PPi分子而不是AMP一半。出口可以自发释放的PPi产品。这个概念是一致的DNA连接酶的事实海床horikoshii超过90% PfuLig相同,不能使用河畔+作为一个核苷酸辅因子(86年),因为口袋太小了,容纳的烟酰胺环释放活性部位。据推测,这紧凑的“反应室”PfuLig是专门设计来完成转换过程从ATP在封闭的口袋(AMP11]。


图12
静电分布的相互作用表面添加(底部,左)和OBD(底部,右),哪一个的离子相互作用对(Arg414和Asp540)作为球体模型突出显示。
4.4。c端螺旋的角色通常观察到古细菌和真核生物DNA连接酶

的整体架构三个领域hLigI和PfuLig相似(图9(一个)),尽管身份hLigI相应片段之间的序列和PfuLig适中(32%)。晶体结构和序列分析表明真核和古细菌DNA连接酶具有c端螺旋图案后不久VI(数字9(一个)和(13日))。序列扩展窝藏c端螺旋守恒在真核生物和古细菌DNA连接酶,而病毒的连接(小球藻病毒(ChV))和噬菌体(噬菌体T7 (T7)缺乏长期扩展(图(13日))。c端螺旋位于边界的添加和OBD的封闭结构PfuLig [11]。hLigI而言,这种螺旋是遥远的从域界面,因为DNA衬底(图9(一个))。事实上,DNA-hLigI之间的结构比较复杂,PfuLig认为c端螺旋可能起到至关重要的作用在从紧闭的形式转向DNA-substrate-bound形式。PfuLig连接c端螺旋的添加和OBD通过五道极或离子相互作用(图13 (b))。这个特性表明,螺旋可能发挥重要作用在稳定的封闭构象催化核心域在步骤1。

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图13
角色的c端扩展螺旋。(a)序列的排列图案VI和c端扩展。从病毒的序列DNA连接酶(ChV,小球藻病毒)、噬菌体(T7噬菌体T7),古生菌(Pfu,海床furiosus;Tko,Thermococcus kodakaraensis),人类(hu1,人类的DNA连接酶I)和酵母(那么,酿酒酵母DNA连接酶I)是一致的。主题六世的地区是阴影,扩展螺旋区域,由晶体结构PfuLig hLigI,色红(残留在Q902 hLigI并不包括在之前报道的晶体结构和灰色)。(b)的立体图界面的添加和OBD PfuLig。球棍模型代表了氨基酸残基参与两个域之间的交互:基本,酸性,和极地残留是蓝色,红色,紫色。c端螺旋用红色表示。虚线表示极地或添加和OBD离子之间的相互作用。

5。工程DNA连接酶与改进能力

节中描述3、DNA连接酶在分子生物学是许多应用程序的关键。提高酶的能力,比如尼克密封效率或忠诚,将提供更好的性能在当前方法ligase-mediated突变检测和门店,如上所述。许多改进的DNA聚合酶已报告(87年- - - - - -89年),而更少的以DNA连接酶。这里我们描述一些报告DNA连接酶性能的改善。

5.1。改善Nick-Sealing活动融合与古细菌DNA结合域

从T4噬菌体ATP-dependent DNA连接酶(T4Lig)已经发展成为一个nick-sealing酶。它还可以加入双链DNA (dsDNA)碎片与凝聚力的目的(90年]。此外,它是唯一的商用DNA连接酶,可以加入blunt-ended DNA工器在体外没有高分子增强剂,如聚乙二醇(91年,92年]。凝聚力的结扎反应或blunt-ended dsDNA碎片是上天的先决条件,这就要求在体外结扎共同适配器的序列。然而,片段的营业额数据加入反应的T4Lig低于尼克•密封和T4Lig大约是五个数量级低效率的加入blunt-ended工器比nick-sealing [92年,93年]。T4Lig也是低效的悬臂与单基地切断片段(94年]。穷人片段加入T4Lig常常会导致门店活动失败。为了提高效率的片段加入T4Lig,威尔逊等人构建各种嵌合体T4Lig融合从其他酶与dna结合域(92年]。这种突变策略受到以前的报告,在一个序列的基因融合的非特异性(Sso7d从古细菌DNA结合蛋白质硫化叶菌solfataricus)Pfu DNA聚合酶导致大幅持续增加和提高性能在聚合酶链反应(PCR)扩增(88年]。融合的T4Lig Sso7d显示性能增加了60%在T4Lig blunt-ended片段的克隆92年]。

5.2。改善耐热性的DNA连接酶的定点诱变的忠诚

DNA连接酶的特异性是利用电感电容电阻测量和存贷比分析区分单基地变异与遗传疾病相关。的结扎富达T4Lig提高亚精胺的存在和高盐、低连接酶浓度(6,34]。然而,T4Lig保真度的增加通过调整反应条件是不够理想的检测单核苷酸多态性(6,34,95年,96年]。耐热性的DNA连接酶水生栖热菌(聚合)和栖热菌属酸奶(t)表现出比这更大的忠诚报告T4Lig [39,97年]。结扎反应在较高的温度下防止基板不匹配的杂交过程。罗等人报道的进一步改善富达TthLig的定点诱变。DNA聚合酶的忠诚是减少了定点诱变与primer-template绑定相关联的主题或exoIII主题(98年- - - - - -One hundred.]。然而,exoIII主题突变体,也被称为“antimutator”菌株,表明增加忠诚的聚合和平衡的活动 核酸外切酶的反应可能会提高整个富达(99年- - - - - -102年]。两个突变体连接,K294R和K294P认同形式,,“碳足迹”增加了~ 4倍和11倍,除了保留尼克密封活动(97年]。

5.3。基于结构突变研究的一个热点DNA连接酶对结扎的改善活动

像在前一节中提到的,耐热性的DNA连接酶是利用电感电容电阻测量和存贷比,需要一个热变性的步骤。然而,耐热性的DNA连接酶具有较弱的结扎活动在较低的温度下(- 40°C),导致效率降低LCR和存贷比程序使用短探针和低熔点的温度。在这里,我们提出一个structure-guided hyperthermostable DNA连接酶的突变分析p . furiosus为了提高连接效率与热稳定性(103年]。节4.4,我们表明,c端螺旋封闭结构中观察到PfuLig连接添加和OBD通过五极或离子相互作用(图13 (b))。相比之下,hLigI的晶体结构和SsoLig显示的相对安排OBD和AdD非常不同于PfuLig(图9(一个))。综上所述,我们假设结合DNA的DNA连接酶底物的效率会增加通过减少离子的添加和OBD之间的相互作用,导致结扎效率提高。之间的交互所涉及的离子残留的添加和OBD选择和变异来创建一系列的突变体中某些离子残留替换或删除。首先,丙氨酸突变体的系列(2 1阿拉巴马州,阿拉巴马州,阿拉巴马州和3),c端螺旋的离子残留的丙氨酸残基取代,准备,一系列的缺失突变体(d4、d8 d15)也被创建。然后这些突变体的初始反应速率测定的最高温度(60°C)。初始反应速率增加的数量根据替换或删除离子残留(图(14日))[104年]。

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图14
Nick-joining野生型和突变体蛋白质的活动。(a)的初始反应速率野生型(WT) K558A阿拉巴马州(1)K554A / K558A阿拉巴马州(2)Q547A / K554A K558A阿拉巴马州(3),c端4 residue-deleted突变d4(圆圈),d8(开放广场),和d15(打开三角形)酶,由时间历程数据表示。(b)初始反应速率WT 3阿拉巴马州,阿拉巴马州D540A / 3, D540A, D540S D540R, D540K。(c) Nick-joining Asp540突变体的活动在每个温度为15分钟。尼克结扎的区段D540A(圆圈),D540S(开放广场),D540R三角形(打开),和D540K(开放的钻石)作为时间的函数。(d) Nick-joining Asp540突变体的活动在每个温度为120分钟。误差棒表示标准偏差( )[103年]。

接下来,我们发现初始反应速率在很大程度上改善当第四离子残留(Asp540)糖基突变,除了3 ala突变(阿拉巴马州D540A / 3)。因此单一的丙氨酸突变Asp540 (D540A)创建和评估结扎的突变效率的影响。的反应速率D540A几乎一样D540A ala [/ 3103年),这表明Asp540的突变的影响占主导地位的改善丙氨酸突变离子残留的c端螺旋。Asp540位于AdD-interacting OBD和表面形式与Arg414一对离子,附近的AMP结合位点的增加(图12)。

一系列Asp540突变体,Asp540丝氨酸(D540S)所取代,赖氨酸(D540K)和精氨酸(D540R),也建造,结扎效率进行评估。因此,D540K和D540R同样的初始反应速率最快的在所有的突变体,其次是D540S,然后D540A,最后野生型(图14 (b))。这些Asp540突变体的连接效率的评价在广泛的温度范围从20到80°C显示D540K和D540R也最富有成效的。因此,我们成功地生成PfuLig突变与高度结扎效率提高广泛的温度范围内,同时保持其有用的热稳定性,通过与一个基本取代Asp540残渣如赖氨酸或精氨酸(数字14 (c)和14 (d))[103年]。

进一步调查的影响与基本渣替代Asp540结扎过程显示,更换了腺苷酰化作用与DNA结合的步骤。这些结果表明,增加的数量基本接近的残留腺苷酰化作用的活性部位是有利的一步,焦磷酸带负电荷的离群的ATP分子活性位点的口袋,改变基本的残渣也有效的添加/ OBD域开放,引起的排斥力Arg540或赖氨酸540和Arg414之间形成的离子对Asp540(图12)[103年]。

6。结论

古生菌生活在极端条件下,即使在80°C的温度范围- 100°C,并产生了许多有用的酶基因技术,如hyperthermostable DNA聚合酶和DNA连接酶。在本文中,我们描述了利用热稳定的共同的DNA连接酶分子生物学协议和DNA连接酶的结构机理示protein-engineered DNA连接酶的一些示例。改进这些酶的潜在有效推进上述现有方法,有利于构建新型生物技术方法。等蛋白质工程策略,融合与其他蛋白质或site-direct诱变基于结构信息,可以促进在未来建设的特定于应用程序的DNA连接酶。人工酶可以提高,基于三维结构,即使他们有自然进化的很长一段时间。

古生菌在极端环境中茁壮成长,这将是非常有趣的学习这些extremophilic生物已经适应了的富达机制克服这些恶劣的条件。因此,古细菌酶将继续扮演重要的角色在未来的研究中,将采用基因技术的许多方面。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢教授k Morikawa博士(京都大学)和美国Ishino(九州大学)的支持。Yoshizumi Ishino支持通过从教育部补助金,日本文化、体育、科学和技术(批准号23310152和23310152)。作者也感激约翰威利& Sons有限公司,允许重用的图(图 从以前的纸)103年]。

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