序列、结构和结合分析Cyclodextrinase (TK1770)t . kodakarensis(KOD1)使用在网上方法

文摘

耐热性的cyclodextrinase (Tk1770 CDase) hyperthermophilic archaeonThermococcus kodakarensis(KOD1)水解环糊精成线性糊精。的顺序Tk1770 CDase从UniProt检索与十六个CD水解酶序列,使用贝叶斯推理系统发育树构建。同源模型Tk1770 CDase构建和优化了分析员v9.14程序。该模型与ProSA服务器和PROCHECK分析进行验证。四个保守区域和催化Asp411组成的三位一体,Glu437, Asp502 GH13家族在催化部位被确定。还额外第五保守区域下游第四区域也确定了。的结构Tk1770 CDase包含一个额外的N′域和helix-loop-helix主题在所有热点CD水解酶是守恒的。N′域包含一个扩展循环区域形成了一个催化域的一部分,扮演着重要的角色在稳定性和底物结合。衬底的对接催化部位显示不同的保守残基参与的交互衬底绑定和es复杂的形成。

1。介绍

酶法水解多糖方法的选择在许多工业过程中由于其效率高、更好的产品的收益率比酸水解。糖苷水解酶被用于处理淀粉,纤维素,半纤维素,环糊精1]。环糊精(CDs)环状低聚糖有六个或多个glucopyranosyl单元通过有关α1,4糖苷键。环糊精与6、7、8 glucopyranosyl半个称为α- - - - - -,β- - - - - -,γ环糊精。在水中cd适应与亲水性组指向一个结构外表面和疏水集团对内部空腔。CDs的内部疏水腔允许他们也被共同的淀粉酶和耐水解形成包含复合物与不同的有机分子(2,3]。cd有许多应用在食品、农业、化妆品和制药工业。CDs的巨大的应用及其水解产物为cd创建一个需要高效和特定的酶水解(2,4,5]。的糖苷水解酶分为14个部族和133个家庭。每个家族由至少两个家庭分享催化褶皱和机制根据数据库的碳水化合物酶活性(6]。家庭GH13(也称为α淀粉酶总科),最大的家庭糖苷水解酶,属于家族GH-H家庭gh - 70和gh - 77。的α淀粉酶家族(GH13)是最重要的家庭工业应用(7- - - - - -9]。虽然有较低的序列相似的酶不同家庭在这个家族中,都表现出一定的结构特点,在进化过程中保守性(10,11]。

家庭GH13进一步分为35亚科至少有26个不同的特异性12),包括α淀粉酶(EC 3.2.1.1),支链淀粉酶(EC 3.2.1.41), glucanotransferase (EC 2.4.1.25)和cyclodextrinase cyclomaltodextrinase (EC 3.2.1.54)。所有这些亚科共同催化域由TIM桶或(β/α)₈与催化三桶13,14)和c端域组成的β只股(10]。许多酶还具有N -碳水化合物和/或c端绑定模块像CBM34 CBM20, CBM41, CBM48 [12,15]。CD水解酶包括cyclodextrinase、糖化酶,neopullulanase水解CD到线性麦芽糊精和麦芽糖(16,17]。最近热稳定的支链淀粉水解酶IIIThermococcus kodakarensis(KOD1)也被报道水解cd到麦芽糖和葡萄糖(18]。超嗜热菌的耐热性的酶有很多优势,包括较高的反应,增加产品产量,降低污染的风险比他们的嗜中温同系物19- - - - - -21]。由于先进的测序技术和快速越来越多的基因组被测序,序列的数量被归类为糖苷水解酶的数量远远超过酶结构或生化特征(22,23]。目前,GH13家庭包含26287个序列只有99结构已经得到解决24]。直到写这工作的日期,蛋白质数据库只包含六个CD水解酶(PDB id: 4电弧炉、1 ea9 2谢,1 j0h 1 h3g,和1 bvz) (6]。需要更好地了解这些蛋白质的序列和结构组件cdas及其催化机理。生物信息学的方法可以作为一个有价值的预测工具来提供这些酶的结构和功能的信息。

在这个工作我们已经使用一个在网上方法来提供洞察序列、结构组件,域安排,催化机制和es交互的高温cyclodextrinase (Tk1770)Thermococcus kodakarensis(KOD1),一种潜在的工业应用。这项研究提供了第一次尝试使用在网上方法来提供洞察的结构和催化机械关键部件cyclodextrinase (CDase)t . kodakarensis。

2。材料和方法

2.1。序列检索、比对和系统发育分析

的氨基酸序列(UniProt ID Q5JJ59) CDaset . kodakarensisKOD1 (CDase-Tk;从UniProtKB Tk1770)检索。爆炸序列相似性搜索进行了反对UniProtKB找到Tk1770的同系物。从爆炸结果16个不同序列的CD水解酶细菌和archeal来源(表被选中作进一步研究1)。的排列顺序进行Clustalω和根树生成使用贝叶斯推理方法使用默认参数(25,26]。

2.2。同源性建模

的Tk1770 CDase受到NCBI BLAST对RCSB PDB(蛋白质数据银行)搜索合适的模板比较建模(s)。多个x射线晶体结构(PDB ID: 4西元1 j0h 4爱意,1 ea9 1 sma和1 wzl)与序列的身份从56%提高到29%,分别被选为模板(表2)。目标(Tk1770)和模板的序列与Clustalω使用UGENE程序(25]。对齐和PDB结构被用作输入同源性建模与分析员v.9.14 [27]。模型优化是由变量目标函数方法(VTFM)和共轭梯度(CG)和分子动力学(MD)模拟退火(SA)方法(27,28]。生成的模型分析员得分的基础上他们的涂料(离散优化蛋白质能量)值和模型与涂料最低分数被选中作进一步研究。同源模型进一步验证了ProSA-web服务器和PROCHECK [29日,30.]。分析员循环的模型细化再细化功能和验证的信心。因此,一个可靠的模型构造和可视化使用PyMOL [31日]。

2.3。分子对接研究

为了研究es交互,基板的对接(α- - - - - -,β- - - - - -,γ环糊精)的活性口袋Tk1770进行了使用AutoDock和球型工具v1.5.6 [33]。基质是由添加极地氢原子和部分费用。制备的蛋白质模型添加极氢和Gasteiger指控。活性位点周围的网格地图维度设置与所有其他参数设置成默认和刚性对接。候选人提出了基质的得分的基础上他们的结合能千卡每摩尔和最好的姿势与结合能最低(千卡每摩尔)被选中。

3所示。结果与讨论

3.1。序列比对和系统发育树

Tk1770由656个氨基酸组成的序列与十六个CD GH13家族的水解酶(图1)。这些序列包括11 archeal酶和5细菌酶与Tk1770序列的身份从28%到60% CDase(表1)。所有酶具有三个主要领域(我)一个N-domain, (ii)催化蒂姆桶,(iii) C-domain [10,34]。序列分析表明,archeal酶含有两个氨基端域(即。,N′- and N-domain) in addition to the catalytic and C-domains, whereas the N′-domain is absent in all the bacterial CD hydrolyzing enzymes (Figure1)。链接器区域残留190年至203年在Tk1770连接两个氨基端与两个c端域域。四个GH13保守地区的家庭在蒂姆桶结构被确定从残留299年到310年,405年到414年,433年到441年,和496年到502年催化三分子Asp411, Glu437, Asp502。额外的氨基酸保守地区533 - 539年也确定下游I-IV守恒的地区。

建立系统发育树是由校准用MrBayes率矩阵摇(固定)发现进化关系。树分为三个演化支与所有细菌酶形成一个进化枝和archeal酶分为两个演化支(图2)。树显示Tk1770 CDase更接近于THEGJ激射微波和THES4 cdas序列的59%和60%,分别为(图2)。的STAMFα淀粉酶显示28%序列身份Tk1770 CDase和作为外群的系统发育树。的α-amylases通常不会表现出CD水解活动,他们也缺乏N′域。的α淀粉酶(STAMFα淀粉酶)美国绿在这方面是相当独特的展览CD水解活动和额外的N′域(35]。它表明,在进化的过程中存在N′域可能与CD古生菌水解活动。

3.2。同源性建模

同源建模程序分析员v9.14 [27)是用于构造3 d结构Tk1770与多个模板中描述的材料和方法。与最低的5个模型生成的最佳模式涂料值被选中。

在同源性建模,有时模型可能包含某些高能循环或残留不寻常的几何。因此,模型选择精制使用分析员内置loop-refinement函数循环从3到7个氨基酸长度,然后用ProSA-web验证服务器和PROCHECK分析(30.]。模型的总体质量被ProSA服务器的估计分数进行比较得分值的实验解决蛋白质结构的蛋白质数据银行(29日]。拉马钱德兰情节验证nonglycine, nonproline残留在允许的区域和87.9%的残留在最有利的地区。这个验证所有残留表现出准确的立体化学的位置。

同源模型Tk1770 CDase是一致的p . furiosusneopullulanase (PYRFU NPase) (PDB ID: 4时)进行分析和比较的活性部位和其他结构特点。的整体结构Tk1770 CDase折叠成四个主要领域有两个β(即只链氨基端域。,N′- and conventional N-domain), connected to TIM barrel (A-domain) and a C-terminal domain, also consisting ofβ链。N′的结构域的Tk1770通常代表CBM48 8β链(15,36]。N′-或CBM48域的结构对齐Tk1770和PYRFU NPase透露,都包含一个循环,延伸到催化部位。然而,扩展循环N′域的PYRFU NPase形式更灵活的螺旋转相比Tk1770循环(图3)。替换P91和扩展循环地区S92 Tk1770代替K89和G90循环PYRFU NPase可能负责这个明显减少循环的灵活性在N′域的Tk1770(图3)。此外,K89 G90,长循环的N′域在PYRFU NPase形成强氢键和D460 E470催化部位。在Tk1770 S92 D460只能使一个氢键,从而减少N′之间的相互作用域和催化领域。此外,S92与Y93 Tk1770向后旋转形成氢键,使循环更加僵硬。所有这些因素可能导致Tk1770减少酶的稳定域。最近,据报道,最适宜温度,Tk1770 CDase 65°C,这是最佳生长温度相比要低得多t . kodakarensis(85°C)和其他archeal CD水解酶的最适温度(37]。

(β/α)₈桶(域)也包含了一个更大的B-domain之间β链从残留3和阿尔法螺旋3 306到403。的B-domain archeal酶具有helix-loop-helix(通过)主题扩展活性部位(图的入口处3),但这通过主题缺席在所有5个细菌酶如图1。据报道,为了保持活动在高温下古生菌可能适应额外的结构特点。这些特性包括N′域循环扩展到催化部位,通过主题为基质提供所有必需的组件绑定和催化作用的单体(35,38]。

3.3。对接底物的催化部位

基板的对接提供的催化部位在es复杂的相互作用的信息。为此,AutoDock码头环糊精,也就是说,α- - - - - -,β- - - - - -,γ环糊精,的活性部位Tk1770 CDase模型。的所有构象配体生成的AutoDock得分的基础上他们的结合亲和力千卡每摩尔。最好的姿势α- - - - - -,β- - - - - -,γ环糊精与结合能的选择−8.8−6.1,分别和−7.8千卡每摩尔。

对接的结果表明,除了交互残留,一些残留和基质挨得很近,特别是疏水残基像Y93 F95, F373 F374, V376。在对接的情况下α环糊精、残留D502 R550, S375与羟基形成氢键的底物(图4)。在我们的同源性模型中,K94 N′的循环扩展域形成盐桥E504从活性部位和可能导致两个域的稳定性,以同样的方式观察到公园等人在淀粉酶/ neopullulanase(4时)p . furiosus(38]。然而,对接βcd显示强烈的K94交互与羟基的衬底和E504(图4)。同样,对接γcd显示交互的K94、R97 K364衬底(图4)。螺旋区域的氨基酸K364通过主题延伸到活性口袋的入口F373 F374和可能有一个以上的指导作用底物的活性部位。芳香族氨基酸关口,Y93 F95似乎形成边界墙的活性部位和K94突出在archeal催化部位的入口是守恒的同系物,STAMF除外α淀粉酶。

4所示。结论

从hyperthermophilic Cyclodextrinase古生菌t . kodakarensis水解环糊精为线性麦芽糊精。CD水解酶的序列比对证实,古生菌开发了一个额外的N′域和helix-loop-helix(通过)主题的B-domain缺席在所有细菌同源染色体。同源模型构造显示循环连接β链7和β链8 N′域扩展到催化部位(域)和在衬底中扮演一个重要的角色绑定。残留关口,Y93 K94、F95 R97扩展循环的N′域的Tk1770 CDase保存在CD古生菌的水解酶。结构模型和模板之间的对齐(4时)表示,P91和S92循环扩展N′域Tk1770可能降低其灵活性和与一个域的交互。这可能有助于减少稳定Tk1770的两个领域。

对接的研究表明,残留K94、R97 K364, S375, D502, E504, R550与基质形成氢键。残留的螺旋K364通过主题扩展入口处的催化基团与底物相互作用,可能参与指导底物催化部位。从这些结果可以推断,archeal CD水解酶催化机械发展的一个扩展N′域不仅构成活性口袋里的一部分,但是在衬底绑定也起着重要的作用。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突的存在。

作者的贡献

Imtiaz沙菲克拉姆赞•阿里和默罕默德的贡献同样的纸。

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