古细菌核酸连接酶及其潜在的生物技术

文摘

催化磷酸二酯的形成与他们的能力联系,DNA连接酶和核糖核酸连接酶是必不可少的工具,许多分子生物学技术和生物技术。目前,T4噬菌体的核酸连接酶是广泛使用在这些协议。在本文中,我们认为,从池古生菌代表着大量未开发的核酸连接酶的酶与多样化和潜在有利的新的和新兴生物技术的应用程序的属性。我们总结知识的当前状态古DNA和RNA连接酶,使视信息的相对稀缺在体外活动最相关的生物技术专家(比如加入钝或cohesive-ended,双链DNA片段)。我们强调现有的生物技术应用的热点DNA连接酶和核糖核酸连接酶。最后,我们注意到最近的实验中,蛋白质工程是用来修改DNA连接酶的活动海床furiosus和RNA连接酶Methanothermobacter thermautotrophicus,从而证明在这一领域进一步研究的可能性。

1。介绍

DNA和RNA连接酶无处不在的酶催化磷酸二酯键的形成之间的对立的5′磷酸和3′羟基末端在核酸1- - - - - -3]。他们的活动是至关重要的中央生物过程,包括DNA复制和重组,免疫球蛋白基因的重排,和RNA编辑和修复。他们的活动在体外在许多分子生物学的协议也被利用,现代生物技术的关键工具。

RNA限制酶和tRNA连接一起,DNA和RNA连接酶构成核苷酸转移酶总科(4]。总科中所有的酶催化磷酸二酯键形成守恒,三步机制,利用ATP,三磷酸鸟苷,或河畔⁺作为一个高能代数余子式(4- - - - - -6]。在第一步中,亲核攻击α磷酸的辅因子的活性部位赖氨酸产量ligase-AMP中间。其次,AMP转移到5′磷酸的多核苷酸链,导致一个腺苷酸核酸中间(活性部位赖氨酸作为离去基团)。最后,3′羟基组第二多核苷酸链攻击5′磷酸的反对链,加入一个新的磷酸二酯键的两条链和解放AMP。

物种从域古生菌不仅生存下来,但蓬勃发展,在极端的条件下温度、盐度、pH值和压力。在这些极端环境中进化导致古细菌蛋白质生物技术专家的价值属性,包括稳定和活动在一系列比较严厉在体外条件。一个熟悉的例子是广泛使用的海床furiosusDNA聚合酶的聚合酶链反应(PCR) (7),其热稳定性和持续合成也使它有价值的相关协议,如QuikChange诱变(8,9]。在本文中,我们将关注古细菌核酸连接酶。我们对这些酶总结知识的当前状态,包括生物技术的现有应用程序,我们认为他们的活动提供了大量未开发的池用于分子生物学“下一代”协议。

2。DNA连接酶

在活的有机体内、DNA连接酶催化磷酸二酯键的形成在双链DNA单链缺口。这个活动是至关重要的DNA复制过程中维持基因组的完整性,DNA重组,DNA切除修复(2,6]。他们在所有生物是必不可少的,他们通常分为两个家庭根据辅因子特异性。ATP-dependent连接酶(EC 6.5.1.1)通常存在于真核生物,古菌和病毒(包括噬菌体),而河畔⁺端依赖DNA连接酶(EC 6.5.1.2)通常用于细菌和真核病毒。然而,这一规则的例外情况。最明显的是,古细菌物种Haloferax volcanii拥有两个活跃的DNA连接酶:一个ATP-dependent(联赛)和其他河畔⁺端依赖(所栽)[10]。

DNA连接酶在分子生物学和生物技术对大量的应用程序来说都是必不可少的。几十年来,DNA连接酶被用来构造(即重组DNA分子。克隆)和遗传疾病的检测使用结扎连锁反应[11]。最近,DNA连接酶的细菌,水生栖热菌(Taq),已成为重要的吉布森组装。这是一个等温,锅的方法组装重叠的DNA分子不使用限制性内切酶(12]。许多下一代测序方法还取决于DNA连接酶(13,14),样品制备过程中对适配器连接(例如,Illumina公司和454测序)或测序反应本身(固体排序)。

与结扎的能力都有凝聚力,blunt-ended双链DNA分子(15),最常用的DNA连接酶生物技术与T4噬菌体ATP-dependent酶。然而,只有弱活跃的结扎blunt-ended片段(16在65°C),这是不可逆转的灭活。也不活跃在氯化钠浓度高于~ 150毫米。我们假定,耐热性的古细菌DNA连接酶可以适合使用在上述的部分或全部应用程序。例如,结扎连锁反应需要一个连接酶稳定在温度高达90°C,和古生菌可能为生物技术专家提供优越的替代品Taq连接酶对吉布森组装。

3所示。古细菌DNA连接酶

到目前为止,少于25古细菌DNA连接酶已被描述在任何程度上,和一般的数据是有限的而DNA连接酶从其他域的生活(17,18]。表1总结知识的当前状态和凸显了各种各样的属性被古DNA连接酶。数据还包括T4 DNA连接酶、比较。

如上所述,DNA连接酶通常分类根据严格的代数余子式ATP或NAD的特异性⁺。有趣的是,许多古细菌DNA连接酶可以利用多个代数余子式。序列同源性建议的DNA连接酶Thermococcus kodakaraensis, t . fumicolans和t . onnurineus属于ATP-dependent家族(EC 6.5.1.1);然而,在体外描述每个已经表明,他们能够利用ATP或河畔⁺作为他们的代数余子式(19- - - - - -21]。ATP-dependent DNA连接酶Sulfophobococcus zilligii代数余子式时也显示63%的相对活动从三磷酸腺苷三磷酸鸟苷(22]。以外的其他美国zilligiiDNA连接酶、活动与三磷酸鸟苷只有被描述为RNA限制酶(4]。许多古细菌DNA连接酶,包括美国zilligii酶,也能够使用ADP(表1)。

一个假设的未分化的核苷酸特异性的热点DNA连接酶,他们保留特征从古老的ATP - NAD的共同祖先⁺端依赖酶。这位祖先可能ADP用作辅助因子(23),共同ATP和ADP的一半是河畔⁺。然而,它也指出,ADP利用率由DNA连接酶的直接证据是最小的(24]。另一个建议是,ATP是相对不稳定的高温,这为进化提供了选择压力等替代代数余子式高温连接酶的特异性ADP和三磷酸鸟苷(22]。

DNA连接酶采用多畴的架构,以催化磷酸二酯键的形成;然而,有变化的数量和域的身份他们拥有14]。到目前为止,六子古DNA连接酶的结构已经解决,Archaeoglobus fulgidus(25),海床furiosus(26,27),硫化叶菌solfataricus(28),美国zilligii(29日),Thermococcus sibiricus(30.),而Thermococcussp。151931日]。每个酶由三个领域:腺苷酸域(AdD), oligonucleotide-binding域(OBD)和氨基端dna结合域(DBD)。添加包含六个主题(III),我希望,IV, V,和VI)特征的核苷酸转移酶总科(32]。所需的添加和OBD是最低限度活动和他们一起被称为催化核心。氨基DBD是独一无二的真核和古细菌DNA连接酶和被认为扮演角色在维持一个活跃的构象的催化核心,以及扭曲的DNA衬底(33]。

说明的释放34]和DNA-bound [35ATP-dependent连接酶的结构小球藻病毒的重要性凸显了构象变化在DNA连接酶的催化循环。在DNA结合OBD把> 60和180°旋转一个旋转点,为了适应DNA小沟的衬底。没有古DNA连接酶与DNA的结构解决了在复杂;然而,obd捕获采用三种不同的构象(图1)。的美国solfataricus酶表现出一个开放的和扩展的构象的OBD被拒绝添加(图1(一));的整体结构与DNA连接酶从噬菌体T736]。相比之下,Thermococcussp 1519连接酶结构(图1 (b))采用一个中间构象的OBD逆时针旋转在添加了~ 90°与开放扩展形态相比,虽然这旋转不足引入氢键或盐OBD和其他领域之间的桥梁。120°旋转的OBD收益率一个封闭的构象,观察到的DNA连接酶的结构p . furiosus(图1 (c)),a . fulgidus和t . sibiricus。在这些结构c端螺旋(图1),发现第六守恒的主题后,稳定的封闭的构象调停几离子之间的相互作用的OBD和AdD (26]。这个附加螺旋占之间的间隙的添加和OBD古细菌的结构,但它是流离失所的DNA-bound结构人类DNA连接酶我33]。

域热点连接酶结构的安排都大大不同于DNA-bound结构获得了人类DNA连接我和III (33,51),三个领域包围DNA衬底(图1 (d))。新兴的图片是一个构象的灵活性是正确的古细菌DNA连接酶功能的关键。然而,迄今为止,没有结构的热点DNA连接酶与DNA已经解决了在复杂;因此,未知是否释放结构(数据的差异1(一)- - - - - -1 (c))与不同的领域方向当DNA衬底。与催化相关的蛋白质动力学在宿主细胞的生长温度(70 - 100°C)还有待阐明。

4所示。生物技术应用的热点DNA连接酶

鉴于DNA修复他们的主要生理作用,这并不令人吃惊,大多数古DNA连接酶只有被化验密封的能力在双链DNA单链缺口。对生物技术的应用是结扎双链的能力,凝聚力或blunt-ended碎片。这些活动已报告了四个古DNA连接酶。的酶Aeropyrum pernix,Staphylothermus绿,Thermococcussp。1519年,t . fumicolans都被证明执行结扎cohesive-ended碎片。此外,美国绿和t . fumicolansDNA连接酶也可以加入blunt-ended片段(19,40]。因此,似乎进一步描述的热点DNA连接酶应该产生的酶在分子生物学和生物技术的潜在效用。

最直接的应用热点DNA连接酶可能是那些利用高温最适条件(一般50 - 100°C;表1)。例如,DNA连接酶Thermococcussp。1519年是最活跃在60 - 70°C和它能够结扎DNA片段长凝聚力(悬臂12-nucleotide)结束,但不是片段较短(4-nucleotide)凝聚力结束或钝结束(48]。虽然还有待检验,这种组合的属性似乎使它成为一个有前途的工具,吉布森大会(12]。该协议已迅速成为占主导地位的方法限制enzyme-independent组装合成生物学的DNA片段和目前在50°C。我们推测古DNA连接酶,如一个Thermococcussp。1519年,可能推动新方法的发展,保证结扎在更高的温度下(60 - 70°C)将减少不正确的结扎事件源于misannealing悬臂短的片段。

同样,DNA连接酶Staphylothermus绿几乎3 h的半衰期为100°C和催化作用各种连接反应的凝聚力,和blunt-ended片段(40]。这极耐热酶能找到工具在连接酶的连锁反应(LCR)单核苷酸多态性的检测,是能够承受高温变性步骤(~ 95°C)的热循环协议。更普遍,它已经表明,耐热性的蛋白质是理想的蛋白质工程的起点,因为他们有更多的宽容,突变,从而产生更多的功能变异突变比嗜中温同系物(52]。

5。工程改进的古细菌DNA连接酶

尽管无处不在的DNA连接酶在分子生物学,很少尝试了通过蛋白质工程提高它们的属性。到目前为止只有从T4噬菌体DNA连接酶53)和一个古细菌DNA连接酶,从海床furiosus(27,47),有针对性。

Nishida和他的同事们已经成功地利用结构的见解(26提高的活动p . furiosus通过structure-guided诱变DNA连接酶。特别是,他们有针对性的c端螺旋与OBD和添加稳定酶的构象关闭(图1 (c))。开始,五极残留的OBD (Asp540, Arg544, Gln547、Lys554 Lys558),其中每个导致交互与添加、突变为丙氨酸(47]。不稳定的假设是interdomain OBD的交互将有利于增加运动,从而增加活动“解锁”的酶。五选定的残留物,Asp540突变,位于螺旋的n端扩展,产生最大的效果。进一步表明Asp540诱变在这个位置Arg (D540R)替换了最佳的活动,在扩大温度范围(20 - 80°C)。

在概念证明ligation-amplification实验中,作者表明,工程连接酶(D540R突变)在两个温度比野生型。60°C,最大的结扎DNA扩增产品实现与变异,但只有3周期后需要10周期与野生型酶。在30°C,工程酶给最大产品产量ligation-amplification 5周期后,而产品产量与野生型酶只有~ 30%一样伟大,即使10周期(47]。此外,一系列深刻的生物物理学的实验表明,一个带正电的精氨酸残基的引入,在带负电Asp540,加速形成共价ligase-AMP中级和绑定的DNA带切口的衬底(47]。这项工作的基础也是一个获得美国专利,数量8137943。

在后续研究中,同一组最近进一步诱变用于消除离子之间的相互作用的添加和OBD完全(27]。p . furiosusDNA连接酶带着三个点突变(D540R / K554A / K558A),或者D540R +删除最后的四个氨基酸的c端螺旋,就进一步加强nick-joining活动。虽然还有待检验与其他古DNA连接酶,这种设计方法,释放的交互的c端螺旋添加和OBD域,看来,它可能是一个普遍适用的一个增强活动。

6。RNA连接酶

RNA连接酶(EC 6.5.1.3) RNA end-joining RNA酶参与修复,拼接,编辑路径。无处不在的DNA连接酶相比,RNA连接酶系统发育分布窄些。序列相似性搜索发现了RNA连接酶在所有三个领域的生活但只有在物种的一个子集(54]。

RNA连接酶通常分为两大的家庭。Rnl1家族包括同名的RNA连接酶1 (Rnl1) T4噬菌体(3的tRNA连接)和真菌、酵母和植物(5,55,56]。这些酶修复中断引入单链RNA的站点特定的核酸酶。Rnl2家族包含T4噬菌体RNA连接酶2 (Rnl2)和RNA编辑原生动物的连接锥虫属和利什曼虫。这些酶主要是与RNA双由密封裂纹桥接互补链的存在(54,57,58]。而RNA连接酶共享相同的六个守恒的核苷酸转移酶图案作为DNA连接酶,序列保护的总体水平较低。一般来说,这使得家庭分类更加困难和有意义的。

像DNA连接酶RNA连接酶分子生物学也很重要。T4 RNA连接酶1和2已经成为必不可少的一个子集迅速放大的cDNA结束(种族)协议,3′RNA标签,最重要的是,目前,制备微RNA (microRNA)测序库。ATP-dependent RNA 5′之间能够形成磷酸二酯键的连接磷酸和3′羟基末端的大部分使用在这些协议;因此,他们将在以下部分的重点。出于完整性的考虑,我们也注意到,两个热点中的RNA连接酶海床horikoshii也被报道。首先是一个假定的2′5′RNA连接酶的结构已解决(59]。RtcB,第二个是一个不寻常的连接酶连接2′,3′磷酸循环或3′磷酸目的地5′羟基末端。其结构,其机制,及其与新颖的蛋白质交互代数余子式(Archease)最近被详细描述60,61年]。

7所示。古细菌RNA连接酶

第一个详细的古细菌RNA连接酶的生化特性描述在2008年被报道,当一个开放阅读框海床abyssi,以前注释作为DNA连接酶编码,编码RNA连接酶(而不是被发现62年]。以前,它被认为古细菌RNA连接酶可能Rnl2-like酶,他们表现出类似的变体核苷酸转移酶图案如T4 Rnl2 [54]。然而,的结构p . abyssiRNA连接酶是一个略微更紧密的结构同系物T4 Rnl1(二级结构匹配得分为6.4,2.78和RMSD比T4 Rnl2超过200对齐残留物)(得分6.2,2.39表示超过164对齐残留物)[62年]。此外,p . abyssi单链RNA RNA连接酶活跃基质,但不是双链RNA,与T4 Rnl1相似。

与单体的嗜中温连接,x射线晶体学透露homodimeric结构p . abyssiRNA连接酶(62年]。每个单体组成四个领域:一个n端结构域,一个催化领域,二聚作用域和域(图c端2)。催化领域显示结构相似性与其它核苷酸转移酶家族的成员。n端结构域与T4 Rnl1和只在这两个酶被观察到。c端域都是α螺旋,没有结构性同系物,并不认为一个函数。二聚作用域的铜包域结构相似的淀粉样前体蛋白,虽然没有金属结合残留在连接酶(62年]。

二聚的作用p . abyssiRNA连接酶尚不清楚。它提出了可能的两个比较重要的功能对称和同时结扎事件,如拼接和出基因内区螺旋(62年]。更普遍的是,oligomerisation是一种常见的适应与古细菌的蛋白质(thermophily有关64年]。这种策略被认为增加各个子单元的刚度和促进更严格的疏水核心的包装。

到目前为止,唯一的其他古细菌RNA连接酶的特征是一个生化反应的物种甲烷细菌属thermoautotrophicum(63年),现在通常被称为Methanothermobacter thermautotrophicus(65年]。的属性p . abyssi和m . thermautotrophicusRNA连接酶列于表2。

8。RNA连接酶生物技术

除了他们的角色在活的有机体内,RNA连接酶已成为分子生物学的重要工具(66年]。发现T4 Rnl1后不久,建立了新的协议,包括3′端生物素和荧光团标签(67年),RNA连接酶介导的迅速放大cDNA结束(RLM-RACE) [68年],寡核苷酸合成[69年),和5′核苷酸两RNA和DNA(修改70年]。

最近RNA连接酶已经成为小分子核糖核酸的基本构造序列库(microrna)和其他小分子RNA。在图书馆准备,T4 RNA连接酶用于加入5′和3′RNA基质适配器,以便适配器可用于启动序列在逆转录PCR (71年- - - - - -73年]。新兴意识到,microrna小监管rna参与转录后的调控(74年),有大量的生物功能,其misregulation都牵连到许多疾病(75年),意味着大规模筛选已成为一个非常宝贵的工具的发现和剖析microrna的表达。因此RNA连接酶能产生高质量的测序库,代表原始microrna的人口样本,是极大的兴趣。

不幸的是,它已经变得越来越明显,microrna的测序数据集容易严重偏差(76年)和适配器连接步骤是一个关键因素。一个圆形的限制是不必要的生产副产品(66年,76年]。RNA连接酶的进化保存功能在活的有机体内是在RNA发夹环密封缺口(裂解tRNA分子之类的)。在体外,这将导致一个倾向使成圆形RNA基质,防止适配器结扎。T4 RNA连接酶的另一个限制是,他们偏向切断特定RNA序列(77年,78年)会导致误判的microrna的丰富了4个数量级(73年]。这个结扎偏见不是主要的结果序列偏好,而是一个偏见RNA二级结构(79年]。因此越来越多的兴趣描述耐热性的RNA连接酶活跃在温度足以变性RNA二级结构(80年]。

9。古细菌RNA连接酶生物技术的角色

古细菌RNA连接酶发现一些使用分子生物学的协议。的m . thermautotrophicusRNA连接酶腺苷酸的能力单链RNA和单链DNA(表2),它已被用于5′腺苷酸单链DNA适配器用于建设的microrna的测序库(81年]。以前一个化学合成协议(82年)或一个方法涉及T4 DNA连接酶被用于这个腺苷酸的步骤(83年];然而,T4 DNA连接酶没有积累足够的腺苷酸产品和合成方法是昂贵的。另一方面,m . thermautotrophicusRNA连接酶积累大量的腺苷酸中间体(AppRNA和AppDNA)当使用过多的ATP在反应中,使它理想的替代品。这种酶是目前商业化的一个组件5′脱氧腺苷酸工具包(来自新英格兰生物学实验室)。

而m . thermautotrophicusRNA连接酶是高度活跃的5′腺苷酸酶,单点突变(Lys97阿拉巴马州)导致了无法执行腺苷酸的酶,但保留形成磷酸二酯键的能力(81年]。这使得一个两步的开发协议中,野生型酶腺苷酸DNA适配器用于最初的反应。腺苷酸适配器可以孵化池目标microrna分子和突变连接酶。结果结扎preadenylated适配器的RNA基质,没有卷曲的可能性(nonadenylated) RNA (81年]。的能力m . thermautotrophicusRNA连接酶(K97A突变)在65°C函数也有助于消除结扎偏见与RNA二级结构有关。为了实现这个协议,突变酶商业化(耐热性的5′AppDNA / RNA连接酶来自新英格兰生物学实验室)。

10。结束语

在这次审查中,我们总结了当前文献古细菌核酸连接酶。我们已经强调了知识的相对缺乏对这些酶,在讨论特征可能会让他们有价值的增加生物的工具箱,在未来的。特别是,古细菌酶是典型的耐热性的。DNA连接酶稳定和活跃在高温等新兴技术正成为关键吉布森组装合成生物学(支撑)12],而耐热性的RNA连接酶提供的承诺建设公正的microrna的测序库(76年]。此外,古细菌酶的耐热性使他们的理想起点蛋白质工程(52]。最近的实验工程师海床furiosusDNA连接酶(27,47)和Methanothermobacter thermautotrophicusRNA连接酶(81年)展示在这一领域进一步研究的巨大潜力。

总的来说,古细菌核酸连接酶的不同但目前undersampled。我们预计它的进一步勘探将导致新发现的酶分子生物学和生物技术具有有利的特性,进而将推动发展的新方法。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是由一个聪明的想法格兰特从新西兰商业、创新和就业。韦恩·m·帕特里克·卢瑟福的感激收件人发现奖学金。

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