文摘
塞拉多是一个生物群落,对应于巴西24%的领土。最近才微生物群落的生物群落进行了研究。我们首次描述古细菌群落的多样性从淡水湖泊沉积物的塞拉多在旱季和干燥和雨季之间的过渡时期,当第一个暴雨发生。基因图书馆建造,使用古生菌16 s rRNA和特殊引物amoA基因。分析发现标志着古社区之间的差异在两个赛季。I.1a和I.1c Thaumarchaeota发现更多的过渡时期,而微克古生菌在旱季占主导地位。产甲烷菌只发现在旱季。16 s rRNA序列的分析显示低多样性过渡时期。我们发现热点amoA序列在这两个季节,但是有更多的辣子鸡在旱季。这些序列是在同一个集群Nitrosotalea devanaterra的amoA基因。主坐标分析(PCoA)测试显示样本不同季节之间的显著差异。这些结果提供信息在淡水湖泊沉积物的古细菌多样性的塞拉多,表明降雨可能影响这些社区的一个因素。
1。介绍
巴西的热带稀树草原,也被称为塞拉多,对应于该国24%的领土(1)和定义的特点是两个季节:干燥的季节,发生从5月到9月,雨季,发生从10月到4月2]。虽然有一些研究的多样性古生菌在不同的巴西环境3- - - - - -7),对古社区在塞拉多。最近,我们的团队描述了古丰富在塞拉多土壤8),但目前没有报告的多样性古生菌在淡水湖泊沉积物的生物群落。
湖泊沉积物环境中有大量的微生物(高9),受到营养成分的变化与事件相关的沉积物的再悬浮和再沉积表面引起的水流(10]。雨是许多不同的环境因素之一,导致这些事件(11]。尽管有许多研究的多样性古生菌在湖泊沉积物12- - - - - -16),目前没有报告描述的变化造成的社会发生的雨。
氨氧化为亚硝酸盐氮循环有一个重要的角色在全球生物地球化学(17),众所周知,细菌和古生菌都是氨氧化的能力(18,19]。许多嗜中温古生菌发现在土壤、水和淡水沉积物(20.),以前被列为Crenarchaeota,现在被认为是最近提议的成员Thaumarchaeota门(21),包括所有的氨氧化古生菌(AOA)知道到目前为止22]。
我们首次描述古细菌群落的多样性从淡水湖泊沉积物的塞拉多在旱季和干燥和雨季之间的过渡时期,当第一个暴雨发生。八个基因库和测序,获得四个使用古生菌您16 s rRNA基因引物和其他四个amoA特定于ammonia-oxidizing基因引物古生菌。获得的序列分析,以确定是否有不同季节的湖泊沉积物的社区之间的差别。我们的结果显示两种截然不同的社区档案在每个季节,表示一个可能的季节性变化的影响。
2。材料和方法
2.1。学习网站和抽样
沉积物中从一个湖”)(das自始至终维瓦斯,“一个国家公园位于塞拉做Espinhaco,米纳斯吉纳斯州的巴西,在塞拉多生态区。沉积物采样在浅滩Inhancica湾附近的保证金和采样点之间的距离是15米。样品将这里称为RIB-A(17°46 16.21078′′′年代,43°37 35.5481′′′W)和RIB-B(17°46 16.49918′′′年代,43°37 35.94635′′′W)和被认为是复制。样本收集与PVC管直径10厘米通过引入管进入沉积物湖岸附近。沉积物样本从0到10厘米之间的深度检索和保存在冰前储存在−20°C。
旱季样本RIB-A和RIB-B收集5月7日,2010年,因此被称为RIB-A D和RIB-B D之间的过渡时期样本干燥和雨季RIB-A RIB-B收集了9月13日,2010年,并将称为RIB-A T和RIB-B T使用温度计,采样站点的水温。沉积物的pH值测量pH电极。总氮量化了纳氏比色法(23)和总磷被Murphy-Riley量化方法(24]。
2.2。16 s rRNA,amoA基因库建设
环境DNA从0.5 g的湖泊沉积物中提取使用PowerSoil DNA隔离设备(莫生物实验室,Inc .)根据制造商的指示。PCR引物21 f - 958 r (25)被用来放大16 s rRNA基因利用沉积物样品的DNA作为模板。为amoA基因,所使用的引物是拱amoAf和amoAr26]。最初PCR试验条件是一样的。放大DNA琼脂糖凝胶上可视化与溴化乙锭染色(10毫克/毫升)。使用向导扩增DNA片段被纯化菌进行工具包(SV凝胶和PCR清理系统,Promega)和克隆到pGEM T容易(Promega)质粒,根据制造商的指示。重组质粒插入大肠杆菌钙chloride-treated DH5α细胞热休克治疗。插入的存在被克隆的选择与氨苄青霉素(150磅琼脂板补充μg / mL), IPTG(0.5毫米),和Xgal (0.00625%)。质粒提取phenol-chloroform-isoamyl酒精在25日:24:1(卷/卷/期)。桑格DNA测序的方法Macrogen Inc .(韩国)。获得的序列被存入资源库数据集在加入数字KF640285-KF640592 (16 s rRNA基因)和KJ719076-KJ719244 (amoA基因)。
2.3。系统发育分析
16 s rRNA基因的序列被用于比较分析与绿色煤电分类数据库(27),使用Mothur软件(28]。一个阈值的90%或更高的身份与所使用的数据库。16 s rRNA和一致性amoA基因序列进行ClustalX软件(29日]。
Mothur用于过滤所产生的差距列对齐,也用于生成Ace,曹国伟,香农,辛普森索引。16 s rRNA基因序列与序列集群标识阈值为97%的物种,属占95%,90%为类,80%门(30.]。系统发育分析amoA序列基于OTU和标识阈值被认为是90% (31日]。稀疏曲线是由Mothur软件。主坐标分析(PCoA)与Unifrac执行程序(32]。16 s核糖体rna基因的序列从Euryarchaeota隔离,Crenarchaeota, Thaumarchaeota, Korarchaeota以及无教养的序列古生菌基因库中发现数据集被用来构建系统树与大型软件(33),使用最大似然方法,引导值1000和田村核苷酸替换模型。
3所示。结果与讨论
所有的沉积物分析本研究是6厘米深;因此,他们最近的沉积物层沉积(34]。所有的样品提出微酸性pH值(表1),这可能是由于氢离子解放在中由微生物代谢和有机物分解(10,35]。沉积物在过渡期(RIBT)获得更高价值的总氮和磷相比,获得的样本在旱季(肋D)(表1)。正如前面提到的,环境因素如降雨的发生影响湖泊沉积物中的养分含量(11),这就可以解释每个赛季样本之间的差异。塞拉多的土壤已经表明,季节影响微生物群落的变化(36),目前的研究表明,这些变化也会影响淡水湖泊沉积物中的微生物群落。
四16 s rRNA基因克隆库建立了:两个复制旱季古社区(RIB-A D和RIB-B D)和两个干燥和雨季之间的过渡时期古社区(RIB-A T RIB-B T)。这导致308序列(75序列从RIB-A D, 70序列RIB-B D, 75序列RIB-A T和88序列从RIB-B T) phr质量高(> 20)和大小超过400个基点。此外,四个热点amoA图书馆是来自相同的样本,导致169序列phr高质量(> 20)和大小超过300 pb。样本amoA-A D (RIB-A D)包含43序列,amoA-B D (RIB-B D) 44序列,amoA-A T (RIB-A T) 42序列,amoA-B 40 T (RIB-B T)序列。
使用序列相似物种的97%或更高水平(30.),我们的结果显示一个大数量的差异在不同季节(表样本辣子鸡2)。我们能够探测到85年旱季辣子鸡(肋D)和25个辣子鸡干之间的过渡时期和雨季(肋T),表明在旱季更高的丰富性。这是进一步观察到丰富的索引,Ace和曹国伟,这两个估计更多的预测为旱季辣子鸡。辛普森多样性指数,香农和,也表明更高的多样性沉积物古社区发现在旱季。同样,稀疏曲线(图1)显示一个高原过渡时期样本甚至16 s rRNA基因序列相似性为97%水平,虽然没有达到高原沉积物样品的旱季,表明在旱季更高的丰富性和多样性。微生物多样性的变化通常是有关营养的变化可用性由环境因素引起的,包括存在的氮和磷酸盐肥料在土壤和季节性变化37- - - - - -44]。基于提高总氮检测在过渡时期(表样本1),我们可以推测,这些样本的多样性减少观察是由于氮的可用性更高,这可能一直青睐选择组和有害生物,其他研究中描述(45]。
(一)
(b)
PCoA(图2)被用来评估社区之间的相似之处古生菌在样品分析。这一分析表明,复制从同一季节分组,而样本检索在不同季节有显著差异,表明季节变化的一个可能的效果。随着Libshuff试验也得到了相似的结果(数据没有显示)。大多数辣子鸡是样本之间共享相同的季节,而很少有辣子鸡(表之间共享样本不同的季节3),进一步表明两个明显不同的社区档案。整体多样性下降在过渡时期不同于其他的研究发现。一项研究Cruz-Martinez et al。43)表明,雨几乎没有对加州土壤微生物群落的影响。然而,缺乏微生物多样性研究的环境中自然干燥的和多雨的时期,需要更多的研究来完全理解生态动力学在这些类型的环境中。
根据绿色煤电分类数据库,所有16 s rRNA的基因序列古生菌域。值得一提的一个方面是,虽然这个数据库认为Thaumarchaeota Crenarchaeota门的一个类,我们分类Thaumarchaeota门所显示的分类水平Brochier-Armanet et al。21]。古细菌社区两个赛季明显不同的成分,甚至在门级(图3)。142序列,旱季样本(肋D)主要crenarchaeotal序列(80.28%)。根据数据库,80.70%的crenarchaeotal序列pGrfC26秩序。这群人被认为是一个杂项crenarchaeotic集团的一部分(MCG) [46]。MCG古生菌可以发现在不同的栖息地,从陆地到海洋环境(47,48]。然而,这组有趣的是被认为是最丰富的团体之一沉积物生物圈(49]。同样重要的是要注意,MCG集团没有明确归属的古细菌类群,并建立一个不稳定的分支顺序16 s rRNA树(50]。目前没有培养分离出这组和对角色的这些生物在生物地球化学循环46]。在种系发生树构造序列代表每个OTU季节(图(97%)4),MCG旱季序列集中在一组只有无教养的序列从其他研究检索,这是预期。在旱季也可以检测序列分为Euryarchaeota(17.60%),其中9人隶属于产甲烷组。产甲烷古生菌通常描述的淡水湖泊沉积物(51- - - - - -54),有限的氧气和大量的有机物质(55]。这可以在种系发生树(图中也可以看到4),两个旱季序列(RIB-B D47和RIB-B D13)与产甲烷古生菌。沉积的沉积物层分析最近可能占产甲烷的数量少古生菌发现我们的样品虽然不能排除底漆的偏见(56,57]。我们能够检测序列分为Thaumarchaeota很少(1.41%)或非保密古生菌在旱季(0.71%)样品(图3)。
有趣的是,在样本之间的过渡期干燥和雨季(肋T)我们能够检测主要序列隶属于Thaumarchaeota门(61.35%)(图3)。所有其他序列都隶属于Crenarchaeota门(38.65%)。在种系发生树(图4),过渡时期序列主要是集群Thaumarchaeota门,例外序列RIB-B T77和RIB-B T83,集群的微克。89和RIB-BT87序列RIB-BT代表更高数量的序列中是一致的。集群。这一组是由生物最初描述在水生环境中(58]。所有其他过渡时期序列的一部分。组,其中包含生物发现在酸性的土壤中50]。众所周知,塞拉多土壤酸性pH值(2和我们组最近报道的存在。在这些环境中Thaumarchaota [8]。鉴于只有过渡期序列被发现在这个组和边缘附近的沉积物被检索,这是似是而非的雨造成附近的土壤浸出保证金入湖中。我们不能发现任何成员Euryarchaeota门的过渡期。据报道,氨氧化是普遍的成员Thaumarchaeota门(22,59),在这个意义上,大量的序列的检测隶属于Thaumarchaeota可能与总氮的增加之间的过渡时期和雨季样本(表干燥1和数字3和4)。另一方面,没有成员Euryarchaeota门过渡时期的沉积物也可以抑制甲烷生成的结果由含氮化合物(60,61年]。也值得一提,最没有文化的序列相似度高的在目前的研究中所发现的从淡水水生环境或土壤与大量的水(图4)。
测序的amoA产生87序列旱季样本和82年从过渡时期样本序列。多样性分析显示更高的数量amoA基因辣子鸡(抽泣)在旱季(表4)。这个数据是符合更高的多样性发现16 s rRNA旱季的基因。然而,16 s rRNA基因克隆库未能揭示这个Thaumarchaeota多样性,因为只有1.41%的序列的旱季被认为Thaumarchaeota门。这个结果显然强调了使用多个基因的重要性来描述特定的微生物组从自然环境21]。另一个因素可能占大部分的系统发育多样性减少amoA序列是当我们16 s rRNA基因分析显示整体高多样性只有四个辣子鸡聚集在一个证实ammonia-oxidizing组。(21,22)(图4)。
的amoA系统发育树构建(图5)显示我们的大多数序列在同一集群Nitrosotalea devanaterra的amoA基因。这是有趣的,因为最丰富的核糖体rna 16 s基因序列也聚集接近这个有机体(图4)。n devanaterra第一次被描述在酸性农业土壤和被报道为chemolithotrophic专性嗜酸性土壤氨氧化剂(62年]。类似于我们的研究结果,研究农产品协定的多样性显示序列类似于高山湖泊n devanaterra在水生环境中(63年),提出了一个系统为低pH值的自适应机制环境保护(64年]。然而,生态的作用古生菌在淡水环境中仍知之甚少(65年- - - - - -67年]。与16 s rRNA系谱树一样,最多amoA无教养的序列相似度高的来自含水量较高的环境。
虽然样本的数量分析强加限制,本研究首次描述的多样性古生菌在塞拉多的淡水湖泊沉积物,并提供证据表明,雨水可能会影响古细菌多样性在这些环境中。这可以得出结论,因为减少了样本的多样性之间的过渡时期和明显不同的热点社会成分的季节。沉积物的再悬浮和再沉积表面的事件,可能是由于下雨改变营养成分(也就是说,氮和磷),进而可以影响微生物群落。未来的研究基于多采样地点和使用定量方法将进一步调查这些事件和更好地理解的生态角色古生菌在这些环境中。
4所示。结论
我们得出结论,雨的发生可能是一个因素影响淡水湖泊沉积物的古细菌社区。我们能够观察到更高的丰富性和多样性的生物在旱季和几个序列被产甲烷成员。产甲烷的减少古生菌在干燥和雨季之间的过渡期可能是由于氮的增加,抑制甲烷生成。的更高比例的生物Thaumarchaeota门也可以解释为这营养含量的变化。而在这两个季节的存在amoA基因被发现,更多的辣子鸡、旱季中可观察到在这两种情况下这些序列更相似Nitrosotalea devanaterra的amoA基因。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者要感谢阿德里亚娜·费尔南德斯为检索湖泊沉积物样品。本研究从CNPq赠款支持,FAPDF, DPP-UnB。t·罗德里格斯承认斗篷的奖学金。