比较分析产烷生物多样性的马和马驹使用mcrA基因和古细菌16 s rRNA基因克隆库

文摘

产烷生物成分的比较分析粪便的马和小马是由建设α亚基的甲基coenzyme-M还原酶(mcrA)基因和16 s核糖体RNA基因(16 s rRNA)克隆库。的mcrA克隆库分析表明Methanomicrobiales主要在马和小马。此外,大多数的16 s rRNA基因的克隆库显示Methanomicrobiales也主要在马和小马,但LIBSHUFF分析表明,马和小马库明显不同()。大多数操作分类单位(辣子鸡)显示低相似性识别的产甲烷菌mcrA和16 s rRNA克隆库。结果表明,马和小马港不明和新颖的产甲烷菌后肠。产烷生物的人口比小马马高;然而,厌氧真菌人口相似的马和小马。产烷生物多样性是不同的两个品种的科仕caballus。

1。介绍

马科家族的成员,如马和小马,拥有更好的解剖专业后肠微生物生态系统组成的细菌、原生动物和瘤胃厌氧真菌能够降解和发酵的植物细胞壁的结构多糖(1]。此外,产甲烷菌,减少有限公司₂与H₂形成甲烷也是常见的马科(后肠的居民2]。

迄今为止,许多研究已发表在马的后肠微生物多样性和小马。这些研究包括细菌的多样性(2- - - - - -9),原生动物(3,9),和瘤胃厌氧真菌3]。然而,只有有限的信息可以在马的后肠产烷生物人口10]。许多研究已经进行了分析成分和人口规模的反刍动物的瘤胃产甲烷菌和其他类型的食草动物(11- - - - - -24]。这些研究表明,产甲烷菌隶属于Methanobacteriales, Methanomicrobiales, Methanoplasmatales [25是反刍动物的瘤胃的主要成分。产烷生物的信息密度和多样性后肠的马和小马是重要的充分理解后肠微生物生态系统。

在瘤胃微生物群落的多样性受到许多因素的影响,如地理位置、环境、饲料成分,喂养频率、补充剂、动物物种,动物个体在一个物种的遗传背景26]。在马的后肠微生物群的构成可能取决于后肠容量反映体型甚至马品种(9]。

本研究旨在比较分析和古细菌16 s rRNA基因mcrA基因在匹纯种马和日本当地小马一直在同样的管理。

2。材料和方法

2.1。动物,饮食,和样本收集

六匹纯种马和3成熟成熟的日本当地的小马被用于这项研究。每只动物的性别与年龄如下:马1(去势,17),马2(女,12),马3(去势,17),马4(去势,12),马5(去势,14),马6(女,14),小马1(去势,4),小马2(去势,10),和小马3(去势,7)。动物每天定期喂食两次盖干草,大麦、米糠,比例为2.0:1.5:1.0公斤的马和1.5:1.0:0.5公斤的矮种马。用盐和钙补充剂和水是可用的随意。动物被用于艺术和执行每天早上练习马术在同样的管理。确定微生物种群和产烷生物多样性,刚废弃的粪便样本收集和交付期间保持在4°C到实验室,然后储存在−25°C。

2.2。pH值和实时PCR分析总细菌、产烷生物,瘤胃厌氧真菌种群

5克的粪便是与20毫升蒸馏水和均相混合,和它的pH值测量使用玻璃电极(27]。剩下的粪便被用于DNA分析和保持在−80°C。使用QIAamp DNA的DNA提取粪便工具包(试剂盒,Inc .,瓦伦西亚、钙、美国)根据制造商的指示。基因组DNA浓度调整到10 ngμl⁻¹并存储在−25°C到分析。

实时PCR分析文学教学,PCR引物,用于本研究如表所示1。实时PCR扩增和检测进行了使用ABI棱镜7000序列检测系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。进行了PCR反应混合物中最后一个25的体积μ包含10 L ng模板DNA, 12.5μL SYBR绿色主混合(应用生物系统,促进城市、钙、美国),和4.5μ正向和反向引物(0.5 Lμ产烷生物的L(正向和反向引物)。放大由1循环95°C的聚合酶激活10分钟紧随其后40变性的周期在95°C 15秒和60°C 30年代。产品尺寸是经琼脂糖凝胶电泳后的决心。标准16 s rDNA片段的DNA制备大肠杆菌克隆pCR 2.1向量。产烷生物样本得出的标准准备从治疗池DNA组社区(17]。该基因片段编码mcrA从牛瘤胃被克隆到pCR 2.1向量。标准为真菌DNA制备纯培养的ITS1片段Neocallimastixsp.应变SR 6克隆pCR 2.1向量中描述伦et al。28]。从这些克隆的DNA被用作PCR产品标准。使用QIAquick放大标准dna纯化PCR净化设备(试剂盒,Inc .,瓦伦西亚、钙、美国)和量化分光光度法(260海里)。标准是连续稀释10倍和实时PCR之前就做好了准备。所有测量进行了一式三份。

2.3。放大的热点16 s rRNAmcrA基因

DNA样本每个动物都汇集到每个动物品种1部分。的mcrA特殊引物在卢顿描述等。31日)和古细菌16 s rRNA基因引物(30.)(表1)被用于DNA扩增。PCR反应混合物(25μL)包含1.0μ0.5 L的模板,μ每个引物,200μM核苷酸混合物,1×前任Taq缓冲区,0.5毫克/毫升BSA和0.625单位Taq交货。PCR进行了热循环(骰子TP 600;豆类,大津,日本)与下列条件:初始变性在95°C 3分钟热点16 s rRNA基因和94°C为2分钟mcrA在94°C基因,变性了30年代,72°C的90年代伸长16 s rRNA基因和30年代mcrA基因,最终在72°C扩展了10分钟。退火温度和循环的数量如表所示1。1.0%琼脂糖凝胶上电泳后Tris-acetate EDTA缓冲区,PCR产品被溴化乙锭染色可视化。

2.4。克隆和测序

PCR产品被克隆到PCR 2.1向量使用助教克隆工具(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。积极的转化株被随机选择,和克隆的DNA片段测序,被松井等。32]。同源性搜索的热点16 s rRNA基因序列和推导的氨基酸序列mcrA进行了爆炸N和爆炸X程序(33]。嵌合工件的PCR检查CHECK_CHIMERA在线程序的核糖体数据库项目(RDP-II)和省略了从分析34]。

2.5。系统发育分析

古细菌16 s rRNA基因推导的氨基酸序列mcrA基因与Clustal X版本。2.0 [35使用neighbor-joining],系统发育树构建方法(36]。分支机构的稳定性进行了分析与1000引导程序复制。操作分类单元(辣子鸡)、丰富性的观察((1),和Shannon-Wiener指数()使用DOTUR计算程序(37]。98%的序列相似准则采用OTU 16 s rRNA基因序列。OTU的标准mcrA从相关性计算吗mcrA序列距离和16 s rRNA基因序列距离获得产甲烷菌后提出的23个物种从7订单包括Methanoplasmatales保罗et al。25];加入的数量mcrA基因和16 s rDNA显示在括号后物种名称;Methanobacteriales顺序:Methanobrevibacter gottschalkii(EU919431 / U55239),Methanobrevibacter millerae(EU919430 / NR_042785),Methanobrevibacter ruminantium(AF414046 / NR_042784),Methanobrevibacter smihii(NC_009515 / AY196669)Methanobrevibacter woosei(EU919432 / NR_044788)、订单Methanomicrobiales:Methanocorpusculum bavaricum(AF414049 / NR_042787),Methanocorpusculum labreanum(AAP20896 / NR_074173),Methanocorpusculum以及(AY260445 / AY260435),Methanoculleus bourgensis(NC_018227 / AY196674),Methanofollis liminatans(AF414041 / Y16429),Methanogenium thermophilum(AB300783 / M59129),Methanomicrobium移动(AF414044 / M59142),Methanospirillum hungatei(YP_503573 / M60880)、订单Methanosarcinales:甲烷八叠球菌属巴氏细菌(Y00158 / NR_074253),Methanosaeta concilii(YP_004383383 / NR_102903),秩序Methanococcales:Methanocaldococcus jannaschii(L77117 / NR_074233),产甲烷球菌属vannielii(P07961 / NR_074175)Methanospaera stadtmanae(YP_447374 / JQ346752),秩序Methanocellales:Methanocella arvoryzae(AM114193 / NR_074232),Methanocella conradii(YP_005380187 / JN048683),秩序Methanopyrales:Methanopyrus kandleri(NP_613940 / NR_074539)、订单Methanoplasmatales:产甲烷archaeon CRM1 (GQ339872 / GQ339875)和产甲烷archaeon DCM1 (GQ339873 / GQ339876)。的相关性mcrA距离数据到16 s rRNA距离数据给出了方程(当被迫通过原点。当0.02(标准16 s rRNA OTU)被插入,。因此,氨基酸序列的OTU的标准mcrA确定相似度95%。距离的蛋白质和DNA计算和protodist dnadist Phylip包(版本。分别为3.68)。覆盖从以下公式计算:覆盖,在那里克隆的总数和吗是一种由OTU只有1克隆。的均匀度计算的使用以下公式:(38),。LIBSHUFF分析是用来计算的统计意义2库使用mothur程序之间的差异(39]。

2.6。统计分析

pH值的统计分析和微生物种群在粪便使用学生的表现以及。是意义。

2.7。加入核苷酸序列号码

这一研究获得的核酸序列都是日本银行存入DNA数据(DDBJ),欧洲分子生物学实验室(EMBL)和基因库数据库,在加入数字AB739303-AB739402 16 s rRNA基因序列和AB739403-AB739502mcrA基因序列。

3所示。结果

3.1。粪便pH值和微生物种群密度

pH值和微生物种群密度如表所示2。马的粪便样本的平均pH值高于从小马()。总细菌的人口密度是相似的马和小马。瘤胃厌氧真菌和产烷生物种群的密度更高的马比小马()。

3.2。系统发育分析mcrA基因和古细菌16 s rRNA的基因

本研究没有发现嵌合序列。共有50的克隆进行了分析mcrA基因克隆库马和小马。推导的氨基酸序列mcrA基因克隆的马和小马图书馆分为9辣子鸡(图1和表3)。系统发育分析表明,辣子鸡是分为3 clades-Methanobacteriales Methanomicrobiales,和Methanoplasmatales马和小马(图1)。大部分的克隆(4辣子鸡,46个克隆,92%马;小马3辣子鸡和47个克隆,94%)隶属于Methanomicrobiales。只有1 OTU附属属Methanobrevibacter马(OTU6)和小马(OTU5)。马图书馆OTU6显示100%的相似Methanobrevibacter gottschalkii。OTU5显示,95%相似,无教养的产甲烷菌检测的前肠tammar小袋鼠(40(数据未显示)。其余3辣子鸡(OTU7 8和9)马克隆(6%)和1 OTU (OTU7)小马(克隆的2%)被列为Methanoplasmatales(表3和图1)。OTU9显示高相似度(96%)mcrA序列的身份不明的肠道产甲烷archaeon DCM1(只发表在《数据库)。大部分的辣子鸡显示低相似性(少于95%)确定了产甲烷菌(表3)。OTU1、2、4、7通常发现在马和小马图书馆。

五十的古细菌16 s rRNA基因克隆马和小马库进行了分析。马和小马的克隆序列库分为10辣子鸡(图2和表4)。系统发育分析显示,辣子鸡是分为4个演化支(图2)。类似于mcrA克隆库,大多数克隆(32个克隆,64%马;小马37克隆,74%)是隶属于Methanomicrobiales(表4和图2)。OTU2确实属于Methanosarcinalesthat没有观察到mcrA克隆库。OTU4, 5、6显示高相似度(97% - -99%)Methanobrevibacter ruminantium。这些辣子鸡是总数的18%和14%的克隆马和小马库,分别。OTU8, 9和10分为Methanoplasmatales进化枝(图2)。马的克隆库在这些辣子鸡由克隆数量,总数的10%和1 OTU从小马图书馆由克隆总数的6%(表数量3)。OTU9 OTU10显示高相似度(97%和96%)身份不明的肠道产甲烷archaeon DCM1 (GQ339876)和CRM1 (GQ339875)(只发表在数据库),分别。OTU1、2、4、6和8通常发现在马和小马图书馆。

在分析mcrA基因,Shannon-Wiener指数()、均匀度和Chao-1物种丰富度高马库比小马库;然而,LIBSHUFF分析显示,没有显著差异的多样性mcrA马和小马(表中基因5)。相似的趋势和均匀度的观察分析16 s rRNA的基因。然而,LIBSHUFF 16 s rRNA基因文库的分析表明,有一个显著区别2库()。更低的保险和更高Chao-1 16 s rRNA基因克隆的物种丰富度观察到图书馆是高于观察的mcrA基因克隆库。

4所示。讨论

更大的理解后肠微生物多样性的提高消化过程至关重要。产甲烷菌的多样性胃肠道的马也很重要对于理解甲烷排放的缓解。后肠的nonruminants,产甲烷菌利用H₂和有限公司₂生产甲烷(41];然而,甲烷生产单胃的动物低于通过反刍动物甲烷生产。另外,在单胃的动物,大型食草动物如马、骡子和驴产生大量的甲烷(42]。几乎没有关于微生物生态系统的信息和马产烷生物的多样性。这个研究是建立进一步的信息进行产烷生物多样性的马和小马。

Morvan et al。43)表明,产烷生物的数量是10⁴到10⁶细胞每克湿重马的盲肠的内容。这个研究显示类似的密度被Morvan et al。43];然而,马和小马没有显著差异(表2)。

产甲烷菌Methanomicrobiales是最普遍的羊(大约54%)和牛的瘤胃(21 - 54%)15,16占主导地位,他们也在韩国本地牛(12和默拉水牛44]。本研究的良种马和日本本土小马显示一个类似的趋势,观察羊瘤胃产烷生物成分,牛,水牛在先前的研究。

标准OTU赋值的mcrA克隆库决心从之间的相关性为95%mcrA距离和16 s rRNA基因距离。标准的95%mcrA对应于98%的16 s rRNA基因。的分析mcrA显示,大多数克隆显示相似度小于95%确定产烷生物(表3)。此外,大多数的16 s rRNA基因文库克隆显示确认产烷生物相似性小于98%(表4)。因此,这些结果表明,大多数克隆来自不明和产甲烷菌的新物种。

Methanoplasmatales是第二个最主要的进化枝mcrA和16 s rRNA基因分析良种的马。Methanoplasmatales进化枝代表小说群古生菌在牛的瘤胃15),无教养的水牛瘤胃产甲烷菌的(44在牛的瘤胃[],无教养的古生菌13),或假定的“新分类群”在牛的瘤胃14]。马Methanoplasmatales进化枝也属于那些新组,和辣子鸡Methanoplasmatales进化枝显示80% -92%相似的氨基酸序列mcrA基因和91 - 97% 16 s rRNA基因的相似性对识别或candidatus产烷生物物种在这项研究中(表3和4)。尽管OTU3 16 s rRNA库显示,90%相似Methanocorpusculum sinense(FR749947)属于Methanomicrobiales(表4),系统发育的位置OTU之内Methanobacteriales进化枝(图2)。

大约一半的辣子鸡是常见的在这两个品种在本研究(表3和4)。剩余的辣子鸡特别发现在每一个品种。

王等人。13在16 s rRNA)显示显著差异基因产烷生物多样性观察在不同品种的奶牛(泽西与荷斯坦)保持在同样的饮食方案。类似于这个报告,马和小马之间的显著差异被发现在分析LIBSHUFF 16 s rRNA基因克隆库的分析()(表5)。此外,马的后肠比小马的更加多样化。系统发育分析使用两个不同的基因克隆库导致类似的倾向。然而,这些分布在不同的细节。的mcrA基因可以用于检测更Methanomicrobialesspecies,而16 s rRNA基因可用于检测Methanobrevibacter物种。属于Methanosarcinales OTU只发现在16 s rRNA克隆库而不是mcrA克隆库。因此使用两种不同的标记基因提供了更好的解析分析产烷生物的多样性。

5。结论

目前的研究是第一个报道后肠产甲烷菌的分子多样性的马和小马的基础上mcrA和16 s rRNA基因克隆库分析。尽管动物存在形形色色的产甲烷菌,组合不同()。门Methanomicrobiales是最丰富的组后肠。门的克隆附属Methanoplasmatales最近提出了新的门也发现在这两个库。大多数克隆这一研究获得的来自不明身份的产甲烷菌,表明生态系统仍是未知的环境。身份不明的产甲烷菌的隔离和表征后肠的马和小马应该澄清后肠功能。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢先生Kawakita Hirone,高田高中(Tsu,三重县、日本),提供马和小马的粪便。本研究在经济上支持的科研补助金,日本促进社会科学(22580308)。核苷酸序列进行生命科学研究中心(分子生物学和遗传学中心)、三重大学(Tsu,三重县,日本)。

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