古生菌的多样性和分布沿地层社区从青藏高原冻土资料,中国

文摘

陪同的永久冻土融化所形成的气候变化,微生物分解大量的冷冻有机碳存储在冻土是一种潜在的温室气体排放源,可能导致温室效应的正反馈。在这项研究中,在地层土壤古菌的社区组成的青藏高原高山冻土调查。系统发生的16 s rRNA序列的分析显示,主要由社区Crenarchaeota和Euryarchaeota。活性层包含的比例Crenarchaeota与的比例为51.2%,Euryarchaeota为48.8%,而永冻层中含有41.2%Crenarchaeota和58.8%Euryarchaeota基于16 s rRNA基因序列分析。OTU1 OTU11,隶属于集团内1.3 b / MCG-ACrenarchaeota和非保密组内Euryarchaeota分别在所有沉积物层广泛分布。然而,OTU5隶属于集团1.3 b / MCG-A主要是分布在活性层。序列分析16 s rrna的DGGE乐队的产甲烷古菌显示,大部分的产甲烷菌属于Methanosarcinales和Methanomicrobiales隶属于Euryarchaeota和未受教育的ZC-I集群隶属于Methanosarcinales分布在沿着冻土深度剖面,这表明一群主导的产甲烷菌发生在寒冷的生态系统。

1。介绍

永冻层占据了大约25%的地球陆地表面,最常发生在高纬度地区,特别是北半球的1,2]。然而,高山冻土通常存在于低温,温带地区海拔较高的网站。众所周知,冻土储存大量的碳;最近的估计表明,1672 Pg的有机碳,金额相当于总碳包含在陆地植物和大气3- - - - - -5),在北方的冻土地区可能存在,占大约50%的全球估计地下的有机碳池(6]。随着全球变暖,永久冻土开始解冻,估计高达90%的永久冻土的输了21007),这就提出了一个问题关于碳在永久冻土融化的命运。推断,从冻土释放碳向大气中发生主要通过加速微生物分解有机物的3]。先前的研究表明,多种微生物栖息在冻土环境(8,9]。在融化,变得更容易被微生物降解有机物和导致温室气体的排放4),这被认为是一个最重要的从陆地生态系统反馈到大气中,从而可能进一步加剧了温室效应,冒着重要气候变化(3]。

早期的研究表明,冻土港口不同的微生物群落,包括细菌和古菌(10- - - - - -12]。大多数研究解决冻土微生物群落仅限于在西伯利亚永久冻土层的网站13,14]。西伯利亚冻土的研究表明,细菌细胞的总数从上到下的活性层(顶层土壤融化在夏季和冬季凝结)范围细胞每克干土(15]。古生菌总数的1%和12%之间可能构成细胞在西伯利亚活动层土壤15,16]。古生菌的社区组成的Euryarchaeota(61%)和Crenarchaeota(39%),长期冷冻沉积物(11]。产甲烷菌,附属的门Euryarchaeota,是一群古菌在厌氧条件下产生甲烷,无处不在的生物圈,尤其见于多种生态系统如稻田、湖泊、热液喷口,永冻层土壤和沉积物17]。其中的一些被证明是可行的居民在高纬度冻土(18,19]。然而,无教养的产烷生物集群,集群若尔盖(ZC-I),隶属于Methanosarcinales在Euryarchaeota被发现是占主导地位的集团在青藏高原高山冻土湿地(20.]。产甲烷的系统发育分析古生菌社区发现一个伟大的永冻层包括家庭的产甲烷菌的多样性Methanobacteriaceae,Methanomicrobiaceae,Methanosarcinaceae,Methanosaetaceae(16,17,19,20.),产烷生物组水稻集群我(RC-I)和无教养的米饭集群II (RC-II)系统内的辐射Methanosarcinales和Methanomicrobiales(19,21- - - - - -23)和ZC-I附属Methanosarcinales(20.我附属],冻土集群Methanosarcinaceae(19第二和第三,冻土集群关联Methanosarcinales(19]。nonmethanogenic古生菌组1.1 b / MCG无教养的附属Crenarchaeota主要是在高北极冻土湿地[24]。尽管我们已经积累了适度的知识永冻层的产甲烷古菌,他们继续吸引研究者的注意,由于其生产的甲烷和全球变暖的影响。

青藏高原是地球上最大的高山冻土地区。早期的研究估计,每年在青藏高原寒冷的湿地甲烷排放量约为0.7 - -0.9 Tg (25]。由于温室效应与冻土解冻,有机碳存储在冻土微生物来说将变得更加容易的活动将决定永久冻土环境净温室气体的源或汇(1]。然而,在高海拔多年冻土微生物群落的当前知识了解甚少。在这项研究中,我们描述了多样性和垂直分布的热点社区在永久冻土的概要文件,试图阐明archaeacolonizing成分的活性层和永久冻土和进一步描述在青藏高原产烷生物的社区。

2。材料和方法

2.1。网站描述和抽样

抽样地点位于青藏高原(QTP N 38°05 38.10′′′和E 99°10′05.13′′)海拔4300米,萨默斯是温和的,冬天是很冷的地方。年平均温度大约是−5.8°C, 1月气温从7月18至−−7°C和温度从15到21°C。明显的降水主要发生在夏季,而在冬季和春季降水很低。研究区属于高山沼泽草地的自然生态系统与土壤有机碳的大量存储。活性层冻土消融每年夏天,从20到60厘米,厚度不同而永冻土层发生在整个区域600 - 700米的深度。

样品被收集在2013年6月,并通过65厘米的深度挖掘。样品被收集的无菌的3 - 5厘米的活性层63 - 65厘米的永冻土层每隔10厘米。土壤是放入灭菌塑料袋化学分析和50毫升离心管微生物分析。所有的样品都冻结在绝缘容器和运输立即实验室作进一步分析。

2.2。永冻层土壤的特性

使用原位土壤温度测量方法,插入土壤的pH值调查每一层。土壤的pH值是确定每个站点的土壤样本上分别使用新鲜的土壤含水率的1:5 (pH计,缝匠肌PB-10)。水分含量是决定减肥的新鲜土壤干24小时的105°C。土壤总碳含量为每一个土壤样本是由燃烧了16 h在375°C。对土壤中甲烷浓度的分析,5 g的每个样本被切断注射器和注射到一瓶25毫升含有10毫升的饱和氯化钠溶液。瓶子是由坚实的丁基橡胶密封隔膜和动摇之前1 h。顶部空间甲烷的浓度是由气相色谱使用帕卡德模型438配备了一个火焰离子化检测器。

2.3。DNA隔离

土壤样本的DNA提取使用土壤DNA隔离设备(MP)根据制造商的指示。提取的DNA可视化在1%琼脂糖凝胶使用溴化乙锭染色和量化Nanodrop(热科学,Nanodrop nd - 2000)。

2.4。变性梯度凝胶电泳(DGGE)

nested-PCR方法被用来放大V3的热点地区16 s rRNA。长篇古细菌16 s rDNA基因从基因组DNA放大使用底漆集8 f (5′-CGGTTGATCCTGCCGGA-3′)和1492 r (5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′) (26]。进行第一轮PCR扩增的是50μ0.25 L的反应混合物μ每个引物的M, MgCl核苷酸0.2毫米、1.5毫米₂,5μL Taq缓冲区,5 U Taq DNA聚合酶(英杰公司、美国),和10 ng模板DNA。PCR条件如下:95°C 5分钟,35周期的50年代在95°C, 50年代在45°C,和1.5分钟在72°C,紧随其后的是最后一个扩展10分钟在72°C。PCR产品gel-purified和用作模板放大V3地区利用引物组340 f-gc (5′-CCCTACGGGGYGCASCAG)和519 r (TTACCGCGGCKGCTG) [26]。第二轮PCR条件如下:使用95°C 5分钟,35周期的50年代在95°C, 50年代在45°C,和1.5分钟在72°C,紧随其后的是最后一个扩展10分钟在72°C。

DGGE进行描述的麻风病患者et al。26与修改)。PCR产品被应用到8% (wt /卷)聚丙烯酰胺凝胶在1×TAE缓冲与变性剂梯度从20到40%(100%变性剂由7 M尿素和甲酰胺40%)。电泳进行60°C和200 V 6 h。电泳,凝胶与溴化乙锭染色后30分钟,拍摄紫外成像仪(AlphaImager迷你系统)。DGGE乐队是凝胶纯化和reamplified引物组340 f - 519 r。的纯化PCR克隆到向量和转化成产品大肠杆菌排序前10名。

2.5。克隆图书馆建设

古细菌16 s rRNA从土壤社区DNA基因扩增技术使用引物21 f (5′TTCCGGTTGATCCYGCCGGA)和958 r (5′YCCGGCGTTGAMTCCAATT);PCR反应体积相同的放大全长16 s rDNA古生菌,并根据德龙(PCR反应进行了27]与修改如下:1 95°C的周期1分钟,1分钟30 94°C的周期,50°C 1分钟,2分钟72°C,并最终在72°C扩展了10分钟。PCR产物纯化如上所述,克隆后,制造商的指示使用pMD18-T向量系统(豆类)和主管一起大肠杆菌JM109细胞。随机选择克隆测序。

2.6。测序和系统发育分析

序列测定ABI 3730自动DNA测序器(应用生物系统公司)使用通用引物M13-47或热点21 f底漆。序列的16 s rDNA DGGE分析了乐队和克隆库通过NCBI BLASTN搜索程序来识别他们的假定的系统发育近亲。序列是与他们的亲戚使用Clustal W,和系统发育树是由梅格4中的neighbor-joining方法使用maximum-parsimony算法软件1000引导程序复制。Phylotypes或操作分类单位(辣子鸡)被定义为序列显示≥97%的同源性。核苷酸序列已经存入基因库加入数据库和数字如下:DGGE乐队,KM251579-KM251601;古细菌克隆,KM251602-KM251632。

2.7。统计分析

克隆库覆盖计算根据好(28]。一个计算机程序DOTUR被用来分配序列辣子鸡,然后稀疏曲线由使用部分16 s rRNA基因序列[29日]。另一个计算机程序MOTHUR是用来计算香农和辛普森多样性指数,abundance-based覆盖率估计(ACE), bias-corrected Chao1 [30.]。

3所示。结果

3.1。土壤物理和化学特性的冻土

样本收集在6月底,2013。温度沿土壤剖面显示明显减少梯度从顶部为18.34°C的底部−0.45°C。微酸性,pH值从6.43到6.79不等。粒度分析表明,地层剖面的土壤是由沙子(7.99% - -18.73%),淤泥(66.84% - -75.56%),和粘土(11.26% - -20.49%)的平均晶粒尺寸从5.68到6.46不等μm。分类样本不同的系数从1.73到1.99,这表明,沉积物分选好的学习网站(表中1)。最外层组织的含水量最高的土壤,因为这个地区在夏季降雨频繁,洪涝灾害往往是观察在沼泽中。干沉积物中有机碳(TOC)降低了与深度从9.01%提高到1.76%,其中TOC在上层土壤明显高于其他样本,表明近地表土壤的有机质积累丰富。甲烷含量很低在最上面的几厘米但迅速增加到最大值188.3 nmol / g在其他更深层次的样品(表中1)。

3.2。多样性的热点16 s rRNA基因序列的克隆库

古菌群落的多样性和组成了通过构建克隆库的热点16 s rRNA基因片段。七个克隆库由最低的最活跃的土层永冻土层每隔10厘米。在每个库,覆盖范围从95.2%到97.7%(表2)。30到55序列在每个库检索,和282序列结合的分析和组成社区的多样性。15操作分类单位(辣子鸡)被确定在物种水平(序列相似度≥97%)通过所有的深处。12和10人发现在活性层和永冻土层,分别在两层和7辣子鸡。相对更多的辣子鸡的深度观察(7辣子鸡)3 - 5厘米,第23 - 25厘米(7辣子鸡),和63 - 65厘米(辣子鸡)。香农和辛普森多样性指数变化从0.79到1.74,从0.18到0.58,分别和物种丰富度估计ACE和曹国伟1不同从0至17从4到10,分别。香农和辛普森多样性指数显示无显著差异,表明古细菌16 s rRNA基因的多样性库层(表中是相似的2)。

3.3。构成社区的热点

系统组成的热点16 s rRNA基因序列显示,他们主要隶属于两个类群,Crenarchaeota和Euryarchaeota,占47.2% %和52.8%的总序列,分别。检索到crenarchaeal序列分为只有一个血统,集团1.3 b / MCG-A [31日,32),占47.2%的热点克隆序列。检索到的euryarchaeal序列可以分为四个血统,Methanomicrobiales,Methanosarcinaceae,Methanosaetaceae,不保密的Euryarchaeota,占0.3%,1.1%,1.4%,和50.0%的古细菌克隆序列,分别(图1)。

不同热点的相对丰度和分布系统血统与深度图所示2。活性层和冻土是主要的Crenarchaeota和Euryarchaeota。活性层包含的比例Crenarchaeota在51.2%到48.8%之间Euryarchaeota永冻层,而更高的比例Euryarchaeota(58.8%)比Crenarchaeota(41.2%)。垂直分布的辣子鸡沉积物剖面显示OTU1 OTU11,属于组1.3 b / MCG-A和未分类组Euryarchaeota分别在所有沉积物层广泛分布。OTU1的丰度与深度逐渐增加,而OTU11逐渐减少与深度,除了最上面三层土壤。OTU5,另一个属于集团内1.3 b / MCG-A血统Crenarchaeota只,主要分布在活性层的顶部部分。是非常有趣的发生OTU5与深度急剧减少,特别是当温度低于0.4°C;我们推断,OTU5可能是由低温控制。三个辣子鸡(OTU2 OTU3和OTU4)只有在永冻土层和发现没有发现在活性层。OTU9,相反,OTU7分布,OTU8 OTU12, OTU14只有在活性层中发现,这表明古生菌在不同深度不同的社区。

3.4。变性梯度凝胶电泳分析16 s rRNA的产甲烷古菌

变性梯度凝胶电泳(DGGE)指纹被用来描述产甲烷古菌的群落组成。DGGE乐队模式表明,大多数DNA乐队都观察到上层的概要文件(3 - 5厘米),和类似的乐队模式观察下面的深渊,这表明类似的产甲烷古菌群落的发生较低层的概要文件。主要乐队,并有很强的强度普遍观察到的深度,表明主导DGGE乐队代表了丰富的产甲烷古菌在社区。然而,一些DGGE乐队中发现的不同层土壤没有出现在其他层,表明depth-specific产甲烷的数量。总共有23个乐队切除和测序。系统发育分析表明,十二个序列内下跌euryarchaeotal血统,由三组ZC-I集群(12序列),Methanosarcinales(1)序列Methanomicrobiales(8)序列。只有两个序列检索杂项Crenarchaeal组(MCG) crenarchaeotal血统。序列附属ZC-I集群分布在所有的深度,而序列相关Methanomicrobiales主要分布在顶部和冻土沉积物,但序列附属MCG只观察到最顶层活跃层冻土。这是非常有趣的,只有两个乐队隶属于ZC-I集群在第23 - 25厘米的深度观察,显示最大甲烷浓度(数据3和4和表1)。

4所示。讨论

冻土是众所周知的存储大量的有机碳,被认为是最重要的自然甲烷排放源(3,33]。先前的研究估计,总计33.52 Pg的有机碳和0.7 - -0.9 Tg甲烷排放的排放从青藏高原草地土壤25,34]。最近的研究表明在QTP气温持续上升在过去40年里,使它们的一个潜在来源相当大的温室气体排放(35]。我们的数据表明,有机碳含量从1.61%到3.02%不等的深度13 - 65厘米,相比较,有1.6%在高北极永冻层土壤从斯匹次卑尔根据汉森et al。8)和1.2 - -3.0%的永久冻土活动层土壤从丽娜三角洲Liebner报道和瓦格纳13]。然而,最上面的土壤中有机碳含量达到9.01%(3 - 5厘米)层的QTP网站。较高的有机碳被推断有关烂草湿地的根。甲烷含量低得多在两个顶部和底部沉积物沿着冻土资料除了地下深度的第23 - 25厘米,甲烷含量可以达到最大值188.3 nmol / g。模式的甲烷含量与深度也没有表现出任何趋势明显关联与沉积物的物理和化学性质,如有机碳浓度、沉积性质,或含水量。这个观察符合Rivkina et al。36在北极苔原东北部。第23 - 25厘米的高甲烷含量在深度推断是与较低的氧化还原电势和合适的基质层,这需要进一步证实。

总共15辣子鸡的古生菌从青藏高原冻土观测土壤,这提出了一个较低的古细菌多样性相比与其他环境。史蒂文et al。9]显示43辣子鸡古生菌的冻土/地面从加拿大高北极冰核。较低的古菌多样性QTP冻土土壤可能与栖息地环境,并未有很大区别就是明证类似生化的变量见表1。Frank-Fahle et al。37)报道,微生物多样性最高的表面层次,减少对永冻土层。我们的数据表明,古生菌的多样性之间的相似层和降低总体OTU数字在每一层都被观察到。存在重叠的辣子鸡的热点社区不同深度的建议主要热点社区抽样范围相似。

communtiy组成了16 s rRNA基因克隆库显示Crenarchaeota和Euryarchaeota是主要类群和冻土活动层。类似的丰富的Crenarchaeota(51.2%)和Euryarchaeota(48.8%)在活性层。相比之下,一个丰富的高Euryarchaeota(58.8%)和低丰度的Crenarchaeota(41.2%)被发现在永冻土层(图2)。这个结果非常相似与史蒂文的报告等。9从加拿大高北极,16 s rRNA基因序列属于Crenarchaeota主导和冻土活动层表视野,Euryarchaeota主要在永久冻土。然而,威廉et al。24)报道,和冻土活动层是主要的Crenarchaeota分别为71%和95%;活性层有一个大比例的Euryarchaeota与冻土相比(22%)(4%)。丰富的Crenarchaeota推断是一个增加的趋势降低温度,建议的成员Crenarchaeota可能特别适应寒冷的条件(16]。然而,我们的数据表明,尽管OTU1和OTU5属于组1.3 b / MCG-A内部Crenarchaeota;OTU1的16.2%和26.8%的OTU5活跃层中的分布;相比之下,34.2%的OTU1和3.5%的OTU5分布在永冻层(图2),这表明OTU1可能更适应寒冷的环境敏感而OTU5似乎更冷。

基于16 s rRNA基因序列分析,两者兼而有之Crenarchaeota和Euryarchaeota显示只有一组有限的多样性(集团1.3 b / MCG-A)基础Crenarchaeota和四组(Methanomicrobiales,Methanosarcinaceae,Methanosaetaceae和非保密潜在集团)Euryarchaeota。共有97.2%的序列属于这两个组1.3 b / MCG-A(47.2%)和非保密Euryarchaeota(50.0%),这主要是由OTU11(48.9%)和OTU1(23.4%),分别为(图2)。Ochsenreiter et al。31日)报道,1.3 b组,一个noncultured群Crenarchaeota是广泛分布在不同的环境中如淡水、污水、土壤。16 s rRNA基因序列附属在noncultured未分类群Euryarchaeota频繁出现在淡水环境。我们的数据表明,组1.3 b / MCG-A和非保密Euryarchaeota主要是古菌分布在所有的深处。非常有趣,OTU5隶属于集团1.3 b / MCG-A绝大多数分布在活性层,和序列属于OTU1往往随深度逐渐增加,而序列属于OTU11,附属于非保密Euryarchaeota,主要是分布在低得多的温度(图的层2)。据我们所知,这些发现以前从未报道。

也称为产甲烷菌,产甲烷古菌是一个重要的组Euryarchaeota在厌氧条件下产生甲烷和已被证明是可行的永冻层的居民36,38]。我们的DGGE序列分析显示,成员的Methanosarcinales和Methanomicrobiales构成了大部分的产甲烷菌的土壤,和无教养的产烷生物ZC-I集群的附属Methanosarcinales显示最强的乐队在DGGE和强度分布在沿着冻土深度剖面,这表明一群主导的产甲烷菌发生在寒冷的生态系统。类似的观察报告若尔盖湿地的青藏高原20.]。Methanosarcinales普遍存在在不同厌氧生境包括淡水和海洋泥和沉积物,瘤胃,污水污泥老化器(39]。他们有能力使用醋酸作为甲烷生成的基质,它们的区别Methanomicrobiales,可以使用H₂和有限公司₂作为甲烷生成的衬底(40]。我们的数据表明,成员Methanomicrobiales通常显示的乐队在DGGE和分布在有限层,这表明acetotrophic产甲烷菌相对更丰富hydrogenotrophic methnogens冻土。下巴和康拉德(41]报道水稻土时转向较低的温度,它导致瞬态乙酸的积累。瓦格纳和菲佛(另一份报告42醋酸)显示,通常作为甲烷生成的衬底温度较低。产甲烷菌的分布格局QTP冻土是一致的报告从西伯利亚北极永久冻土层中Methanosarcinales是主要的产甲烷菌在低温环境中(19]。使用DGGE引物扩增的产甲烷古菌,我们隶属于MCG内的两个序列中恢复过来Crenarchaeota上层的活跃的冻土,有机碳含量很高(9.01%)。MCG古生菌,一群异养厌氧生物,有一个更广泛的栖息地范围包括陆地和海洋,冷热,表层和次表层的环境(43,44]。目前,MCG的碳和能源是未知的。先前的研究表明他们通常占主导地位在营养丰富的环境,可以利用复杂的有机基质(44- - - - - -47]。

5。结论

在这项研究中,我们调查了古细菌群落组成在地层土壤从青藏高原高山冻土。古生菌的多样性是相似的在所有的深度,和社区主要是由Crenarchaeota和Euryarchaeota。每一组的两个门有一个独特的活性层之间的分布格局和永冻土层。大部分的产甲烷菌属于Methanosarcinales和Methanomicrobiales的门Euryarchaeota。本研究将有助于改善我们的理解古菌群落结构的永久冻土环境。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者承认詹姆斯·赫尔利的关键本文的阅读和修改。这项研究得到了国家专项研究基金,中国(天然气水合物资源勘探和生产测试项目)。

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