古细菌和古细菌氨单氧酶基因的系统发育多样性在铀Mining-Impacted位置在保加利亚

文摘

铀矿开采和加工活动影响影响站点的微生物种群。铀在土壤细菌和真菌的负面影响很有研究,但对放射性核素和重金属对古生菌的影响。的组成和多样性的热点社区居住的废物堆Sliven铀矿的土壤Buhovo铀矿研究使用16 s rRNA基因检索。共有355个古细菌克隆选择,他们16 s rDNA插入被限制片段长度多态性分析(RFLP)歧视14种不同的RFLP类型。所有评估热点16 s rRNA基因序列属于1.1 b /NitrososphaeraCrenarchaeota集群。古细菌的组成社区每个站点的不同兴趣和依赖环境特征,包括污染水平。自从1.1 b /成员Nitrososphaera集群已经参与氮循环、古细菌从这些网站的社区是探测存在的氨单氧酶基因(amo一),我们的数据表明amo一个基因序列分布以类似的方式在Crenarchaeota,表明古细菌硝化过程在铀mining-impacted位置是相同的控制下控制古细菌多样性的关键因素。

1。介绍

宏基因组研究表明,古生菌广泛分布和可能发挥重要的作用在各种各样的环境过程中,如化能自养的硝化作用[1],碳代谢[2),和氨基酸的吸收3,4]。古细菌中最丰富的生物类群Crenarchaeota和Euryarchaeota [2,5]。Crenarchaeota代表超过75%的古细菌种群在自然环境6]。某些crenarchaeotic团体被认为是局限于特定的环境;例如,1.1组主要由水生生物,而1.1 b组的成员是典型土壤crenarchaeotes [7]。

全球矿业和铣削活动引入高水平的放射性核素和重金属(HMs)到土壤和水生环境。污染对古生菌的副作用还没有得到深入研究[8,9]。此外,只有少数研究研究古细菌多样性HM - [10,11()和铀)- U -污染环境(5,12- - - - - -14]。Radeva和Selenska-Pobell13]报道crenarchaeotic 16 s rRNA基因序列在萨克森U-contaminated土壤,德国,属于只有1.1 b组的门,当那个宿舍叫赖茨et al。141.1,1.3 b, SAGMCG.1 crenarchaeotic从土壤深层U-polluted基因序列的视野。Porat et al。5]研究古细菌群落的多样性来自水星,U-contaminated淡水流沉积物通过焦磷酸测序分析。他们找到了一个更高的古生菌的丰度和多样性水星——比U-contaminated网站,那里的古细菌序列Crenarchaeota和Euryarchaeota类群。

到目前为止,所知甚少涉及古生菌和U或HMs之间的交互。Kashefi et al。15公布,hyperthermophilic crenarchaeotePyrobaculum islandicum能够减少U (VI) U (IV)在厌氧条件下在100°C。弗朗西斯et al。16)表明,嗜盐的euryarchaeoteHalobacterium halobium积累大量的U (VI)作为细胞外铀酰磷酸存款;然而,这两种有机体中没有U-contaminated根基。后来,那个宿舍叫赖茨et al。9,17显示acidothermophilic的容量硫化叶菌acidocaldarius的,这是一个本土archaeon U-contaminated土壤和尾矿,胞内积累U (VI)。

发现一些嗜中温从Crenarchaeota古生菌,后来被分为新Thaumarchaeota门(18),有可能氧化氨表明一个重要的角色的古生菌氮(N)周期(19,20.]。crenarchaeotic氨单氧酶基因(amoA)被发现在许多自然环境,如土壤(2,21)、海洋和淡水生态系统(22- - - - - -25),几位地热环境和温泉26- - - - - -28北极湖泊[],29日)、饮用水生产工厂(30.),和污水处理厂31日]。这个广泛分布表示的普遍性和重要性的热点氨氧化剂在全球N周期(21,32- - - - - -34]。然而,很少有研究评估的热点amoU-impacted环境及其多样性。

密集的U采矿和铣削在保加利亚进行1946年和1990年之间,造成重大污染土壤和水。U生产在1992年停止政府法令,矿和尾矿技术清算,逐步纠正。然而,周围仍然高度污染,进一步污染损害补救的矿山和尾矿被记录下来。

本研究的目的是研究古细菌的多样性社区居住环境影响U采矿和铣削活动,特别是揭示古细菌的多样性amo一个基因。因为U和HM污染代表旧的环境负担,我们预期,组成和多样性的热点amo社区被稳定在选择性的污染水平和环境特征。

2。材料和方法

2.1。网站和抽样

两个地点在保加利亚进行了研究:废弃矿业和铣削复杂“Buhovo”和“Sliven”我的,这两个已被列为地区高辐射风险的保加利亚机构放射生物学和辐射防护。矿业复杂“Buhovo”(42°45 51.20′′′N;23°34 36.86′′′E)位于东北30公里索非亚在2280公顷的领土,而“Sliven”我(42°41 47.68′′′N;26°22′22.47′′E)位于保加利亚东部和南部占地面积491公顷(图1)。采矿作业在两个地点进行了传统地下的方式从1962年到1981年。他们在1992年正式关闭直到2001年和纠正。

Buhovo样本收集在2003年5月20厘米深处(BuhC)和40厘米(BuhD)。收集样品贴上“Sliv”2004年6月从“Sliven”矿山矸石堆在40厘米的深度。五个样本BuhC、BuhD Sliv收集在无菌条件下,运输在4°C,并存储在−20°C到使用。

2.2。环境变量

样品的有机质含量是由Turyn基于重铬酸钾的氧化的方法(35]。pH值测量使用便携式电位计(HANA酸度计)后土壤样本已被停职,蒸馏水(土壤:液体,1:2.5)。硫酸盐和硝酸盐的浓度在0.1 CaCl使用分光光度计测定₂土壤后提取方法被Bertolacini和巴尼二世(36和基尼和尼尔森37),分别。HMs的浓度测量使用ELAN 5000电感耦合等离子体质谱仪(美国珀金埃尔默,谢尔顿,CT)在1 M盐酸溶液(1:20;土壤:1 M盐酸)。结果计算出土壤烘干的。

2.3。DNA提取

总DNA (> 25 kb)从样本中提取(3 g)直接溶解后使用方法描述Selenska-Pobell et al。38DNA, DNA样本(5次级样本采样站点)被收集在一个具有代表性的平均样本进行进一步分析。

2.4。PCR扩增

古细菌16 s rRNA基因从基因组DNA通过seminested PCR扩增使用特定的热点(5′-TTCCGGTTGATCCYGCCGGA-3′)和通用的引物(5′-ACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)。每一个PCR反应混合物(20μL)含有200μM deoxynucleotide三磷酸腺苷,1.25毫米MgCl₂,1.25毫米MgCl₂10 pmol DNA引物1 - 5 ng模板DNA,和1 U AmpliTaq黄金聚合酶与相应的10倍缓冲区(珀金埃尔默,促进城市、钙、美国)。进行了放大的“降落”PCR在热循环(Biometra,哥廷根,德国)。在94°C初始变性后7分钟,退火温度从59岁下降到55°C / 5周期,紧随其后的是25周期每个概要文件的变性在94°C(60秒),55°C(40秒),72°C(90秒)。完成了放大延长20分钟在72°C。产品稀释后的第一反应是用作第二轮PCR模板,两个热点特定的引物和(5′-YCCGGCGTTGAMTCCAATT-3′)应用(39]。最初的变性在95°C 7分钟后25个循环组成的每个变性在94°C(60秒),退火60°C(60秒),和聚合在72°C(60秒)。完成了放大10分钟在72°C的延伸。这个seminested PCR格式应用于获得足够多的PCR产物的克隆程序。

古细菌amo一个片段(~ 635个基点)使用PCR引物拱-而被放大amo房颤(5′-STAATGGTCTGGCTTAGACG-3′)和拱-amo基于“增大化现实”技术(5′-GCGGCCATCCATCTGTATGT-3′) [40]。根据弗朗西斯PCR循环进行et al。40],最初在95°C变性5分钟后跟35周期如下:变性在94°C(45秒),退火在53°C(1分钟),并在72°C扩展(1分钟)。完成了放大延长15分钟在72°C。

2.5。16 s rRNA基因克隆库

一个热点和一个amoBuhC基因克隆库,BuhD, Sliv构造使用PCR反应的混合产品。的16 s rDNA扩增子从五个复制相结合,直接克隆到大肠杆菌使用一个威尼斯平底渔船TA克隆工具包(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)制造商的指令生成后克隆库。古细菌16 s rRNA基因插入amo一个基因插入随后被放大通过PCR plasmid-specific向量M13引物,M13牧师,然后消化(2 h, 37°C)Msp我和有第三限制性内切酶后,制造商的指示(美国热费希尔科学)。限制片段长度多态性(RFLP)模式可视化使用3.5%小DNA低融化琼脂糖凝胶(Biozym, Hessisch,奥尔登堡,德国),这些数据被用来组phylotypes克隆。RFLP的代表类型使用生物系统高效的优势2纯化PCR净化设备(MoBiTec、哥廷根、德国),然后使用BigDye终止测序v.3.1工具包(应用生物系统公司)和ABI棱镜310 DNA测序仪(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。古细菌16 s rRNA基因的测序片段使用引物了和,而amo一个基因片段测序引物SP6使用向量。

2.6。系统发育分析

获得的序列进行分析并与那些使用爆炸基因库数据库服务器的国家生物技术信息中心(NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。嵌合的存在序列的克隆库使用程序嵌合体检查确定,在核糖体数据库项目二世(11.0版)和柏勒罗丰[41]。相对应的序列与那些最接近的系统发育的亲戚使用Clustal W程序(42]。根据neighbour-joining系统发育树构建方法使用Bioedit软件包。

2.7。数据分析

结果统计分析NCSS97(摘要、Kaysville、犹他州)和平均价值。抽样效率和多样性热点克隆库估计使用基于furthest-neighbour MOTHUR软件算法,和序列分为操作分类单元(辣子鸡)[43)在序列相似性水平(ssl) BuhC≥97%(0.03距离),BuhD≥94%(0.06距离),和Sliv≥91%(0.09)的距离。对于每个样本,古OTU丰富(稀疏曲线,曹国伟1,ACE) [44和多样性(Shannon-Weiner指数)45估计计算。的统计分析amo辣子鸡没有进行,因为数量少,独特的基因序列确定BuhC, BuhD, Sliv克隆库。污染水平表示使用毒性指数(TI)如下: 在哪里是金属的浓度在下层(毫克公斤⁻¹)和ED50金属的总浓度导致微生物脱氢酶活性降低50%(原ED50s来自Welp [46])。

2.8。加入核苷酸序列号码

本研究报告的序列存入基因库下加入以下数字:FM897343为局部热点FM897356 16 s rRNA基因序列和FM886822 FM886831 crenarchaeoticamo一个基因序列。

3所示。结果

3.1。环境变量

Buhovo和Sliven样本不同的地球化学和U和HM污染的水平。BuhC和BuhD采样(铬始成土)从不同土壤深度,当Sliv砂砾石材料收集从矿山废料堆。的质地BuhC(20厘米在土壤深度)划分为砂质粘土粘土淤泥(35%和54%),而BuhD(40厘米在土壤深度)被列为粘土粘土淤泥(38%和60%)。合著的体积密度“从1.5 - -1.6 g厘米土壤不同深度⁻³1.7 - -1.8 g厘米(20厘米)⁻³(40厘米)。土壤孔隙度是36 - 40%(20厘米)和25 - 30%(40厘米)(个人沟通)。没有数据关于Sliv纹理和地球化学的基础,除了有机质含量(0.3%)和pH值(7.5)。合著的“样品的有机质含量是BuhD BuhC为2.8%和1.6%。氮的总量从1.19 g公斤下降⁻¹(20厘米)到1.03 g公斤⁻¹(40厘米),而磷的总量没有明显不同的两层土壤- 0.53 g公斤⁻¹(20厘米)和0.51 g公斤⁻¹(40厘米)。的BuhC和BuhD略酸性(pH值6.9和6.6,分别地)。

主要污染物是铜和锌(BuhC、BuhD Sliv), U (BuhC和Sliv), Cr (BuhC和BuhD), (BuhC和Sliv)、Pb (Sliv)和硫酸盐(BuhD)(表1)。所有网站被个人高度污染的如图所示(沉重的金属钛> 1.0)和钛_总和,减少如下:Sliv (119.38) > BuhC (15.38) > BuhD (9.91)。此外,毒性水平实际上可能会变得更强,如果值考虑了Mn (BuhC和BuhD)和U (BuhC和Sliv),因为他们的浓度也高。然而,钛_总和不包括这些由于缺乏ED50数据。

3.2。系统发育多样性的热点amo一个基因序列

共有355个古细菌克隆(从BuhD BuhC 156, 128,和71年从Sliv)和229年amo从BuhC基因克隆(107年,99年从BuhD Sliv和23)被选中,和他们的16 s rDNA插入被RFLP分析。克隆测序被分为19(热点)和15 (amo辣子鸡,这14个辣子鸡和10个辣子鸡是独一无二的,分别。古细菌BuhC稀疏曲线(辣子鸡)、BuhD (辣子鸡)和Sliv (辣子鸡)克隆库饱和,这表明它们完全覆盖的自然古细菌多样性样品和观察到的辣子鸡是古细菌的一个好的表示社区丰富(图2)。估计的热点丰富(超1,ACE)和多样性(Shannon-Weiner指数)在BuhD预测指标的最高价值,其次是BuhC和Sliv克隆库(表2)。

3.3。古细菌社区组成

16 s rRNA基因序列中确定BuhC, BuhD, Sliv属于1.1 b /Nitrososphaera群Crenarchaeota(图3)。代表其他crenarchaeotic演化支或其他古门没有在本研究中发现。

crenarchaeotic序列分为集群(A和B;图3)。集群涉及16 s rRNA基因序列检索主要来自Sliv和BuhC的高度污染的环境。集群B的辣子鸡、从BuhC BuhD(226 227克隆)的库。后者集群分为subcluster IB,生成的序列BuhD克隆库(36 37克隆),和IIB subcluster,主要由克隆属于BuhC和BuhD库(190 196克隆)。

有共同的(BuhC-Ar8 BuhC-Ar18 BuhC-Ar48,和BuhD-Ar111) 16 s rRNA古细菌基因序列的克隆库BuhC BuhD。我们没有获取任何基因序列共同Sliv合著,“根基。

所有检索到的16 s rRNA基因序列匹配序列无教养的古生菌,除了Sliv-Ar32,隶属于培养archaeonCandidatus Nitrososphaera gargensis(NR_102916)。

3.4。的组成amo一个社区

10古细菌的系统发育分析amo辣子鸡透露一个高序列标识(98 - 100%)与ammonia-oxidizing crenarchaeotes。集群的系统发育树amo基因序列是由两个从Sliv辣子鸡,而集群II和III只有组成的辣子鸡Buhovo土壤环境(图4)。总的来说,所有amo辣子鸡是在相对较少的克隆1 - 15(克隆),除了BuhD-A-24及其模拟OTU BuhC,分别由55和92克隆。

所有检索到的热点amo一个序列与无教养的crenarchaeotes。

蛋白质序列也源自相同的样本分析,和数据验证我们的DNA结果(数据没有公布)。96 - 100%的蛋白质序列表现出相似性从陆地基因库序列最接近匹配检索,河口,温泉环境。

4所示。讨论

BuhD, BuhC和Sliv热点社区似乎完全由soil-freshwater-subsurface小组的成员组成Crenarchaeota (1.1 b),这是最近由Bartossek et al。49]Nitrososphaera集群。Crenarchaeota在这些网站的存在并不令人感到意外,因为这些生物普遍存在(4,7,50),甚至在U和HMs的环境严重污染5,7,13,51]。可能只有1.1 b的选择和传播Crenarchaeota Buhovo和Sliven传递的力量下U和HM污染。支持这个概念,盖斯勒et al。52),那个宿舍叫赖茨et al。14],Radeva et al。53)报道,一个强大的古细菌多样性和减少从1.1 Crenarchaeota转向1.1 b与硝酸铀酰的土壤样本中补充。U的副作用也证实了波拉特et al。5),发现低在U -古细菌多样性/ nitrate-contaminated沉积物的橡树岭流(TN、美国)。

基础的重要性和水平的污染crenarchaeotic模式的分布是明显的古细菌的系统发育树(图3),辣子鸡分组在一个大集群中(B)基于从土壤Buhovo 16 s rRNA基因序列(9 10辣子鸡/ 226 227克隆),另一个更小的集群(A)形成最污染环境的辣子鸡,Sliv和BuhC(4 6辣子鸡/ 114 128克隆)。没有共同的16 s rRNA基因序列的两个下层合著(“土壤和Sliv砂砾石)进行了研究。

网站的独特的物理和化学领域港口crenarchaeotic人口特征(图3):(i)典型土壤物种宽容对极端环境,包括U和HMs阻力(IIB subcluster成员);(2)深度特定物种,也许,敏感U和HMs subcluster IB(成员);和(iii)对U和HM土壤和岩石居民(集群)。所有的辣子鸡对应于陆地环境匹配,除了Sliv-Ar44 BuhD-Ar100, BuhD-Ar111,表现出高相似度(99 - 100%)与基因序列来源于水生环境:地下水(KC604547)、深海沉积物(HM998417),和海水深度660米(AY367312),分别。一般而言,上述与水相关的辣子鸡只代表一小部分克隆(1 - 15)。

合著的“土壤环境组成更复杂和更多样的古细菌社区:84%的辣子鸡和80%的热点合著的“克隆,验证数据从Ochsenreiter et al。7]表明1.1 b crenarchaeotic进化枝是一个典型的“土壤血统。”

古细菌多样性合著的“土壤相对较低,变化从0.97 (BuhC) 1.51 (BuhD),并深度依赖。古细菌两种土壤深处包括常见的社区(BuhC-Ar8, BuhC-Ar18, BuhC-Ar44 BuhC-Ar48, BuhD-Ar111)和depth-specific 16 s rRNA基因序列,后者由少量的克隆1 - 15(克隆)。主导OTU BuhC-Ar8均匀分布在土壤深度,由45%和48%的克隆从BuhC检索和BuhD,分别。此外,它密切关联(SSL) 99%无教养的crenarchaeote gitt - gr - 74 (AJ535122),这是发现在萨克森铀厂尾矿中,德国(13]。

深度依赖热点分布趋势也观察到在其他的研究中,这表明Crenarchaeota更丰富的更深的土壤层(54- - - - - -57)和古细菌:细菌比例随着土壤深度的增加(2]。在上述研究中,增加大量的crenarchaeotes与减少营养物质(有机碳和无机氮)和深层土壤中氧气浓度层。同意上述声明,我们可以推测BuhD Crenarchaeota的多样性是青睐的营养和氧状态的土壤深度和其低水平的U和HM污染。相对相反的条件在BuhC土层比较BuhD(有机质含量高,高在上部土层曝气,和更高水平的U和HMs)限制其古细菌多样性主要三大辣子鸡(BuhC-Ar8, BuhC-Ar18, BuhC-Ar48)持有93%的克隆BuhC克隆库。

的砂砾石基础Sliv及其高水平的污染让古细菌增殖这环境很不利。Sliv的居民提出的两个主要辣子鸡(Sliv-Ar32和Sliv-Ar22)占克隆的99%。所有热点16 s rRNA基因序列从Sliv检索与无教养的crenarchaeotic比赛,除了Sliv-Ar32,展品99%相似Candidatus Nitrososphaera gargensisGa9.2。根据斯潘et al。58),Ca。n . gargensis是适应HM-contaminated环境和编码的HM抗性基因表达遗传应对环境变化的能力。的密切相似Sliv-Ar32 Gitt-GR序列(99% SSL)德国U选矿尾矿的回收也证实了高Sliv-Ar32公差对U和HM污染。,更丰富的OTU Sliv-Ar22克隆(40),及其在Sliv优势克隆库都可以解释宽容对高水平的污染和能力Sliv-Ar22 archaeon殖民岩石根基。这个序列表现出文化的高度相似性,crenarchaeote QA4 SSL(99%),这是恢复石英岩石位于西藏中部的高海拔苔原(59]。

系统发育分析的热点amo基因序列从BuhC检索、BuhD Sliv揭示了Crenarchaeota居住在这些地区港口氨氧化剂(图4)。的模式amo基因序列分布相似的Crenarchaeota辣子鸡的最小数量在最不利的环境Sliv(2辣子鸡/ 23克隆),其次是高度污染的BuhC克隆(5辣子鸡/ 107)和相对较低的污染BuhD(6辣子鸡/ 99克隆)。高数量的amo最高的辣子鸡BuhD有关这个深度和古细菌多样性是由于有利条件(低有机质、氮和氧含量和高粘质土壤质地)刺激不仅古细菌多样性,而且ammonia-oxidizing古生菌的多样性。到目前为止,研究[33,60- - - - - -63年]研究环境因素的形状amo基因多样性的海洋、沉积物和土壤已经确定这些因素的主要环境参数ammonia-oxidizing古生菌的扩散。

百分之四十六的热点amo辣子鸡,占73%的克隆检索在这项研究中,从属与热点amo一个从淡水生态系统获得的基因序列64年,65年和污水处理厂66年]。这些属于“土壤和其他环境”集群中,普罗塞提出的和(考67年]。另一个amo辣子鸡(所有从BuhD和BuhC)展览基因序列密切相关的检索从土壤环境像散装60)和耕地(FN691264 HM803786)土壤、草地(HQ267736 EU671839)和半干旱土壤(JQ638739)也属于“土壤和其他环境”集群(67年]。

BuhC和BuhD非常不同的环境对土壤质地,营养物质、氧气(低土壤孔隙度),和污染状况。然而,这两个环境中居住着ammonia-oxidizing古生菌由的存在amo一个基因序列;BuhD-A-24占23% (BuhD)和41% (BuhC)检索amo一个克隆。很可能的独家统治BuhD-A-24 Buhovo土壤深度是污染的不利影响的结果,减少热点amo选择的多样性和只有几耐药基因序列。我们没有检测到新热点amo一个集群,表明存在的特殊的U -和HM-resistant ammonia-oxidizing古生菌在网站进行了研究。这揭示了ammonia-oxidizing古生菌的广泛分布和一些物种的能力容忍U和HMs的高水平。

5。结论

系统发育分析显示,所有古16 s rRNA基因序列评估在这个研究属于1.1 b /NitrososphaeraCrenarchaeota集群。的多样性crenarchaeotic社区居住的三个网站利息很低,尤其是在高U -和HM-polluted, sandy-stone Sliv矿山的环境。古细菌社区合著的“和Sliv矿山是不同的每个站点,没有港口共同的基因序列。我们没有发现小说crenarchaeotic和amo一个基因簇,表明合著的“污染环境和Sliv居住着典型的古土壤血统。很可能这些古土壤血统被选到当地环境的多因子的性质,导致宽容的发展本土古生菌高U和HM污染。的热点amo检测到基因序列在BuhC、BuhD Sliv认为ammonia-oxidizing古生菌参与氮循环与U和HMs环境严重污染。这项研究将有助于理解古细菌和ammonia-oxidizing古细菌多样性与U和HMs土壤污染。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

本研究支持的财务资源生态学研究所Helmholtz-Centre Dresden-Rossendorf,德国。

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