古细菌组合栖居于温带混交林土壤分类单元组成和空间分布随时间的波动

文摘

本研究探讨不同热点的持久性和空间分布聚集居住的温带森林生态系统。坚持在当地条件下测量从2001年到2010年,2011年和2012年相比之下的16 s rRNA基因克隆库。古细菌组合在每一个时间点被发现明显不同(AMOVA,),这种差异的性质依赖于分类等级。例如,世界性的属g_Ca。Nitrososphaera (I.1b)被发现在所有时间点,但在这个分类单元的丰富s_SCA1145, s_SCA1170和s_Ca。随着时间的推移n gargensis波动。此外,空间异质性(分布)在这些时间点测量使用1 d TRFLP-SSCP指纹屏幕覆盖多个空间尺度上土壤样品。这包括土壤收集的小卷3立方厘米大的刻度,50米的表面积²相隔1.3公里的阴谋,一个单独的位置23公里。古生菌在这些样本的空间分布变化随着时间的推移,虽然g_Ca。Nitrososphaera (I.1b)在更大的尺度上,占主导地位的补丁被发现在较小的尺度上,由其他类群。本研究测量的程度随时间变化对古细菌分类单元组成和分布在温带森林土壤混合。

1。介绍

我们理解古生菌存在于土壤已扩大指数在过去几十年里通过使用分子工具文化无关。这导致了小说的发现热点血统在陆地环境中(1]包括最近公认的门,Thaumarchaeota [2,3)的成员,后来被证明扮演着至关重要的角色在全球氮循环通过执行在大多数土壤硝化作用的病原反应步骤(4]。在过去的十年中热点发展史已经被成功培养大大提高Thaumarchaeota在隔离和充实的环境的主要成员。这些环境各不相同,例如,海洋,Nitrosopumilus maritimus(5];温泉在北美和西伯利亚,Nitrosocaldus yellowstonii和Nitrososphaera gargensis(6,7];从土壤不同的嗜中温,最近网站,Ca。Nitrosoarchaeum koreensis,Ca。Nitrosotalea devanaterra,Ca。Nitrososphaera viennensis应变EN76和JG18- - - - - -11]。的栽培物种代表土壤最丰富的类群,g_Ca。Nitrososphaera,s_Ca。n gargensis有三个培养代表(7,8,11),s_SCA1145丰富但相对丰度较低12],s_SCA1170尚未种植在实验室设置。第二个主要土壤进化枝,o_NRP-J,比g_基因更为多样化Ca。Nitrososphaera但不包含一个培养代表。成功培养Thaumarchaeota物种基因组研究使最近的基因组Nitrososphaera gargensis据报道,相比其他Thaumarchaeota基因组可用13]。总的来说,这些研究导致了前所未有的洞察力g_的进化和生理学Ca。Nitrososphaera,但其他热点血统在土壤的生态意义仍有待确定。在这项研究中,我们探讨了土壤古菌的持久性和空间分布,以确定分类单元组成和分布是稳定的。通过更好的定义利基隔离不同热点血统在时间和空间,未来的研究可以针对这些血统在土壤的环境生态学。

虽然我们不知道其他研究的直接测量时间动态土壤古菌在一个位置在多个年,一些时间信息可以从比较的16 s rRNA基因存入基因库。例如,克隆SCA1145, g_的成员Ca。Nitrososphaera,从1995年的耕地土壤中分离收集WI,美国(14]。这个序列已经被实验室随后放大独立工作在不同的大洲。即使有严格的定义等phylotype 100%超过1300核苷酸序列身份,SCA1145已发现多个从1995年到2010年,包括奥地利,2005年(轮值表- 75活动花絮,DQ278116);墨西哥,2009年(TX1C04 FJ784302);和日本,2010 (K09_0_56 AB541694)。虽然这显示SCA1145一再采样在全球层面,目前尚不清楚这种模式的结果建立持续的人口在每一个位置或一个物种在不断变化的捕捉机会。

世界土壤微生物水平,代表着一种非常异构环境充满隐居,可以改变从一个砂粒。虽然这曾被认为是一种障碍理解土壤生态学、一个不受欢迎的可变性来源当抽样微生物在本地环境中,随着时间的推移,测量空间变异性的重要性和使用产生的知识来指导抽样策略已变得更为明显(15]。土壤而言,小规模抽样铵和nitrite-oxidizing细菌显示的空间结构可以存在在毫米范围内(16),而在全球范围内大规模的抽样表明最多元的古细菌组合出现在森林或灌丛带与沙漠/干谷,农田和草地/草原(17]。在这项研究中,我们使用多尺度采样的温带混交林网站,包含不同土壤古菌的组合测量持久性多个时间点。此外,土壤古菌的时间空间分布比较小卷3立方厘米和更大的刻度,50米的表面积²相隔1.3公里的阴谋,一个单独的位置23公里。

2。材料和方法

2.1。样品收集

集合地点在这项研究中,石头的口袋和辛普森,附近以前采样地点:A, B, C、G H和W检测只港g_古生菌列示Ca。Nitrososphaera(18]。这些网站代表各种不同的地质过程形成的土壤(表1)。石头的口袋和辛普森在威斯康辛州中部无目标的区域的一部分,美国被包围,但不是被冰川覆盖在最后一个冰河时代(图1(一))。水壶碛地区两个冰川叶发生碰撞时形成的消退离开冰川沉积物和坑(壶)挖到地球。采样站点A, B, C、G, W是位于土壤在锅的边缘附近碛无目标的区域。汉考克采样站点(H)位于砂质沉积沉积由冰前的湖排水在灾难性洪水的当前路径威斯康星河冰川消退~ 14000年前。

石头的口袋位置是相邻的巴克斯特的空心大自然保护协会在威斯康辛州放置山麓,距西麦迪逊农业研究站(43公里网站W在图1(一))SCA1145最初发现于1995年(14),但不同于研究站,这个网站一直在当地条件下的纵向研究。辛普森的地方也是一个混合温带森林网站但位于一个单独的分水岭西北23公里,毗邻戴尔河国家野生动物保护区(图1 (b))。三块,指定L,我和J,采样的石头的口袋位置(图1 (c))。情节L和我彼此相邻,和情节J是1.3公里。第四个情节,指定K,在辛普森采样收集网站。2001年,整个情节我收集土壤样本,J, K L,作为一个单独的研究(19]。情节边界被定义在这个时候基于最小的区域,包括下列不同植物血统:石松植物(石松),蕨类植物(蕨类植物)、裸子植物(针叶树)双子叶(双子叶植物)和单子叶植物的(单子叶植物)。由此产生的情节是10的表面积,35岁,50岁和15米²情节我J L,分别和K。情节是重新取样每年从2010年开始每年的同时,深秋,在11月的最后一个星期,除了情节K 2010年不取样。每年,复制收集土壤样本沿横断面跨越每一个情节。使用一些复制从每个情节在这项研究中,而其余复制被储存在−80°C跨度较长时间段的未来研究。

土壤样本采集的表层土壤首先移除覆盖植物碎片如树叶和树枝。每一个土壤样本收集使用热压处理过的供应面积~ ~ 1.5厘米宽,1.5厘米深的混合土壤与金属microspatula同质化~ 3立方厘米(公分³)的土壤。这然后将均质土壤转移到一个微型离心机管和flash冷冻领域使用液态氮(2001年收集的样本)或干冰(样本收集了从2010年到2012年)。土壤样本存储在实验室−80°C到DNA提取。

2.2。DNA扩增和指纹

DNA提取100 - 250毫克的土壤样本使用PowerSoil DNA隔离设备(莫生物实验室)后,制造商的协议。DNA浓度和纯度测定使用NanoVue spectrophotomer然后稀释5 ng /μL反应。DNA模板使用高保真放大Phusion热启动第二缓冲区。反应包括1 x高频缓冲区,0.2毫米核苷酸,5 pmol底漆,5 pmol反向引物,2毫克nonacetylated BSA (Ambion), 5 ng模板DNA,和0.4 U Phusion热态启动二聚合酶(新英格兰生物学实验室Inc .)在最后一卷15μl . PCR条件包括98°C的初始变性步骤30年代,紧随其后的是40 98°C的周期10年代,55°C 10 s,和30年代72°C,紧随其后的是最后一个扩展为5米72°C。SSCP、DNA模板放大使用引物133 f / 248 r如前所述18]。指纹识别的一维终端限制片段长度Polymorphism-Single链构象多态性(1 d TRFLP-SSCP)和克隆图书馆建设,DNA模板放大使用引物133 f - 1492 r和扩展时间增加到1米20秒。一些样品没有产生DNA指纹分析和PCR产品被排除在分析;包括2001年情节我复制,2011情节我复制和2012 K复制。

1 d TRFLP-SSCP结合的分析方法,提供了一个更高的动态范围通过生成SSCP概要文件为每个TRFLP phylotype在单一凝胶。我们测试了这种方法的实用程序对2001年和2010年克隆库的区别在网上并确定双消化使用酶CfoI和ApaI能够区分最大数量的序列和广泛的分类群。所有的序列图4隶属于g_Ca。Nitrososphaera会产生一个TRFLP phylotype 206个基点;的o_NRP-J序列产生的碎片90、180、200和240年,而非保密古生菌(UA)序列将产生109个基点的片段。

DNA指纹图谱进行了以下(18]。正向引物133 f,包括红外线IRDye-label (IRD700)检测在Licor DNA分析仪和六phosphorothioate债券5′末端防止非特异性λ核酸外切酶消化。248和1492 r,反向引物5′磷酸化,使选择性λ核酸外切酶消化的互补的DNA链。限制消化和λ核酸外切酶消化(新英格兰生物学实验室)进行根据制造商的协议。样本准备DNA指纹图谱通过混合反应停止解决方案(95%的甲酰胺,10毫米氢氧化钠)的比率2:1,加热到95°C 3分钟,然后立即吸附在冰浴冷却。体积为0.5μL每车道被发现到膜库姆斯(凝胶公司)开始之前电泳。Nondenaturing聚丙烯酰胺凝胶,0.5 x身边(Lonza),涨跌互现根据制造商的指示和扔在61厘米硼硅酸盐板0.2 mm间距器。片段分离Licor DNA分析仪4300使用1 x此种运行缓冲和凝胶的温度24°C。凝胶图像收集在ImageJ TIF文件和打开(20.)生成重复使用免费ImageJ凝胶分析仪。SSCP重复被转换为一个矩阵的相对强度/ phylotype生成因子分析的数据集。IBM SPSS统计(Windows版本)是用来计算主成分比较抽样可变性情节L,我,随着时间的推移和J。

许多不同的术语是用来描述古细菌类群和1 d TRFLP-SSCP检测。主导地位测量是相对丰度最高的古细菌分类单元。频率一个分类单元的检测的次数高于样品中检出限。这提供了空间分布的信息都在一个情节和在给定的位置。补缀的性质(空间异质性)还提供了信息空间分布和测量的标准偏差表每年列出的分类单元2。高标准差表示异构补丁表现出大范围的相对丰度,而低标准偏差表示更统一的空间分布与类似的相对丰度的范围。验货补缀的性质也可以直观地评估每个情节酒吧图表的数据5和6。

2.3。克隆库和序列分析

PCR克隆产品生成所述1 d TRFLP-SSCP但替换标记引物。PCR产品提纯Promega向导SV工具包和克隆使用零钝威尼斯平底渔船PCR克隆工具(表达载体corp .)。殖民地运往DNA设施爱荷华州立大学生物技术办公室的质粒制备和桑格排序根据标准协议。色谱手动被检查调用适当的基地,并与模棱两可的山峰被重新测序克隆这样没有出现在最后一叠连群模棱两可的基地。叠连群筛选使用BLASTN删除任何细菌序列和识别克隆其他研究中被孤立。删除假定的嵌合体,序列与纳斯特,然后分析与柏勒罗丰GreenGenes.lbl.gov网站(21]。这导致五嵌合序列数据集。对齐是手动检查并在必要时修正与绿色煤电参考校准和二级结构预测。结果克隆库含有144 ~ 1300元序列对齐。开源mothur环境(22)是用来计算操作分类单元(辣子鸡)在不同的遗传距离使用平均邻居聚类。mothur环境也用来计算稀疏,多样性指数和AMOVA Bonferroni重复校正措施比较从不同的年克隆库。仿真研究表明AMOVA提供一个适当的统计检验来确定微生物组合是不同的(23]。然后确定克隆库分组系统最大似然树与引导支持为每个节点计算推断。最近邻序列选择可用时,至少1200元,97%以内的遗传相似性克隆的序列。外围集团在代表分类排名被添加到突出位置的演化支名叫绿色煤电分类和说明的系统发育地位UA克隆WI21。树是推断PhyML [24GTR)使用模型,被选为最优模型,这个数据集jModelTest [25)使用Akaike信息标准。

2.4。分类

最近提出了绿色煤电分类提供了新的名称为土壤古菌(26]。来改善可读性在这篇文章中,我们将使用绿色煤电前缀“s_”物种的墓志铭,属“g_”,和“o_”秩序,指在绿色煤电类群指定。因此最常见的和丰富的古细菌在土壤分类单元,Thaumarchaeota集团I.1b [17,27),对应于新属g_提议Ca。Nitrososphaera。在这个属三个类群在物种水平上,被评为s_Ca。N。gargensis,s_SCA1145, s_SCA1170。第二个最频繁和丰富的古细菌在土壤分类单元,I.1c Thaumarchaeota组,对应于一个更广泛的分类等级,o_NRP-J顺序。额外的分类群在这个订单还没有被指定,没有培养代表目前可用。第三个古细菌分类单元,Thaumarchaeota I.1a,经常发现在海洋环境中,但也发现在低丰度在陆地环境中。两个I.1a属居住土壤Ca。Nitrosotalea和Ca。Nitrosoarchaeum。这些都是包含在种系发生树如图4。没有在这项研究中产生的序列分组在这个进化枝。最后,古细菌16 s rRNA基因序列以外的Thaumarchaeota一直在土壤调查发现,通常在低丰度(17,27]。这些产甲烷菌的一些集群内Euryarchaeota而另一些则不保密的热点(UA)序列与Euryarchaeota和Thaumarchaeota截然不同。

3所示。结果与讨论

3.1。比较土壤样本使用SSCP指纹在石头的口袋里

测量持久性古生菌的土壤,我们选择一个地方,石头的口袋里,包含了一个共同的土壤,放置粉砂壤土,形成主要靠风传播的沉积的灰尘(表1)。我们首先确定变化的土壤样品在本地使用单链构象多态性(SSCP)的DNA指纹图谱。

SSCP DNA指纹图谱特征微生物组合基于不同的DNA片段分离序列组成。独特的序列有可能形成一个独特的单链二级结构会产生一个峰值(phylotype)通过聚丙烯酰胺凝胶迁移。这些phylotypes代表一个或多个独特的序列,和由此产生的DNA指纹图谱的组合可以用来比较样本的丰富性(phylotypes数量样本)和均匀度(每个phylotype)的相对丰度。这些值可以被转换成一个数据矩阵进行主成分分析(PCA)可变性形象化数据集,进行统计测试。

2001年,SSCP比较采样站点的A, B, C、G H和W(图1(一))透露,可变性在每个站点是足够低,三个土壤样本,每个从最初卷3 cc收集样30厘米,是足以检测这些位置之间的显著差异(18]。

在石头的口袋里我们比较三个土壤样本收集的可变性情节J,遥远的情节、变化出现在3 L和采集土壤样本的地块的我,邻地块(图1 (c))。如果古细菌的多样性组合在石头的口袋是与距离,三个土壤样本情节J将形成一个明显的集群在PCA祝圣礼阴谋。另一方面,如果古细菌组合不统计不同,那么土壤样本情节J将与L重叠,即结果显示这三个情节在每个时间点的重叠(图2)。土壤样本来自位于多远;情节J是1.3公里远的;比土壤样本我在13 m和L,然而,在每个时间点取样,J样本集群内的变化出现在我和L .情节图PCA祝圣礼2证明我们的抽样策略的三块石头的口袋里包含了变化检测到SSCP在这个位置。

以前的工作现场H(图1(一)SSCP)用于样本空间异质性三个复制块在农业领域(350米²)露出一个不均匀,片状分布phylotypes [18]。phylotype分布在石头的口袋里,发现了一个类似的不均匀分布。一些土壤样本块L I, J包含独特phylotypes缺席或低丰度在其他样本。

3.2。持久性的热点组合在石头的口袋里收集的网站

研究古细菌组合如何随着时间的推移在序列水平不同,我们建造2001年16 s rRNA基因克隆库,2010,2011,2012。确保所有独特phylotypes代表在每个克隆库,每年5个土壤样本汇集一起,包含所有的独特的SSCP phylotypes发现在每个时间点。这些代表DNA样本包括至少一个土壤样本的每个三块石头的口袋里。通过选择对土壤样品只包含复制phylotypes,由此产生的克隆库偏见最大化之间的物种随时间波动检测广泛的分布和有限的。

稀疏曲线为每个克隆库显示高覆盖率的序列在某些遗传多样性水平(图3)。每年的克隆库显示0.03遗传多样性的大挠度曲线表明大部分的序列存在于样品内操作分类单位(OTU) 97%的遗传相似性都包含在库。丰富,定义为独特的序列克隆库的数量,是2010年最低α多样性指数以0.03遗传多样性。香农指数是1.6,曹国伟是6辣子鸡。以确定是否热点组合显著改变随着时间的推移,一个AMOVA测试。每年的克隆库被发现是独特的一个值< 0.01。

对比库是不同的在每个时间点,构建系统发育树(图4)。这个相同的数据也提出了通过一年更好的可视化的克隆在每个时间点补充图1(见补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/870825)。许多相同的序列在每年多次被发现;这是显示在图克隆后的名字1,每个重复在补充图1分别列出。也比较各种OTU级别我们使用平均邻居聚类将重叠的酒吧旁边的描述这些数字的系统发育树。大多数在门Thaumarchaeota序列,但在2010年最频繁采样序列包括非保密古细菌(UA)序列有不到80%的遗传相似性Thaumarchaeota Euryarchaeota。这个序列的检测极限低于其他库(补充图1)中定义的分类单元。绿色煤电分类,订单o_NRP-J在2001年和2010年被发现,但没有发现在最后两年抽样。物种s_SCA1145和s_SCA1170每年检测但在丰富而s_多样Ca。n gargensis没有发现在2011年和2012年。

在100%水平的序列的身份,只有一个克隆与序列之前存入基因库,SCA1145,最初是克隆16倍(筛选克隆测序400元。)从1995年的耕地土壤收集现场W (14]。在这项研究中,SCA1145序列(由测序克隆筛选1300元)于2001年克隆的两倍,2011年的7倍,但低于其它年份的检测极限。发现在这个级别的其他序列在多个年WI318和WI39发现在2011年和2012年,WI17发现在2001年和2012年。

总之,不同分类的持久性在石头的口袋里发现随着时间推移而改变。在广泛的分类排名,Thaumarchaeota集团I.1b在所有时间点而o_NRP-J占主导地位从次要成分的组合和UA波动低于检出限后一年的时间跨度。根据这些结果,我们下一个使用多尺度采样在更大空间范围内(i)定义的利基空间可以由I.1b I.1c或UA和(2)确定随着时间的推移,这些殖民地的栖息地的稳定性。

3.3。空间分布的热点组合

在石头的口袋里,额外的土壤样本异形使用1 d TRFLP-SSCP指纹调查三个分类单元的空间分布随着时间的推移,即g_Ca。Nitrososphaera,o_NRP-J和UA。结果1 d TRFLP-SSCP重复被转换为相对丰度图组合,绘制在图5。每个酒吧都代表一个热点组合从一个小土样,卷土~ 3立方厘米(公分³)。这些样品组织越来越大的空间尺度上,首先是复制相同的情节,贴上L I, J复制。在下次空间规模,情节L和我相邻,情节J是遥远的情节在石头的口袋位置。样本土壤位于一个更大的距离和不同的地方,情节K在辛普森收集网站添加到这个分析(图1 (b))。辛普森也归类为温带森林生态系统和位于相同的无定向的威斯康辛州中部但包含一个沙质土壤,是一个单独的一部分沿威斯康辛州河流域。收集样本的热点在多尺度组合允许将比较在更大空间范围比线性抽样策略。

发现空间分布变化和持续的时间跨度一年和一个十年的根据空间规模和分类单元。在水平位置,所有三个类群出席了斯通的口袋和辛普森收集站点,I.1b始终占主导地位的历史时刻,I.1c紧随其后。在较小的空间尺度的情节,I.1b主导除了一个情节,I.1c主导策划2010年J。只有UA被发现在情节规模低于检测极限。最大的变化发生在最小的空间尺度采样。在这些个人土壤样本,所有三个类群,I.1b, I.1c, UA,能够控制在100%,91%,和63%的相对丰度,分别为(表2)。此外,它是可能的在这个空间为每个分类群规模低于检出限,甚至经常主导I.1b没有一些样品,两个2010年J复制。这些结果表明,分布在异构环境中如温带混交林土壤发生在cm的规模,和小尺度需要采样找到栖息地由o_NRP-J完全主导或完全由UA。额外的研究微尺度水平是必要的来定义这些补丁将如何形成并成为居住着古生菌。

4所示。结论

本研究测量的程度改变古细菌分类单元组成和分布在温带森林土壤混合。比较2001年发现序列分类单元的水平,2010年,2011年和2012年,存在古细菌组合(AMOVA明显不同)。在狭窄的分类排名能被探测到的16 s rRNA序列跨越1300元,持久性是罕见的。比较越来越广泛的分类排名显示,古生菌在物种水平也随着时间的推移,波动但Thaumarchaeota属g_Ca。Nitrososphaera在所有克隆库占主导地位。空间分布特点是在相同的时间点使用1 d TRFLP-SSCP g_指纹Ca。Nitrososphaera,o_NRP-J和非保密古生菌(UA)。这些类群形成动态的补丁,波动不均匀在多个尺度上的时间和距离。属g_Ca。Nitrososphaera最多是占主导地位的尺度和时间点,但是补丁被发现在温带森林生态系统是由混合o_NRP-J吗和UA。这项研究表明,(我)古细菌组合结构随时间的变化和空间和(2)补丁动力学的立方厘米影响古土壤生态学在温带森林生态系统混合。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢大学化学系4300 LiCor DNA分析仪使用DNA指纹图谱和乔博士待价而沽储存冷冻2001份土壤样本的威斯康辛大学麦迪逊WI,美国。资金由大学提供a科尔比Swanson飙升奖。马雷克·k·瓦沃米尔-希利温斯基是由大学提供资金能力建设格兰特和UNI EPSCoR拨款。

补充材料

引用

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