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佐藤晴Tomoko Keiko渡边,山本英夫,山本秀一,Norio黑泽明, ”古细菌群体结构的硫气酸性温泉与不同温度和元素成分”,古生菌, 卷。2013年, 文章的ID723871年, 11 页面, 2013年。 https://doi.org/10.1155/2013/723871
古细菌群体结构的硫气酸性温泉与不同温度和元素成分
文摘
古细菌16 s rRNA基因成分和环境因素的四个不同酸性硫气Kirishima温泉,日本进行了比较。选择四个池塘温度和总溶解元素浓度的差异如下:(1)池塘:93°C和1679毫克L−1(2)池塘b: 66°C和2248毫克L−1(3)Pond-C: 88°C和198毫克L−1和(4)Pond-D: 67°C和340毫克L−1。总的来说,431年16 s rRNA基因的克隆分为26 phylotypes。在池塘b,古细菌多样性是最高的在四个,和订单的成员Sulfolobales占主导地位。Pond-D还展示了相对较高的多样性,最常见的组无教养的thermoacidic春天克隆组。池塘b和Pond-D相比,更多样化的古细菌克隆被发现在池塘和Pond-C显示更高的温度。然而,这些池塘主导群体也不同。订单Sulfolobales共享的成员总数的89%克隆在池塘,和无教养的crenarchaeal团体共享Pond-C克隆总数的99%。因此,物种组成和生物多样性明显不同的池塘中显示不同的温度和溶解元素浓度。
1。介绍
极端环境中独特的地方研究生物体相互作用和如何适应环境。一些高温环境特别是地面温泉和海洋等热液喷口可能像火山的栖息地,被认为是地球早期(1- - - - - -3]。事实上,一些古细菌和细菌的血统确定从温泉似乎与血统接近根的种系发生树4]。
温泉微生物群落等许多领域都已经被广泛地研究过了在美国黄石国家公园(5- - - - - -10),在俄罗斯堪察加半岛温泉(11),岛上的小安的列斯群岛(12,13冰岛温泉(),11,14),太Unzen温泉在日本。15),Ohwakudani温泉在日本(16),在意大利Pisciarelli温泉(17在泰国,Bor Khlueng温泉(18在新西兰,Wai-o-tapu地热区域(19在中国,腾冲温泉(20.]。这些开创性的作品使原核社区更好的升值在高温环境。然而,尽管数十年的研究,我们仍然相对较少了解环境因素之间的关系和温泉原核的社区。显示,这是很重要的环境因素影响原核的社区结构和多样性在个人温泉的栖息地。温度可能已经获得了最多的关注,但其他制约因素可能包括pH值、氧化还原电位、元素组成、和有机物组成。在这项研究中,我们比较了古细菌群落结构和多样性的四个不同酸性硫气Kirishima温泉,日本。
2。材料和方法
2.1。样本收集和分析元素成分溶解
研究中的调查温泉位于一片一平方公里Kirishima地热地区在日本(Kirishima国家公园(图)1、表1),广泛从更新世火山活动发生,沉淀一堆厚厚的火山岩(21]。Kirishima火山,在日本最大的第四纪火山之一,属于鹿儿岛的北部地堑,volcano-tectonic萧条[22)由菲律宾海洋板块的俯冲引起的。这个火山占地面积约20公里×30公里西北到东南方向的细长,包含20多个小火山(23]。
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| 检出限是0.001毫克L−1。 |
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采样位置Kirishima地热区域内是一个私人土地;因此,人们通常都不允许侵犯。我们被允许带温泉的水,土壤,以及其他本地样本从土地所有者在这个领域。有许多温泉和泥塘显示各种温度和元素成分。
浑水样本收集到无菌100毫升玻璃瓶在每个池塘。温度和pH值样本,测量在每个采样站点。每个样本过滤使用0.22的一部分μm膜滤器(旭硝子)和受到溶解元素浓度分析使用电感耦合等离子体发射光谱(icp - 7000版本。2、日本岛津公司)。在目前的研究中,我们选择了四个池塘显示一系列温度和溶解古社区的元素成分分析。
2.2。16 s rRNA基因克隆库和测序
环境DNA提取从5到10 g的每一个泥泞的水样本使用超净土壤DNA装备大型预科(莫生物实验室)根据制造商的指示。使用GFX PCR的沉淀DNA纯化DNA和凝胶带净化设备(通用电气医疗集团)。
纯化的DNA作为模板放大的热点16 s rRNA基因archaea-specific底漆A21F: 5′-TTCCGGTTGATCCYGCCGGA和通用引物U1492R: 5′-GGYTACCTTGTTACGACTT。PCR条件包括初始变性步骤在94°C 3分钟,其次是35周期为30秒94°C的变性,退火30秒55°C,在72°C和扩展使用前2分钟TaqDNA聚合酶(豆类生物)。这是紧随其后的是最后一个在72°C扩展了10分钟。
PCR产物纯化使用上述GFX工具包并被绑定到pT7蓝色T-Vector (Novagen)。大肠杆菌DH5α细胞转化质粒库,并镀上包括100磅盘子μ克毫升−1氨苄青霉素,40μ克毫升−1半乳糖苷,0.5毫米IPTG。蓝色/白色的选择是由随机选择和接种的个人100年白人殖民地μ包含100 L 2×欧美媒体μ克毫升−1氨苄青霉素在96孔板在一夜之间37°C。插入的16 s rRNA基因放大使用1μL文化与上面提到的相同PCR过程模板。大约800个基点的5′地区每个16 s rRNA的基因克隆测序了上述archaea-specific底漆A21F和用于分类和系统发育分析。
2.3。16 s rRNA基因克隆鉴定和系统发育分析
16 s rRNA基因序列编辑使用MEGA5(分子进化遗传学分析,http://www.megasoftware.net/)[24]。我们也寻找嵌合体序列通过手动检查序列比对使用GENETYX版本。10.0.3软件(Genetyx)。克隆有97%的序列相似性或被视为一个phylotype更高。代表每个phylotype序列与16 s rRNA基因序列相比,发表在《国家生物技术信息中心DNA数据库使用爆炸(BLASTN;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)[25)来识别个体克隆。代表序列中每个phylotype和相关序列的基因库使用CLUSTALW版本数据基本一致。1.83项目(26]。最大似然树包括引导概率使用MEGA5(1000量)是构造。
2.4。统计分析
测量的理想包括丰富性、多样性不同物种的数量或组,和均匀度,这些组织的分布27,28]。Shannon-Weaver指数(29日),,辛普森的互惠指数(30.),1 /D,在那里,πphylotypes的比例吗相对于phylotypes的总数,都考虑到丰富度和均匀度(13,28]。Shannon-Weaver指数和辛普森的互惠指数计算使用估计8.0 (31日]。均匀度也计算(32]。估计8.0也用来计算Chao1丰富非参数估计量(33)和abundance-based报道估计量的物种丰富度(ACE) (34]。这些报道估计确定的数量可能phylotypes环境中与观察到的数字样本。相应的覆盖率(生物多样性报道)C确定以下方程:,在那里phylotypes序列的数量和吗分析了克隆的总数(35,36]。此外,统计分析包括主成分分析来确定古细菌多样性与环境因素之间的相关性包括温度和溶解元素浓度。典型相关分析也执行确定古细菌群体和温度之间的相关性或溶解元素浓度,通过使用软件XLSTAT (Addinsoft,纽约,纽约)。
2.5。加入核苷酸序列号码
代表核苷酸序列的phylotypes可用DDBJ / EMBL的基因库数据库下加入数字AB753272-AB753298和AB755799-AB755806。
3所示。结果与讨论
3.1。水化学
四个池塘Kirishima地热地区选择基于温度的差异和总溶解元素浓度如下:(1)池塘:93°C和1679毫克L−1(2)池塘b: 66°C和2248毫克L−1(3)Pond-C: 88°C和198毫克L−1和(4)Pond-D: 67°C和340毫克L−1。采样地点和这些池塘的特点如表所示1。池塘的pH值的范围是2.0 - -2.6。在池塘显示更高的总溶解元素浓度,铁的浓度和比例,年代,尤其高于其他池塘。没有显著差异的浓度镁、硅、钙、磷、钠、钾、和之间的池塘。
3.2。16 s rRNA基因克隆库
16 s rRNA基因克隆库成功构建使用环境从四个浑水提取的dna样本。共有432个克隆的热点16 s rRNA基因进行了分析。期间一个空想的序列检测分析和并没有用于进一步的研究。序列相似度值的基础上,共有431个克隆(Pond-C池塘:106,池塘b: 112: 109年,和Pond-D: 104克隆)分为26 phylotypes,包括25 crenarchaeal phylotypes和一个euryarchaeal(表2)。同源覆盖率值是0.88或以上所有池塘表明大约90%的16 s rRNA基因克隆这些池塘可以被认为是在这项研究中(表3)。
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| 多样性指数得分是Shannon-Weaver指数衡量(Shannon),辛普森的互惠指数(辛普森),丰富(丰富),均匀度(甚至),报道估计和,相应的报道。埃尔。浓缩的。表明总溶解元素浓度。 |
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guanine-plus-cytosine (G + C)含量的16 s rRNA基因序列检测到26 phylotypes在这个研究范围从56.6%到69.0%,整体平均水平%。根据木村et al .,古生菌的生长温度与G + C含量有关,而phylotypes包含这么多G + C被分组为hyperthermophilic和中度嗜热古菌(37]。因此,所有phylotypes在这项研究中发现可能与中度嗜热hyperthermophilic古生菌。
3.3。古细菌社区的池塘
16 s rRNA基因序列相似性的基础上,106年克隆来自池塘显示更高的温度和总溶解元素浓度由五phylotypes Crenarchaeota(表2)。这个池塘的5%和7%序列具有高度相似的养殖鱼类Thermoproteales(> 98.0%)的订单,Caldivirga maquilingensis和Vulcanisaeta distributa,分别。两个物种的类型菌株hyperthermophilic古生菌最优增长超过85°C,他们最初隔绝酸性菲律宾和日本的温泉,分别为(38,39]。另一方面,其他89%的池塘克隆与任何养殖物种并没有显示出显著的相似之处。几乎所有的克隆的分配作为phylotype ST8A1-12 Sulfolobales隶属于订单。这个phylotype显示95 - 96%序列相似性与出版环境克隆,NAKO74-07和HS3wa_52发现Nakabusa温泉,日本(加入DNA数据库。AB366602) [37)和大同火山温泉、台湾(加入DNA数据库。FJ797311)。Shannon-Weaver所代表的多样性指数和辛普森指数倒数的池塘是四个池塘(表中最低的3)。
3.4。古细菌社区池塘b
相比之下的池塘,phylotypes最多的是在池塘b发现描述为更低的温度和更高的总溶解元素浓度,结果,多样性指数和均匀度值在这个池塘是最高的在四个池塘(表3)。共有112个克隆包括14 phylotypes被分为以下六组:订单Sulfolobales Acidilobales Thermoproteales,三个未耕作的crenarchaeal组(表2,图2)。克隆总数的21%是密切相关的五个养殖鱼类(> 98.0%):硫化叶菌solfataricus(40),Metallosphaera sedula(41),Acidianus brierleyi(42),Caldisphaera lagunensis(43),而Caldivirga maquilingensis(38]。美国solfataricus,毫克ydF4y2Ba。sedula,和一个。brierleyi是兼性chemolithoautotrophic需氧菌和需要单质硫或sulfidic矿石。这些物种及其近亲属已经从酸性硫质喷气孔分离领域在世界各地(44]。C。lagunensis和C。maquilingensis异养厌氧生物。他们的生长刺激或受到硫的存在作为电子受体。
另一方面,总共九phylotypes分享79%的池塘b克隆与任何养殖物种显示没有明显的相似之处。将近一半的这些无教养的克隆被分配phylotype ST2A1-5。这phylotype最主要在池塘b(35%),过去的遥远不仅从任何养殖鱼类,还从任何出版环境克隆。这部小说phylotype属于集群Sulfolobales的顺序(图2)。这个集群还存在另一个池塘b phylotype ST2A1-32,显示,98% 16 s rRNA基因序列相似性与出版环境克隆LH2wa_90发现从台湾温泉(Acc DNA数据库。不。FJ797343)。
春天的phylotype ST2A1-8属于无教养的thermoacidic克隆组(UTSCG) [16在池塘b)是次要的主要共享池塘b克隆总数的18%。有趣的是,phylotypes类似于Pond-C ST2A1-8也经常发现Pond-D,表明这种crenarchaeal物种生存相对广泛的温度和溶解在酸性元素成分温泉。可能有不利因素在池塘UTSCG的存在。的phylotypes ST2A1-2集群和ST2A1-15放在妹妹的UTSCG发表克隆检测从黄石国家公园(Acc DNA数据库。不。DQ834245)。在这项研究中我们称之为集群UTSCG II。
的phylotype ST2A1-25第三主要在池塘b,放入热水crenarchaeotic组二世的妹妹集群(HWCG II) (15,45,46)与phylotype ST2A1-52和出版环境克隆SK859发现从酸性温泉在黄石国家公园(Acc DNA数据库。不。DQ834111)。在这项研究中我们称之为集群作为HWCG VI。的phylotype ST2A1-25 Pond-C还占主导地位。
3.5。古细菌社区Pond-C
其他高温池塘,Pond-C,显示较低价值的物种丰富度一样的池塘(表3)。一百零九克隆被分为六个phylotypes如下:Thermocladium modestius订单的Thermoproteales 4无教养的crenarchaeal phylotypes和无教养的euryarchaeal phylotypes。的模式菌株T。modestius最初从硫气分离Noji-onsen泥浆,日本,和是一个厌氧异养生物最优增长约75°C, pH值4.0 [47]。
上一节中提到的,无教养的phylotypes ST2A1-8 UTSCG和ST2A1-25 HWCG VI在这个池塘的克隆库构建主导样品。这两个phylotypes共享Pond-C克隆总数的81%。三个phylotypes分享56%的Pond-C克隆是隶属于未受教育的春天thermoacidic克隆集团(UTSCG) [16]。
3.6。古细菌社区Pond-D
一百零四年克隆来自Pond-D显示较低的温度和总溶解元素浓度由九phylotypes。多样性指数在Pond-D低于池塘b,但高于在池塘和Pond-C(表的值3)。phylotype共享有关克隆总数的20%Caldisphaera天龙星座的16 s rRNA基因的序列相似性为95%。这个物种是chemoorganotrophic厌氧菌分离酸性温泉在黄石国家公园(48]。
与任何其他phylotypes显示没有明显的相似的物种。最常见phylotype ST2A1-8附属UTSCG和共享克隆总数的50%在这个池塘。与古细菌社区其他三个池塘、二级主导无教养的phylotype (ST16A1-50)隶属于Euryarchaeota和显示,99% 16 s rRNA基因的序列相似性与温泉克隆kmc048发现在俄罗斯堪察加半岛温泉(Acc DNA数据库。不。HM150106)。这种phylotype共享克隆总数的16%在这个池塘。
一起的phylotype ST15A1-26 st15a2 - 137和ST15A1-32 Pond-D刚刚发现,并被放入HWCG二世的妹妹集群。我们称这些集群HWCG V和HWCG七世,分别在这项研究中。
3.7。古细菌多样性和群落结构与不同温度和总溶解元素浓度
多样性时相比在池塘与不同温度(温度约90°C,池塘+ Pond-C和Temp.约。70°C,池塘b + Pond-D)所代表的Shannon-Weaver辛普森指数和的倒数指数较低温度池塘显示更高的多样性(表3)。另一方面,当在池塘中比较不同的总溶解元素浓度,多样性指数较高的总溶解元素浓度池塘(El。浓缩的。L > 1600毫克−1池塘+池塘b),高于Pond-C + Pond-D (El。浓缩的。L < 350毫克−1)。因此,古细菌多样性特征是在池塘里最高的是更低的温度和更高的总溶解元素浓度(池塘b)。相比之下,较高的温度和较低的总溶解的组合元素浓度(池塘)在这项研究引起最低的多样性。
当关注物种组成和分布,他们不同在池塘与不同温度和总溶解元素浓度。如表所示2,phylotypes隶属于订单Sulfolobales只检测到池塘显示更高的总溶解元素浓度(池塘+池塘b)。订单的成员Sulfolobales通常描述为兼性或专chemolithoautotrophic年代0的代谢;一些成员氧化亚铁和sulfidic矿石,生产可溶性金属硫酸盐(44]。因此,Sulfolobales的存在意义在这些池塘包括更高的总溶解元素浓度,特别是硫,正如我们期望检测微生物新陈代谢依靠硫作为电子供体。同样有趣的是,订单中的物种组成Sulfolobales池塘和池塘b之间明显不同。我们发现序列Sulfolobales密切相关的物种相似(98.9%)在池塘b (66°C),但大多数克隆检测从池塘(93°C)是隶属于Sulfolobales落后,形成phylotype ST8A1-12。此外,该属的成员Caldisphaera订单的Acidilobales经常被发现从较低温度池塘(池塘b + Pond-D)但没有检测到温度较高的池塘(池塘+ Pond-C)。这可能是由于生长温度极限的属的成员Caldisphaera,这是85°C (56]。
3.8。地球化学和古细菌多样性或组的相关性
创建一个矩阵根据皮尔逊相关系数(r)从Shannon-Weaver指数计算、温度和溶解在这四个池塘(表元素浓度4)。几个溶解元素浓度在统计学上彼此相关,但古细菌多样性没有任何溶解元素浓度与温度和(显著性水平,)。总溶解元素浓度有密切关系,P, (值< 0.05)和适度与菲()。艾尔和年代适度彼此相关。主成分分析表明,轴F1和F2占81.3%的网站之间的差异;年代,和Si的贡献同样PC1,而古细菌多样性指数导致PC2(图3)。的池塘,池塘b总溶解元素浓度较高,和变化的池塘,池塘b似乎解释了最好的年代和PC1,而变化与温度较高的池塘被PC2最好的解释。
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| 值的不同于0与显著性水平α= 0.10。多样性指数显示彼此非常相似的相关性和环境变量:只有Shannon-Weaver指数显示了古细菌克隆库。香农,Temp.和El。浓缩的。表明Shannon-Weaver指数、温度和总溶解元素浓度,分别。 |
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(一)
(b)
典型相关分析表明,一些热点团体强烈与特定的环境因素,如Sulfolobales Al和无教养的Euryarchaeota Na和K,而UTSCG组与Al(负相关)(图4)。订单Sulfolobales也适度与S ()。此外,订单Acidilobales UTSCG, HWCG组中度负相关与温度,年代,分别和Mg。迄今为止,该元素要求古生菌进行了某些养殖物种和人们知之甚少的无教养的古生菌。然而,未受教育的热点团体之间的相关性,本研究中所示的溶解元素浓度可以提供更多的洞察特定元素如何影响社区未受教育的热点。
4所示。结论
在这项研究中,我们调查了古细菌群落结构的四个不同酸性硫气Kirishima温泉,日本。物种组成和生物多样性明显不同的池塘中显示不同的温度和溶解元素浓度。尽管其他环境因素也可能在古细菌群落结构的影响,本研究将有助于了解酸性硫气的古生态温泉。
利益冲突
本文的作者没有直接金融与商业身份在此提到可能会导致利益冲突。
确认
作者感谢Fuchinoue先生和和田支持实地采样。他们也感谢田口博士和教授角的有价值的建议来改善。
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