分子氮循环古生菌的检测工具

文摘

古生菌普遍存在在极端和温带环境和培养代表覆盖广泛的代谢能力,使之为潜在的生态系统的生物地球化学的主要角色。检测、鉴定和量化的热点功能的混合社区需要Archaea-specific引物或探针对应代谢基因。5双简并引物设计针对热点基因编码的氮循环关键酶:亚硝酸盐还原酶NirA NirB,一氧化二氮还原酶(NosZ)、固氮酶还原酶(NifH)和硝酸还原酶纳帕/娜戈。敏感性对他们的热点目标基因、系统发育特异性和基因特异性在硅片和体外评价。由于他们的中度敏感性/覆盖,小说nirB有针对性的引物只适用于纯文化研究。的nirA有针对性的引物显示足够的灵敏度和系统发育特异性,但基因特异性差。设计的引物扩增的热点nosZ表现良好在所有3标准;他们歧视细菌同源染色体似乎削弱了古生菌强烈时由细菌数量在混合社区。这部小说nifH目标基因引物显示高灵敏度和特异性,但未能歧视细菌同源染色体。尽管限制,4新引物对的合适的工具在几个分子方法应用于古生态学。

1。介绍

古生菌已发现在几乎所有类型的极端和温和的环境。他们玩多个生态角色,殖民某些新兴的栖息地(1,2)与动物为伍,如珊瑚(3,4),海绵(5,6],白蚁[7),或反刍动物,形成的一部分microbe-microbe共生,(8- - - - - -10开车,许多在生物地球化学过程C, N, S, Fe周期。除了相对研究隔离extremophilic或产甲烷古菌,未受教育的代表已发现16 s rRNA基因或代谢基因分类主人硫酸盐还原的公会,diazotrophs,氨氧化剂,或产甲烷菌。尽管他们普遍发生,仅仅把nonmethanogenic古生菌一直孤立从温和的栖息地11- - - - - -13]。尽管这种隔离是不可或缺的,深入了解古生态生理学,他们一直顽固的种植的努力,所以我们目前生态研究嗜中温古生菌很大程度上取决于cultivation-independent方法。分子工具检测、量化、多样性分析和测量微生物基因表达的公会是稀疏的,然而,当涉及到古公会成员。本研究地址这样的分子工具的必要性,引物的设计和评估报告/调查针对热点5 N周期的公会的成员。

N生物地球化学循环过程已知的由古生菌在极端或中度栖息地包括催化氨氧化、异化的硝酸盐还原成亚硝酸盐和亚硝酸盐的铵,脱氮,N₂固定和硝酸盐同化14- - - - - -18]。概述的过程被认为是在这篇文章中,他们的关键酶,并给出相应的代谢基因表1。

的主要氧化途径N周期中,硝化作用,包括两步氧化铵与O₂亚硝酸盐和硝酸盐。病原的第一步是由氨单氧酶(Amo),各种中的一种关键酶β- - -γ变形菌门(19,20.]以及4培养成员的Thaumarchaeota [11,13]和高温Crenarchaeota [21,22]。此外,该编码标志基因amoA从古浓缩文化和众多的海洋,陆地和淡水、改造的系统。全面审查的热点氨氧化剂最近发表(23]。引物扩增的热点amoA基因(表1)已经成功应用在过去的数年。Thaumarchaeal基因组在策划KEGG和RefSeq数据库(24,25)包括nirA,nirD,检测技术基因,编码氨化和反硝化亚硝酸盐还原酶。有趣的可能性的还原N代谢广泛古门强烈激励的设计引物和探针,目标具体热点硝酸盐和亚硝酸盐还原酶的基因。

减少硝酸盐亚硝酸盐,在N周期的初始步骤的还原途径,被异化的硝酸盐还原酶介导。膜结合,周质硝酸盐还原酶(Nar和小睡,resp)发生在各种各样的异养细菌和古菌(14,16,26,27]。硝酸的相对贡献的热点活动总体减少自然生态系统尚未量化。适合标记基因的扩增引物组娜戈和纳帕从古硝酸异径接头似乎失踪。

进一步降低亚硝酸盐的发生通过异化的硝酸盐和亚硝酸盐还原铵(DNRA)或通过脱氮气体N化合物。途径占主导地位可能依赖于生态系统考虑,可用电子给体和受体的比例28]。DNRA-mediating生物体的各种协会由大量的细菌和真菌以及一些嗜热、嗜盐古生菌。DNRA氨化亚硝酸盐还原酶催化的联盟,不知道古细菌同源染色体,和NirA NirB(表1)。尽管少量的热点nirA和nirB存在于核苷酸序列数据库,没有发表底漆集这些标记基因的检测。

脱氮,一种强烈的学习过程由于其相关性在农业、污水处理、和温室气体,由3步骤(亚硝酸盐→→N₂O→N₂),根据相应的代谢基因的存在和表现的催化生物。公会的脱氮剂包括60岁以上成员细菌和古细菌属(29日]。这个过程的关键酶的亚硝酸盐还原酶NirK NirS,一氧化氮还原酶(NorB),和一氧化二氮还原酶(Nos),所有这些都在细菌和古细菌脱氮剂(14,16,30.,31日]。几个引物对目标细菌nirK,检测技术,norB和nosZ基因已经被设计和应用32,33),而在他们的古细菌同源染色体nirK解决了引物(31日]。只有26个热点具有标记基因的脱氮(25]。检测方法是目前有限的反硝化的观察活动在纯文化和测序基因组的注释。合适的引物和探针的可用性可以大大促进我们的研究多样性、丰度和反硝化古生菌的活性。

N的过程₂固定(表1),它强烈提高N生物利用度,在N-limited自然或农业系统尤为重要。它由厌氧催化酶固氮酶,发现普遍的细菌和产甲烷古菌(34]。的nifH基因,编码的固氮酶还原酶亚基酶,是最diazotrophs[标记基因测序35]。与古细菌同源染色体的序列形成4大集群,代表3人,和许多物种拥有2个或更多nifH属于不同簇的同系物(34]。多达42普遍和19类属特异性的引物对用于目标细菌和古细菌nifH(35]。四个显示系统覆盖率硅片高、特异性好目标基因的体外(35),但没有一个是archaea-specific。

在目前的研究中,引物对的敏感和具体检测的热点nirA,nirB,nosZ,nifH,纳帕/娜戈基因。这些小说引物被评估在硅片和体外性能方面(1)敏感性对热点目标,(2)歧视细菌同源染色体(系统发育特异性),和(3)特异性的靶基因。

2。材料和方法

2.1。简并引物设计

为每个目标基因、功能直接同源从策划KEGG数据库被确定(24),和所有可用的热点核苷酸序列被下载。这些都是37nirA3nirB,8nosZ,75年nifH,18纳帕/娜戈序列(在http://dx.doi.org/10.1155/2013/676450网上沉积insupplementary文件)。同源古细菌序列的比对发现没有足够的长度守恒的地区(nt)年龄在18岁至25岁之间的设计没有简并引物对。

软件工具HYDEN [36)是应用于设计gene-specific和archaea-specific底漆集,允许128年最大的简并度敏感性和特异性之间的权衡。每个引物长度设置为20元,2不匹配两个引物结合(3)与目标序列。古细菌基因序列被筛查结合位点小说的简并引物对,用浮雕的Primersearch项目(37),为了确定预期的PCR产物的长度。Amplificate长度必须符合的范围300 - 1000元,这被认为是最适合许多例程的应用程序。引物设计是由希格斯咨询有限责任公司(盖瑟斯堡,医学博士,美国)。

2.2。底漆评价在计算机

小说引物对针对古细菌代谢基因评估敏感性对热点目标序列和歧视细菌同源染色体。对于每一个基因,所有已知的或验证古细菌和细菌从策划RefSeq获得参考序列核苷酸数据库(25]。应用Geneious Pro软件(Biomatters有限公司),这些参考序列筛选引物结合位点,允许1不匹配。古细菌的比例可以绑定两个引物的序列正确方向被用作测量灵敏度,而细菌绑定两个引物序列的数量表示他们的系统发育特异性。

2.3。引物在体外评价

2.3.1。实时PCR与纯文化模板

小说的适用性放大他们的热点目标基因的引物对是评估实时PCR。从古细菌基因组DNA纯文化,作为模板DNA,是获得DSMZ(德国布伦瑞克)。引物被集成的DNA合成技术(美国IA珊瑚镇)。放大反应20μL体积被Sso7d-fusion聚合酶催化EvaGreen supermix (Bio-Rad实验室),0.5μ米的正向和反向引物和鹿ng模板DNA。对于每个热点模板,一系列的DNA浓度和在优化PCR引物退火温度测试协议。反应没有模板运行作为消极的控制。所有进行放大和MiniOpticon实时监控thermocycler (Bio-Rad实验室)。thermocycler协议由一种酶的激活步骤3分钟在95°C,紧随其后的是35周期模板变性(10 s在98°C),引物退火(15秒,范围的温度)和扩展(表中指定的时间260 - 64°C),然后在62°C 7分钟。随后的熔化曲线分析以及阈值周期和产品浓度被用作成功放大的第一指标。

长度和PCR产品的纯度测定凝胶电泳,用琼脂糖凝胶(1.5%)在TAE运行缓冲暴露在80 V (< 60 mA) 75 - 90分钟。凝胶是沾染了南希- 520 (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)1 h和观察下透照蓝光。绿色荧光的DNA比较分子量标记(费舍尔exACTGene 100 bp DNA梯)。

2.3.2。实时PCR与环境DNA

3底漆集(目标的性能nirA,nosZ和nifH关于敏感性和特异性检测当应用于环境样品的DNA。2011年7月和8月,缺氧水样收集中央盆地24米深度的伊利湖,失去了湖,从6米深度在金字塔露天矿湖国家公园,IL。这些样本含有3.2 - -4.4μ-0.23米和0.09铵μ3.4 M亚硝酸盐,而μM硝酸盐测定在伊利湖,没有检测到硝酸在露天矿湖(Rusch &重打,女士在准备)。多达4%的DNA在伊利湖已被确认为热点38,39湖,古细菌细胞丰度损失介于4%和7%之间(Rusch &重打,女士在准备)。颗粒材料> 0.2μ包含在100毫升水过滤到湖聚碳酸酯膜过滤器(微孔);DNA使用电力水提取DNA隔离设备(该款实验室)和存储在−20°C到分析。

所有22个DNA提取测试一式三份的存在nirA,nosZ,和nifH。实时PCR如上所述进行了小说与相应的引物对,应用优化条件中指定的表2。融化曲线分析、阈值周期和琼脂糖凝胶电泳如上所述被用来评价PCR产品。

2.3.3。目标基因的扩增、克隆和测序DNA从环境

一个DNA提取部分含氧底水的伊利湖(nosZ2只)和缺氧的水域的DNA提取露天矿湖被选为小克隆库的建设从环境样品为了获得目标序列。放大反应的50μL体积被OneTaq催化HotStart聚合酶在标准缓冲(新英格兰生物学实验室),0.5μ米的正向和反向引物和30 ng模板DNA,在ABI Veriti thermocycler(应用生物系统公司)。thermocycler协议由1分钟在95°C,紧随其后的是40周期模板变性(20年代在95°C),引物退火温度(20多岁,如表2(45)和扩展nifH,90年代,68°C),然后15分钟在68°C。PCR产品纯化该款超净GelSpin工具包)之前验证长度通过琼脂糖凝胶电泳和纯度。

威尼斯平底渔船TA克隆工具申请测序(表达载体),纯化PCR克隆到威尼斯平底渔船TA克隆载体,产品和化学主管一次使用的十大细胞转化的向量,遵循制造商的方向。转化株文化被镀在LB-Miller琼脂含有50毫克L⁻¹氨苄青霉素和孵化37°C过夜。从每个库,15 - 130转化株殖民地都转移到50μL PBS缓冲和发送到GLP-compliant服务实验室(美国ACGT Inc .,旋转,IL)直接测序。

DNA序列,通过下面的段落中描述的筛分过程沉积在基因库JX626144-JX626236加入数字。

2.3.4。处理和评价克隆序列

测序读是检查视觉清晰;嘈杂的或虚假的读取被丢弃。剩下的序列被爆炸(基因库数据库相比40];这些高相似度向量序列的丢弃。采用Geneious Pro软件(Biomatters有限公司),序列寻找正向和反向引物的位置,反向补充必要的地方,和结束在这些短序列引物被修剪掉。然后在网上翻译,尝试所有可能6阅读框架。翻译含有阻止被丢弃,其余的产品推导出肽序列,重复被移除。独特的蛋白质肽序列被关注家庭成员相比保守域的带注释的蛋白质序列数据库(41]。不属预定目标的蛋白质的家庭成员被丢弃。所有余下的肽序列相比,蛋白质序列在策划RefSeq数据库(25),应用DELTA-BLAST工具(42]BLOSUM62评分矩阵。对齐的分数被用来确定最近的热点和最接近的细菌相对。

3所示。结果与讨论

3.1。引物设计

扩增的引物对设计5个热点目标基因,基于所有可用的参考序列从嗜热、嗜盐的,产甲烷古菌拥有这些基因。对齐的同源序列没有透露任何足够长度守恒的地区(nt)年龄在18岁至25岁之间的引物没有退化的目标位置。简并引物的设计,从而实现最大的简并度128年,目的是为一个最优的权衡目标基因检测的敏感性和特异性。的名字和序列的引物对表进行了总结1。一个对齐的热点nosZ参考序列和相应的一对引物如图1。

3.2。在硅片底漆评估

硅新设计的引物进行评估的有效性在绑定到热点参考序列和系统发育特异性的结合位点的缺失在细菌参考序列。结果见图2。引物组arc-NirA显示高亲和力热点nirA序列,但是小细菌的互补性。同样,底漆对arc-Nos变成了最敏感的热点nosZ序列和主要细菌同源染色体(图的无知2)。这两个引物集同时满足灵敏度和系统发育特异性的设计目标。

引物对arc-Nif发现结合位点在大多数热点和许多细菌nifH参考序列(图2),表明高灵敏度对目标基因,但如果古细菌和细菌同源染色体之间的任何歧视。根据具体应用,细菌的codetectionnifH序列可以接受甚至是可取的。例如,研究解决整个公会的N₂修复生物体可以方便地应用一个引物对,提供大范围的域。

引物对arc-NirB和arc-Nred显示差检测的热点参考序列各自的靶基因(图2)。在细菌筛查结合位点nirB,纳帕,娜戈序列被认为过时了。令人惊讶的低亲和力热点目标序列可以归因于不同的设置应用在引物的设计和评价集。越小,可能更严格的策划,KEGG数据库(24)是用于引物设计,精度是最重要的。底漆评价,关注灵敏度和系统发育特异性,需要一个更具包容性的方法,因此,基于更大的和不同的策划RefSeq数据库(25]。此外,每一对3不匹配被允许在引物设计时,记住增强敏感性,而只有1不匹配/底漆被允许在评估期间,场景下的相对严格的PCR条件。arc-NirB和arc-Nred可能被低估的价值的措施,而这些与low-stringency PCR引物对执行效果可能更好从自然而不是RefSeq协议和目标环境。

3.3。体外实时PCR引物的评估

所有新设计的引物对测试他们的能力放大目标基因在实际PCR反应。使用模板DNA积极控制生物体,退火温度和延长时间为每个引物组优化。结果总结在表2。在优化条件下,所有底漆集放大DNA片段的长度。与Halogeometricum borinquense积极的控制,使用底漆对arc-NirA和arc-Nred导致额外的产品(表的形成2),可能由于额外archaeon基因引物结合位点。

当22 DNA从水中提取样品,而不是纯粹的文化被用作PCR模板,产品获得arc-Nif一对引物之间形成一个乐队在琼脂糖凝胶400个基点和450个基点。放大产品获得arc-NirA arc-Nos引物在规模和数量不同。当产品从几个样本低于凝胶检测(但实时thermocycler可见),其他1带形成预期的大小范围内,而且2,很少3乐队被观察到。这些意想不到的产品可能会造成额外的引物结合位点在相同的基因组,但也反映出每个目标的自然多样性基因存在于不同长度的基因拥有者在自然栖息地。

3.4。引物特异性评价在环境样品

3引物组出现最有前途的从网上评价与模板DNA进行pcr湖水样本。后续产生的克隆和测序产品33 - 80核苷酸序列(图每一对引物3,第一组列)。这些序列是进一步完善和评估关于目标基因的特异性。图3说明了序列的损失在每个细化的步骤。只有很少的序列来自空向量;因此,结扎和转换过程没有担心的理由。

损失在DNA序列的在网上翻译成推导出肽(2 nd-to-3rd组列在图3)的发生是由于内部停止在所有可能的阅读框架。这样的序列代表amplificates非编码区域;他们的数量是微不足道的nifH有针对性的和可容忍的nosZ有针对性的放大,但达到的三分之一nirA有针对性的。因此,非编码DNA可能是一个重要的副产品与arc-NirA pcr引物。

推导出肽序列的冗余(3 rd-to-4th列在图3)通常可以源自自然低多样性有针对性的公会在示例或底漆的偏见减少检测的多样性。观察肽序列冗余小程度上只有在所有3个引物对测试。

在最后细化步骤中,肽序列测试假定的目标蛋白质家族成员。损失在这个步骤代表amplificates不属预定目标的基因。最初只有2 33 PCR产品获得arc-NirA引物被发现属于目标家庭(图3)。这一对引物可能会放大不属预定目标的基因除了非编码DNA区域。而在网上表现良好(图2(表)和古细菌纯文化2),底漆arc-NirA未能显示令人满意的目标基因特异性的存在许多竞争环境样品中dna。序列产生的pcr引物应用arc-Nos或arc-Nif,相比之下,很少下跌目标家庭以外(图3)。注意,固氮酶还原酶填充两个蛋白质家族:其中包括NifH只和其他包括NifH和几个NifH-like蛋白质,这是所有参与叶绿素或细菌叶绿素的合成。信仰与后者的家人并不一定意味着NifH身份,除非可以排除光养生物的存在。

为了验证的热点起源放大序列,对应的肽与蛋白质序列的RefSeq数据库(25]。最亲密的亲戚在古细菌和细菌蛋白质序列,序列和相应的身份进行了比较。结果明显不同与对齐算法的选择和得分矩阵和,因此,要谨慎对待。此外,数据库是强烈的由细菌序列;例如,已知序列中脱氮的关键酶(NirK, NirS、NorB NosZ),只有1%的热点[起源30.]。由于这种偏见,确定小说的最亲密的邻居序列不一定表明其正确的联系,特别是当对齐分数和序列的身份很低。

NirA序列的关系推导出从湖水克隆同源片段的热点和细菌参考序列如图4。小说似乎序列组与深分支代表细菌门Verrucomicrobia47%,显示身份和自己最亲近的亲戚。

15 NosZ序列被发现与他们最匹配不到35%相同的古细菌和细菌域,所以它决定他们之间的联系是不可能的。其余的43 NosZ序列,形成2集群,显示序列身份与NosZ约90%的细菌物种Accumulibacter phosphatis30%左右的身份相比,古细菌序列之间的最佳匹配。这些nosZ克隆是最有可能的细菌来源,尽管优秀的歧视的引物对arc-Nos细菌nosZ基因(图2)。细菌的形成副产品可以提升整体较低丰度的湖水古细菌细胞样品(4 - 7%,Rusch重打,女士做准备)。在稀缺的热点目标,即使是不好的细菌目标可能竞争成功的引物通过压倒性的丰度。在栖息地支持古生菌的丰度较高,arc-Nos引物组可能主要是探测热点目标,由于其出色的系统偏差(图2)。

NifH或NifH-like序列通常表现出序列在50%和90%之间的身份调整最好的古细菌和细菌NifH序列。克隆人的几个令人信服地接近他们的顶级细菌匹配,而其他人则显示几乎相等的距离古细菌和细菌顶级比赛。结论性的判断域联系是不可能的,考虑到数据库的偏见和上面讨论系统的不确定性。基于在网上评价(图2),arc-Nif引物没有将特定于域的。

4所示。结论

互补的文化和文化无关生态研究使我们最强的方法阐明微生物在生态系统功能的复杂网络。在勘探热点领域,然而,缺乏合适的分子工具可能会妨碍文化无关的调查。本研究需要解决这样的工具设计和评估的扩增引物对5 N古细菌代谢相关的基因在生物地球化学循环。敏感性对热点目标序列是必不可少的小说古生菌的检测与这些引物PCR扩增。除了检测、敏感gene-specific引物也是评估协会重要的多样性clone-based或直接测序调查。先进的应用包括目标的量化公会metagenome或metatranscriptome微生物群落。最后,成功的引物通常双探针在mRNA-targeted荧光原位杂交(FISH)基因表达定量和本地化。

这部小说引物对为放大设计的热点nirB和纳帕/娜戈他们的许多基因没有发现敏感目标序列(图2),因此不适合在环境研究中的应用。引物arc-NirB被成功应用在实时PCR模板DNA的积极控制生物体(表2);他们可能是有用的在纯培养实验中,测量基因表达等的地步化验。

在网上,底漆arc-NirA显示足够的灵敏度热点目标序列和可取的歧视细菌同源染色体(图2)。当评估体外DNA从古细菌纯培养,这些引物表现优异(表2的3种测试2)。他们预计在纯文化定性和定量实验证明有用。当湖水样本的DNA测试,然而,nirA针对引物产生大量扩增子的非编码DNA和不属预定目标的基因(图3)。他们不适合定量分析在环境样品,但是可以应用在定性的调查协会多样性与后续去除假阳性。

这部小说nosZ有针对性的一对引物表现出极大的敏感性和系统发育特异性(图2),进行可靠地实时PCR与所有纯文化测试(表32),生成的数字不属预定目标的扩增子从湖水DNA(图3)。这一对引物被认为是适合针对古细菌脱氮剂的各种应用程序。在环境中使用时的古细菌丰度很低,一些细菌的副产品是可能的。

引物arc-Nif展出优秀的敏感性对古细菌和细菌nifH序列(图2从纯培养),生成预期的产品DNA(表2),并从非编码DNA或不属预定目标的基因扩增子罕见(图3)。丢失的系统发育特异性,这一对引物适用于所有纯培养实验,但必须小心使用环境的应用程序。定性调查diazotroph多样性使用arc-Nif引物将返回序列两域,可以分开。这部小说是否nifH有针对性的引物对任何优于现有的(35)还有待观察。

利益冲突

作者宣称她拥有任何财务或个人利益在本文中引用的任何公司。

承认

收集和分析的湖水样本由教员种子从南伊利诺伊大学卡本代尔格兰特。

补充材料

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