晶体结构的PAV1 - 137:病毒PAV1感染的一种蛋白质海床abyssi

文摘

海床abyssi病毒1 (PAV1)是第一个病毒颗粒感染hyperthermophilic Euryarchaeota (海床abyssi应变GE23)被孤立和特征。是柠檬形状和装饰着短纤维的尾巴。PAV1形态类似于梭状回家族成员Fuselloviridae或属Salterprovirus。18 kb dsDNA PAV1包含25个预测基因的基因组,其中大部分是未知函数。这些蛋白质帮助分配函数,我们启动了结构性PAV1蛋白质组的研究。我们决定137年的蛋白质晶体结构的假定的残留物(pav1 - 137) 2.2的一项决议。蛋白质形成二聚体在溶液和水晶。的褶皱pav1 - 137是一个四α螺旋束类似于那些在某些真核粘附蛋白如粘着斑激酶,表明pav1 - 137是参与蛋白质-蛋白质之间的关系。

1。介绍

古菌域被组织成两个主要类群,Crenarchaeota和Euryarchaeota。第一个门包含主要是极高温Sulfolobales Desulfurococcales, Thermoproteales。绝大多数hyperthermophilic Crenarchaeota分离出的病毒感染尤其是属硫化叶菌,Thermoproteus,Acidianus、Pyrobaculum Stygiolobus,和Aeropyrum(1,2]。他们的形状有不同寻常的形态不同于bacterialviruses和真核病毒。基因组序列测定这些古细菌病毒和显示一个非常高的部分ORFan基因(3]。由于其特殊的形态和基因特性,他们被分配到8新型病毒的家庭(1]。

Euryarchaeota门包括极端嗜盐菌、产甲烷菌和hyperthermophilic还原剂硫(Thermococcales)。大部分的病毒感染这门从嗜中温分离主机和跟踪病毒,而多形性类型是相对罕见(4]。知识热点病毒仍然是非常有限的,这是更加深刻的病毒感染hyperthermophilic Euryarchaeota [5,6]。到目前为止,PAV1和TPV1 (Thermococcus prieurii病毒1)是唯一的病毒分离培养海洋hyperthermophilic euryarchaea。这些纺锤状病毒属的形态类似于halovirusesSalterprovirus(7,8极端嗜盐菌感染,crenarchaeal病毒分配给梭状回家庭Fuselloviridae(9),但他们不共享任何基因属性。PAV1,隔绝海床abyssi,是第一个病毒分离和描述Thermococcales(10]。PAV1病毒粒子显示lemon-shaped形态(长120 nm和80 nm宽)和一个短尾巴(15海里)终止的纤维。TPV1,最近一部小说梭状病毒分离和特征,hyperthermophilic euryarchaeal属Thermococcus(11]。

PAV1和TPV1被释放在主机的所有阶段增长不会引起宿主细胞溶解。一个简单的过程发现病毒在细胞草坪和直接观察其影响已经特别设计的。这允许宿主范围的确定和传染性的病毒分离厌氧超/嗜热生物sulfur-reducing微生物。我们使用这个方法来证明PAV1的传染性和确认TPV1的宿主范围,他们两人是属特定[12]。

PAV1的基因组是由双链环状DNA。结果表明:免费的病毒基因组作为multicopy质粒存在于宿主菌株,但没有集成前噬菌体可被检测到。的完整基因组PAV1包含18098个基点(13]。大量的25个orf(开放阅读框架)编码至少50个氨基酸被识别和几乎所有位于同一链。病毒的形状摄动在治疗与有机溶剂或清洁剂,这表明他们的信封包含脂质。这个观察是支持的事实PAV1基因组预测跨膜螺旋的一半。百分之六十五的预测蛋白质没有同系物在序列数据库中。函数只能含糊地提出了三种蛋白质。59个氨基酸蛋白质(PAV1-59)股票相似CopG转录监管机构。另外两个orf (PAV1 - 676和PAV1 - 678)之间唯一的开放共享的hyperthermophilic euryarchaeal病毒PAV1和TPV1包含一个或两个拷贝的层粘连蛋白G-like果冻卷折,可能因此参与粘附宿主。多顺反子mRNA分析表明,所有预测基因在六mRNA转录。

相比与其他lemon-shaped从咸水水域(分离的病毒Salterprovirus)或从极端地热陆地环境(Fuselloviridae),PAV1孤立的从一个远程深海热泉。的独特性PAV1基因组相比其他古细菌病毒可能是其进化历史的结果(14]。因为没有函数可能提出的预测子,我们着手分析PAV1基因组编码的蛋白质的结构。的分配函数古细菌蛋白质遭受基因数据的缺乏和序列类似物在定性良好生物15- - - - - -18]。3 d结构是守恒的比序列和可能揭示相似之处仍未被发现的序列分析(19]。因此,结构确定为研究蛋白质功能提供了一个有价值的选择。事实上,AvtR蛋白质的晶体结构测定从hyperthermophilic热点lipothrixvirusallowed我们建立这种蛋白质作用在病毒基因的转录调节20.]。我们想要的在细发现如果PAV1蛋白质结构与其他古细菌病毒的蛋白质。我们在座的x射线晶体结构假定ORFan蛋白质pav1 - 137,据我们所知的第一个euryarchaeal病毒蛋白。

2。结果与讨论

我们从基因构造纯化c端His-tagged蛋白14第一残留删除,因为序列分析预测非结构化构象的氨基端区域(21]。MALDI-TOF纯化重组蛋白的质谱分析表明,氨基蛋氨酸裂解生产中大肠杆菌。凝胶过滤分析表明,蛋白质在溶液中形成二聚体(没有显示)。得到了晶体在35% PEG400, 0.5 NH₄Cl,在pH值4,0.1柠檬酸钠浓度15毫克/毫升的蛋白质。数据收集和精致的细节中找到表1。所有残留的构造,除了亲和标签,电子密度是可见的。两份pav1 - 137存在的不对称单元和它们的结构几乎是一样的(均方根偏差= 0.5)。

pav1 - 137包含四个两性分子的螺旋,螺旋包被组织。三氨基端螺旋形成一个上下平行配置在c端螺旋短和包约45°角对螺旋1和3。三螺旋的核心是非常疏水支链脂肪族氨基酸为主。螺旋之间的连接1、2和3是短暂的。螺旋3和4之间的联系是一个再拉伸,导致包装不紧螺旋4相比其他螺旋。

不对称的A和B单体单元形成一个双重对称的二聚体和对称轴线垂直于长螺旋的方向(图1)。两个单体的螺旋副形成一个反平行的超螺旋包。二聚体界面包括螺旋1、2和4。每个亚基的可及表面被二聚体的形成是实质性的。单体的可访问的表面积是7300²。二聚埋葬1278²每个单体相应的溶剂可及表面面积的17%。赋予的多数单体之间的相互作用是螺旋4,谎言的四肢螺旋1和2。亲水界面比螺旋束的核心,由9个氢键,稳定主要是侧链和侧或主链原子之间。

直接同源pav1 - 137在基因组序列的新thermococcus最近报告了质粒(14]。基因编码的直接同源pav1 - 137是发现与一个直接同源基因pav1 - 375在三个质粒。令人惊讶的是,它还形成three-gene集群,这是守恒的前病毒A3车牌区域内的euryarchaeal产甲烷菌产甲烷球菌属voltaeA3 (22]。pav1 - 375可能编码一个P-loop atp酶,但其与pav1 - 137仍不清楚。pav1 - 137目前没有结构类似物蛋白质数据银行,可以帮助定义其功能。缺乏序列类似物的研究表明pav1 - 137可能会采用一种新的折叠。在蛋白质结构螺旋束极为常见。因此我们发现实质性的结构相似性与蛋白质共享螺旋束架构。这些蛋白质的功能检查清楚地表明,结构相似并不意味着功能的关系。例如,重大发现重叠pav1 - 137和片段的蛋白和粘着斑激酶,来自真核生物的起源(3.2分5和均方根差100对齐残留)[23,24]。螺旋1、2和3 pav1 - 137添加到螺旋2、3和4的真核螺旋包。没有等效第四螺旋存在于真核生物类似物中发现pav1 - 137。c端螺旋采用不同的取向和没有等价的蛋白或粘着斑激酶。

自pav1 - 137年似乎并没有携带任何活跃的网站,其生物学功能可能与蛋白质或protein-nucleic酸交互。螺旋束蛋白经常参与这种类型的交互,以蛋白。几乎没有知道PAV1的生命周期。它的基因组序列是一个更好的理解的第一步,这可能已经进化出这种新型的病毒从一个不同的移动遗传元素之间的重组事件存在hyperthermophilic和产甲烷euryarchaeota。我们报告在第一次调查的结果由这个病毒编码蛋白的结构和功能。

3所示。材料和方法

3.1。蛋白质生产和净化

PAV1 - 137 ORF缺乏的地区编码14 n端残留放大了PCR使用PAV1病毒的基因组DNA作为模板。介绍了额外的序列编码6-histidine标记的3′末端ORF在放大。PCR产品然后克隆到pET28向量。表达了在37°C使用大肠杆菌BL21(黄金)DE3应变。His-tagged蛋白质纯化的Ni-NTA列(试剂盒Inc .)其次是凝胶过滤使用缓冲区组成的20毫米Tris-HCl pH值7.5,200毫米氯化钠,b-mercaptoethanol 10毫米。Selenomethionine-substituted pav1 - 137生产和纯化天然蛋白。最高分数集中15毫克/毫升,用于结晶。

3.2。结晶和数据收集

使用笛卡尔结晶结晶进行了机器人在200×200μl坐滴(卷对蛋白质和液体的母亲)和手动复制1×1μ我滴。水晶是来自下面的结晶条件:35% PEG400, NH 0.5₄在pH值4 Cl, 0.1 M柠檬酸钠18°C。晶体被转移之前在母液中含有30%甘油flash在液态氮冷冻。SeMet取代蛋白质晶体的x射线衍射数据收集ID14-4 ESRF beamline和处理使用MOSFLM和SCALA [25]。水晶属于P6₁22日与两分子不对称单位空间群。细胞参数表和数据收集统计数据1。

3.3。结构方案和细化

2.2结构解决了一项决议的通过单一的反常衍射(SAD)使用收集的数据在硒峰值波长。凤凰计划的Hyss模块(26)是用来发现硒网站使用整个分辨率的范围。网站的细化与夏普(27),并与DM溶剂进行压扁。Arp /经[28)建立95%的可见的残留。该模型完全精炼和完成使用巴斯特从本地数据和图形项目(阿29日,30.]。进行了细化使用noncrystallographic对称性限制和一个tl组/链(统计如表所示1)程序克星。所有的残留物拉马钱德兰情节的有利区域。

同源性搜索,我们做了一个Psi-BLAST分析使用标准程序由美国国立卫生研究院blastserver (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.gate1.inist.fr/Blast.cgi)。

加入数量

结构因子振幅和精制的坐标pav1 - 137已经存入蛋白质数据银行条目4 hr1上。

确认

这项工作受到了国家的资助矫揉造作的(没有。anr -上海步浪- 0408 - 03)。作者感谢本杰明运货马车和娜塔莉Ulryck技术援助。

引用

1. d . Prangishvili和r·a·加勒特”的基因组异常不同形态类型和crenarchaeal hyperthermophilic病毒,”生化社会事务,32卷,不。2、204 - 208年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. t . Mochizuki y Sako, d . Prangishvili”前病毒诱导hyperthermophilic古生菌:表征Aeropyrum pernix纺锤状病毒1和Aeropyrum pernix卵形体病毒1”细菌学期刊,卷193,不。19日,5412 - 5419年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. d . Prangishvili r·a·加勒特和e . v . Koonin”进化基因组学的热点病毒:独特的病毒基因组在第三域的生活,”病毒的研究,卷117,不。1、52 - 67年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. f . Eiserling a普希金、m .辛辣的和g . Bertani”Bacteriophage-like粒子与基因转移相关代理的产甲烷球菌属voltae PS,”普通病毒学杂志,卷80,不。12日,第3308 - 3305页,1999年。视图:谷歌学术搜索
5. h·w·阿克曼和d . Prangishvili”,原核生物病毒电镜研究,“档案病毒学,卷157,不。10日,1843 - 1849年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. c . Geslin先生传奇小说作家,m .盖拉德g . Erauso和d . Prieur”观察病毒样颗粒的高温浓缩文化从深海热液喷口,”微生物学研究,卷154,不。4、303 - 307年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. c .浴t . Cukalac k .波特和m . l . Dyall-Smith His1 His2远亲,纺锤状haloviruses属于小说病毒群,Salterprovirus”,病毒学,卷350,不。1,第239 - 228页,2006。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. c .浴和m . l . Dyall-smith”His1,古细菌病毒Fuselloviridae家庭感染Haloarcula hispanica。”病毒学杂志,卷72,不。11日,第9395 - 9392页,1998年。视图:谷歌学术搜索
9. k . p .红x Peng brgger et al .,“四个新从极端孤立fuselloviruses地热环境揭示不同寻常的形态和可能interviral重组机制,“环境微生物学,11卷,不。11日,第2862 - 2849页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. c . Geslin先生传奇小说作家,g . Erauso m .盖拉德g . Perrot和d . Prieur PAV1,第一个病毒样颗粒分离从hyperthermophilic euryarchaeote,”海床abyssi’。”细菌学期刊,卷185,不。13日,3888 - 3894年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. a . Gorlas大肠诉Koonin:卞福汝,d . Prieur和c . Geslin”TPV1,第一个病毒分离hyperthermophilic属Thermococcus,”环境微生物学,14卷,不。2、503 - 516年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. A . Gorlas和c . Geslin”一个简单的程序来确定病毒感染的传染性和宿主范围厌氧和hyperthermophilic微生物,”极端微生物,2013年。视图:谷歌学术搜索
13. c . Geslin m .盖拉德d Flament et al .,”分析的第一个基因组hyperthermophilic海洋病毒样颗粒,PAV1,隔绝海床abyssi”,细菌学期刊,卷189,不。12日,第4519 - 4510页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. m . Krupovic m . Gonnet w·本·哈尼亚r . Forterre和g . Erauso”见解hyperthermophilic环境中动态移动的遗传元素从五个新的thermococcus质粒,”《公共科学图书馆•综合》,8卷,不。1,p . e49044 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. r·卡亚特l .唐·e·t·拉尔森,c·m·劳伦斯,m .年轻和j·e·约翰逊,“古细菌病毒衣壳蛋白的结构揭示了真核生物和细菌病毒的共同祖先,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷102,不。52岁,18944 - 18949年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. e·t·拉尔森,d . Reiter m .年轻,和c . m .劳伦斯,“从硫化叶菌的二十面体病毒A197结构:crenarchaeal病毒糖基转移酶表现出GT-A褶皱,“病毒学杂志,卷80,不。15日,第7644 - 7636页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. j·凯勒,n . Leulliot b Collinet et al .,“afv1 - 102的晶体结构,蛋白质从acidianus丝状病毒1”蛋白质科学,18卷,不。4、845 - 849年,2009页。视图:谷歌学术搜索
18. a。古利特,m .冰镇,p .红et al .,“从古细菌病毒ORF157 Acidianus丝状病毒核酸酶1定义了一个新类,“病毒学杂志,卷84,不。10日,5025 - 5031年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. j . c . Whisstock和a . m . Lesk”从蛋白质序列预测蛋白质功能和结构,”生物物理学的季度评估,36卷,不。3、307 - 340年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. n . Peixeiro j·凯勒,b . Collinet et al .,“AvtR的结构和功能,一个新的转录监管机构从hyperthermophilic热点lipothrixvirus,”病毒学杂志,卷87,不。1,第136 - 124页,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. s Hirose k .清水s Kanai y黑田,和t .野口勇,“POODLE-L:两级SVM预测系统可靠地预测长期无序区域,”生物信息学,23卷,不。16,2046 - 2053年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. m . Krupovič和d·h·Bamford”古前病毒TKV4和MVV扩展门Euryarchaeota PRD1-adenovirus血统,”病毒学,卷375,不。1,第300 - 292页,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. s . t . Arold m . k . Hoellerer和m . e . m .高贵”的结构性基础定位和信号的粘着斑目标域,“结构,10卷,不。3、319 - 327年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. e . Papagrigoriou a . r . Gingras i l . Barsukov et al .,“激活蛋白棒vinculin-binding网站涉及到five-helix束重排,”EMBO杂志,23卷,不。15日,第2951 - 2942页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. a·莱斯利联合CCP4和EACMB通讯蛋白质晶体学:达斯伯里实验室,沃灵顿,英国,1992年。
26. p·d·亚当斯,k .·r·w·Grosse-Kunstleve et al .,“最近的事态发展在凤凰软件自动化的晶体结构测定,“杂志同步加速器辐射,11卷,不。1,53-55,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. c . Vonrhein e·布兰科、p . Roversi和g . Bricogne”与autoSHARP自动结构解决方案”,分子生物学方法卷,364年,第230 - 215页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. a . r . j . Morris Perrakis, v . s . Lamzin“ARP /扭曲和自动解释蛋白质的电子密度地图,”方法酶学卷,374年,第244 - 229页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. e·布兰科·Roversi c . Vonrhein c的情况一团糟,s m . Lea和g . Bricogne”严重不完整结构的细化BUSTER-TNT最大似然,“晶体学报:D卷,60卷,不。12日,第2221 - 2210页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. t·a·琼斯,“交互式电子密度图的解释:从国米到啊,”晶体学报:D卷,60卷,不。12日,第2125 - 2115页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2013 n . Leulliot et al。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。