PH1: Archaeovirus的Haloarcula hispanicaSH1和HHIV-2有关

文摘

Halovirus PH1感染Haloarcula hispanica并从澳大利亚盐湖是孤立的。单步增长条件下的释放量是50 - 100微升/细胞,但细胞密度才下降后上升(4 - hr p。),表明该病毒没有细胞溶菌作用可能退出。病毒粒子是圆的,51 nm直径,显示一个分层的衣壳结构,敏感,氯仿和盐浓度降低。基因组是线性dsDNA, 28064个基点,为337 bp终端重复和终端蛋白质,并可能使转染haloarchaeal五个不同属的物种。基因组预测49个orf,包括结构蛋白,其中一些被质谱分析鉴定。PH1的密切相似SH1(74%核苷酸身份)允许一个详细的描述和分析两个基因组(发散区域)之间的差异,包括检测repeat-mediated删除。SH1-like的关系和pleolipoviruses先前描述的病毒基因组位点和plasmid-related元素(ViPREs) haloarchaea揭示了一个广泛的水平已知haloviruses之间的重组。PH1属于相同的病毒群SH1 HHIV-2,我们提出这个名字halosphaerovirus以适应这些病毒。

1。介绍

病毒的古生菌(archaeoviruses [1])显示相当大的多样性,包括小说的形态类型细菌或真核生物。已经详细研究相对较少,部分原因是许多extremophilic的要求增长的需求古生菌(尤其是嗜热微生物),也因为遗传分析往往是技术难度相比,细菌等系统大肠杆菌。虽然病毒嗜热古生菌展示最具创新性的衣壳和复制策略(1),嗜盐的病毒古生菌(haloarchaea)越来越多的关注的新隔离发现意想不到的性质。许多最早的haloviruses报道,包括所有这些描述在1998年之前,bacteriophage-like (Caudovirales),典型的首尾相接衣壳和线性dsDNA基因组。这些包括组织相关的病毒,如ΦH-like属(ΦHΦCh1, BJ1) (2- - - - - -4)和未赋值的病毒群组成HF1和HF2 [5]。第一个纺锤状halovirus His1,据报道在1998年(6,7,第一轮病毒,SH1,描述了2003年8,9),和电子显微镜研究表明,这些在自然水域形态类型占主导地位10- - - - - -12]。在过去的五年里,已经有一个很棒的haloviruses描述增加的数量和类型,包括进一步的例子SH1-like病毒(例如,HHIV-2 [13])和一系列His2-related病毒现在分为pleolipoviruses(例如,HRPV-1和HHPV-1 [14,15])。生物新奇的一个例子显示这些archaeoviruses SH1衣壳的几何形状,它被发现之前从未描述的类型,右旋的(16]。

Halovirus His2有16 kb dsDNA基因组与终端通过编码蛋白质,可能复制protein-primed DNA聚合酶(7]。现在已知多形性病毒,有别于纺锤状His1 [17]。当第一次描述了基因组序列,它是显示出与一个神秘的质粒(pHK2)Haloferax lucentense(18,19和许多基因位点在不同haloarchaea找到。后来的描述haloviruses HRPV-1、HHPV-1和其他几个显示频谱相关的病毒有不同的基因组结构(循环ds -和ssDNA),长度,和复制策略14,15),但他们都共享一组类似的衣壳蛋白。衣壳的运动机制的基因病毒有不同的特征和模式之间的复制(蛋白质影射与滚圈)尚不清楚。一种可能性是,这样的模块化重组可以通过先前描述的病毒基因组位点和plasmid-related元素(ViPREs) [20.]。最初,这些似乎并没有简单的前病毒基因组在不同程度的衰减,但与基因组pleolipoviruses的描述远小于His2和不同的复制策略可以解释许多病毒要素。另一方面,这些基因位点已经扩展的长度随着越来越多的病毒和质粒序列可用时,和他们的基因同源染色体可以承认在侧翼序列。对于这些,我们保留ViPRE修饰语。从几十年的噬菌体的研究,能够很好的证明,相关重组噬菌体频繁(合法和非法的重组事件),引起马赛克基因组不同进化历史(21,22]。这个过程可以通过模块化的安排协助的基因(例如,衣壳的形成或复制)在许多常见病毒基因组(23]。haloviruses的出现一样,如大型复合事件明显的比较halovirus HF1和HF2基因组5]。更普遍的是,我们有充分的证据的广泛的重组研究的热点MCM解旋酶基因(通常与移动相关遗传元素)(24)和比较基因组学的热点caudoviruses [25]。

组轮haloviruses以SH1最近扩大HHIV-2的描述和SNJ1 [13,26]。SH1病毒组的成员是由他们的衣壳蛋白相关但不同基因组长度和复制策略。SH1和HHIV-2线性dsDNA基因组与终端蛋白质(~ 30.5 kb),指示性复制的蛋白质启动,尽管SNJ1圆形dsDNA基因组仅16.3 kb。这种多样性的基因组类型在相同的病毒群上述pleolipoviruses密切的相似之处。SH1最密集的研究,包括宿主范围、粒子稳定性、病毒粒子结构、基因组序列,转录映射,转染,建立基因操作的方法(8,13,16,27- - - - - -31日]。当前研究的目的是描述这组的新成员,PH1。基因组序列,其病毒学特征和主要的蛋白质,而其他成员SH1病毒组和基因组包含相关基因位点。为了方便起见,我们提供的组名halosphaerovirus包含SH1病毒集团目前由SH1, PH1 HHIV-2, SNJ1。

2。结果

2.1。病毒隔离和宿主范围

水样本粉红色的湖,湖咸水(32°00′年代和115°30′E)在澳大利亚西部,是直接镀在草坪haloviruses的筛查哈尔。hispanica使用覆盖板修改生长培养基(MGM)与12%或18% (w / v)盐。高滴定度相似的斑块形态学观察(1.2×10⁵空斑形成单位/毫升)板块为18% (w / v)盐。小说halovirus是从其中一个孤立斑块和指定PH1基于源湖(粉红色)和隔离主机(哈尔。hispanica)。

斑块是充分发展两天后在37°C使用覆盖板18% (w / v)米高梅,1 - 2毫米直径,清晰,边缘参差不齐。在30°C,斑花了三天的发展,而且,在25°C,斑块是朦胧的,七天开发(数据未显示)。

PH1的宿主范围是相同的SH1 [8];无法斑块在草坪的12种不同的六个不同属的物种Halobacteriaceae(Haloarcula,Halobacterium,Haloferax,Halorubrum,Haloterrigena,Natrialba),但可以斑块Halorubrum应变日间2.09.4(中描述8澳大利亚]),但一个个孤立(表1)。

2.2。病毒净化和粒子形态

稍微修改病毒纯化的方法前面描述halovirus SH1 ([8)和部分4)。PH1带状密度为1.29 g / mL中海梯度,最后给出具体的传染性~ 5×10¹¹空斑形成单位/_260年。Negative-stain电子显微镜显示球形粒子,平均直径~ 51纳米(图1)。两层显示的衣壳,紧凑的核心粒子直径~ 43海里。这种形态类似于halovirus SH1,密切相关的病毒(见下文),被隔离的同时PH1,但从邻近的盐湖8]。

2.3。单一和单步PH1的增长

大约30%的哈尔。hispanica细胞可以通过PH1感染,单一破裂实验(32]表示平均破裂规模87微升/细胞(数据未显示)。这个值是由单步增长曲线,使破裂50至100微升/单元的大小。传染病中心的数量通常在4 - 6小时皮增加。,but cell lysis did not appear to begin until well after this, usually between 14 and 24 hr p.i. A representative example of a single-step growth curve for PH1 is shown in Figure2,上升始于~ 6 hr皮。,visible cell lysis begins at ~14 hr p.i. This figure shows that a second round of growth occurs at around 18 hr p.i., reflecting the initial infection of only 30% of cells, and it is during this second round of virus release that the cell density decreases most rapidly, reaching a value of about 0.1 A_550年,这是接近初始细胞密度。在这个例子中,破裂的平均尺寸增长的第一步是95微升/细胞。

2.4。病毒的稳定性

PH1病毒的稳定性测试在一些条件下(数字3(一个)- - - - - -3 (d))。当存储在HVD 4°C时,PH1的传染性未加了几个月(数据未显示)。提出了一种热稳定性曲线在图3(一个)并表明PH1稳定56°C以上的迅速失去滴定度。降低盐粒子是敏感环境(图3 (b))和氯仿(图3 (d))。PH1最稳定的酸碱8和9之间(图3 (c))。一般来说,PH1的稳定性是SH1(与前面描述的相似8]。

2.5。PH1结构蛋白和蛋白质复合物

蛋白质纯化PH1病毒被SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离,与SH1病毒的蛋白质(图4)。发现了九PH1蛋白质乐队,分子量从7到185 kDa(图4(一)),这些都是指定前缀VP和数量对应的同源蛋白质SH1 [8,27)(见后)。这一术语描述的是一致的,最近HHIV-2病毒,同一病毒组的成员(13]。PH1的蛋白质的状况非常类似于SH1 [8)和具有类似蛋白质的相对质量。一个明显的区别是,PH1蛋白质VP9和VP10紧密(计算多工作站系统是16.5和16.7 kDa, resp)相比,他们SH1同系物(16.5和16.9 kDa,职责)。很可能,考虑到强烈的序列相似性SH1(见后),至少六个额外PH1结构蛋白无法使用我们的染色技术是可视化。病毒的潜在糖基化蛋白质被染色检查类似的蛋白质凝胶与periodate-acid-Schiff (PAS)染色(GelCode糖蛋白染色设备,皮尔斯生物技术、美国)或更敏感的荧光染色(Pro-Q翡翠488糖蛋白凝胶和污点染色装备,分子探针,美国)。未发现糖蛋白。

PH1的主要蛋白带(星号图4从凝胶)切除,用胰蛋白酶消化,MALDI-TOF MS和分析,总结了结果表2。从这些数据,结构蛋白副总裁1 - 4,7,9,10,12是指定子12日,24日,28日,21日,20日,27日,26日和19日(见后)。

2.6。PH1基因组的特征

核酸提取纯化PH1病毒制剂,对蛋白酶K和孵化与各种核酸酶来确定基因组的特点(表3)。PH1基因组是敏感dsDNA endo和核酸外切酶而不是ssDNA核酸酶(绿豆)或核糖核酸酶a。这表明,PH1染色体是线性dsDNA,免费(即。,而非共价闭合)目的地。限制性内切核酸酶消解时PH1染色体的长度约29 kb(数据未显示)。

终端绑定蛋白的存在是使用硅绑定化验检查33]。Nonproteinase K-treated PH1 DNA限制日月光半导体我和四个结果片段通过GF / C过滤器条件下蛋白质牢牢绑定到玻璃的地方。如图5,两个内部日月光半导体我碎片(2.3和7.6 kb)通过过滤器,但正确的终端片段(17.4 kb)是绑定的,表明它进行附加的蛋白质。左边终端片段太小(0.62 kb)、染色检测。进一步的证据被核酸酶保护试验获得,正如前面用于SH1 DNA (31日]。如表所示3核酸外切酶III(3′核酸外切酶)能够消化nonproteinase K-treated PH1染色体DNA,但T7核酸外切酶(5′核酸外切酶)和Bal31(5′和3′核酸外切酶)无法消化PH1染色体DNA,除非它先前接受蛋白酶k .这表明基因的5′末端蛋白。

2.7。PH1基因组序列

PH1全基因组序列的测定(入世KC252997)使用克隆片段的组合,PCR引物走在病毒DNA, 454全基因组测序(见部分4)。它被发现28072 bp的长度,67.6% G + C末端反向重复序列(也是)的337个基点。使用线(34基因库的爆炸),手动搜索数据库,和相关的病毒相比,PH1基因组序列预测包含49个orf(表4)。大多数羊痘疮密集或重叠,使一个基因密度1.74基因/ kb(平均572元/基因)。累计AT-skew PH1的情节基因组底部的图6显示拐点(圈)与转录变化方向一致表示注释羊痘疮,已经看到在其他haloviruses [7]。基因组中没有GATC图案,逆顺序,CTAG强烈弱势只有2主题(68年预期)。

相比,相关病毒SH1和HHIV-2(图6),PH1染色体被认为是类似的长度和更密切相关的SH1比HHIV-2(74%和54% nt身份、职责)。像PH1的基因组SH1和HHIV-2缺乏GATC图案,和CTAG缺席(SH1)或过低(HHIV-2)。PH1的也是和SH1份额78.5%核苷酸的身份,但PH1 ITR长于SH1的337和309元,分别地。部分原因是SH1已经取代了18 bp序列(gtcgtgcggtttcggcgg)在内部发现的左手ITR序列在相应位置的右手ITR显示小倒序列相似性。在PH1 ITR,这个序列两端保留。这种差异是否代表一个复合事件或一个错误也是复制的尚不清楚。对齐的也是三个病毒鉴定了大量的高度保守的区域(标记为1 - 9在图2补充,网上见补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/456318)。16个基点序列的末端(区域1)是守恒的,符合保护在线性的目的地链霉菌属质粒(35]。16个基点GC-rich序列在中间ITR(3)地区也是守恒的。短图案的c(8)区域或at富集序列(地区7和9)附近发现的内部也是结束。

示意图病毒基因组之间的灰色阴影图6 (b)显示区域的高核苷酸相似性,揭示差异PH1染色体和SH1并非均匀分布,但不同的基因组的长度一致。比较SH1和HHIV-2最近发表(13),自PH1 SH1基因组是如此相似,我们将集中以下描述PH1和SH1之间的差异。

在相应的子,有较低的块编码序列(或没有)相似。这些可能代表原位散度或短重组事件(例如,indels)。也有情况下,整个一个病毒开放框架中没有对应的相同器官的因为一个插入/删除事件(indel)。最后,有更换,相应区域内的序列显示低或没有相似但两侧序列相似性高。最大的差异如图可见6由于序列变化在或接近长和VP18 VP1基因编码的衣壳蛋白。总结的主要序列SH1和PH1及其位置之间的差异表5,这些不同的区域(DV)从DV1至DV18屈指可数。

两种病毒的序列是足够近,在许多情况下观察到的差异的机制可以推断。例如,DV2可能的结果删除事件,消除了SH1 ORF10 PH1染色体基因相同器官。两端的SH1 ORF几乎完美的直接重复(cggcctgac / cggcatgac)允许repeat-mediated删除发生,消除其间的序列。小直接导致重复删除前面描述的比较分析Haloquadratum walsbyi基因组(20.]。DV5似乎是一个indel, SH1 orf 14 - 16在PH1缺席,和一个反向重复(AGCCATG)发现两端的SH1不同地区历史上的这种变化可能是重要的。指定的蛋白质SH1 ORF 14 - 16是PH1大概是可有可无的(或其他蛋白质提供的功能),但是同族体SH1 ORF14也发现在HHIV-2 (ORF 6),和同族体SH1 ORF15发生在halovirus His1 (ORF13)。更换区域也很普遍,可以发生在orf(如DV3,衣壳蛋白VP1)提供额外的或替代的基因(例如,DV12和DV13)。几个不同地区内衣壳蛋白VP2基因改变的一个热点,因为重复的编码序列的性质,它指定一个蛋白质与甘氨酸和许多heptapeptide重复运行,如前所述,SH1 VP2 [27]。DV18明显是一个很大的更换,改变的预测长度较小的两个病毒衣壳蛋白VP18 (aa SH1 / PH1 865/519,职责。),还提供了SH1 3 orf不同或缺席PH1: 52岁的orf 53和54。例如,同族体SH1 ORF52 PH1不存在,但存在于HHIV-2(假定的蛋白质40)。虽然ORF48 PH1丝毫没有aa序列同源性SH1 orf 53和54,所有这些预测蛋白质携带CxxC图案,提示相关的功能,例如DNA结合活性(36]。

PH1染色体的基因与SH1 syntenic,和在同样的密集或重叠的子块,建议组织成操纵子转录。SH1基因组的转录的计划已经被报道之前(30.],PH1的序列对应子六个区域(P1-P6)决定在SH1显示五个(P1-P5)是守恒的。只差守恒SH1 P6相应区域(数据未显示),但这子强烈的监管SH1只有开关在感染后期(30.]。

2.8。结构蛋白基因

基因编码的主要病毒结构蛋白PH1(副总裁1 - 4、7、9 10和12)被MALDI-TOF确定(见上图),和这些蛋白质的基因被发现在相同的顺序和近似的职位是在SH1基因组(图6 (b)红子)。基因编码可以推导出微小的结构蛋白序列与SH1这VP5 VP6可能由PH1染色体orf编码25和29日分别和VP13 VP18 orf 23岁至49岁,分别。这将给PH1共有11结构蛋白,SH1一样。其中,VP7是最保守之间的两种病毒aa身份(98%),其次是VP4、VP9, VP3,和VP12身份(91% - -94%),VP5, VP6、和VP13身份(82% - -88%),VP2 (77%), VP1(65%),,最后,最不保守蛋白质VP18 (31%)。

2.9。PH1和其他Halosphaeroviruses相关基因位点

集群halosphaerovirus-related基因存在于两个最近的基因组测序haloarchaea,偶然发生。paucihalophilus和住宅。lacisalsi(图6(一))。这两个地区似乎代表完整的病毒基因组,但是他们保留共享一个相似的基因数量与病毒基因组序列和同线性描述下面(图6(一))。两位点显示亲缘的混合模式SH1 / PH1 HHIV-2,所显示的子匹配的颜色和基因的名字。如果这些基因位点代表前病毒已腐坏的要素随着时间的推移,他们的关系显示halosphaeroviruses建议不仅是一个多样化的病毒群,它们之间发生重组的一个重要层面,导致嵌合基因的组合。两个orf的绿色的偶然发生。paucihalophilus轨迹(图6)相关子中找到或非常接近的病毒基因组位点/质粒基因中发现其他haloarchaea建议额外(pro)病毒之间的联系20.]。

最近描述halovirus SNJ1携带许多羊痘疮同系物邻ViPRE描述之前的Hmc。mukohataei(从这里用ViPRE_Hmuk1),一个包含相关基因位点His2(和其他pleolipoviruses)以及Haloferax前病毒质粒pHK2(可能)和两个小的质粒Hqr。walsbyi(~ 6 kb, pL6A和pL6B)。后者的关系提供了更广泛的其他病毒的链接因为PL6基因(Hqrw_6002)同源染色体在某些pleolipoviruses (HPRV-3和HGPV-1),而另一个基因(Hqrw_6005)有关ORF16纺锤状的halovirus His1 [15]。后添加SNJ1 ViPRE基因同源染色体_Hmuk1,显著延长,仔细检查的侧翼区域显示tRNA-ala基因一端和相同的部分副本tRNA-ala基因(一个噬菌体整合酶基因)另一端(补充图1)基因除了这些点似乎是与细胞的新陈代谢。ViPRE_Hmuk1现在是39379元的长度,在59元直接重复(潜力丙氨酸网站),包括54个orf,其中许多有关haloviruses,类病毒(如整合酶,甲基转移酶,转录监管机构、DNA甲基转移酶和DNA糖基化酶),在或接近其他已知的ViPREs同系物,或几乎没有其他已知的蛋白质相似。这个轨迹还包括一个ORC1 / cdc 6同族体(Hmuk_0446),这将提供一个复制功能。

不同病毒的混合和质粒基因ViPRE内看到_Hmuk1是显著的,但也揭示了同源染色体中发现或相邻的其他物种的基因位点,例如基因同源染色体哈尔。marismortui在ViPRE的左端_Hmuk1(补充图1)。当这些基因被添加到先前描述Haloarcula轨迹(ViPRE_Hmuk1),这也大大扩展。它变成了25550个基点的长度,包括基因从Hmar_2382 Hmar_2404,两侧是一个完整的一端tRNA-ala基因和部分复制。它携带一个ORC1 / cdc 6同系物,整合酶和phiH-like阻遏以及pleolipovirus同系物。

2.10。转染的Haloarchaea PH1 DNA

PH1 DNA被引入哈尔。hispanica细胞使用挂钩方法(37),这些细胞被病毒空斑实验生产的筛查。图7显示转染细胞的增加与输入(nonproteinase K-treated)病毒DNA。估计效率为5.3×10³空斑形成单位每μg DNA。PH1 DNA被蛋白酶K或DNAase对待我(RNase-free)没有产生斑块(数据没有显示)。PH1 DNA被发现六种haloarchaea除了使转染哈尔。hispanica,包括属的成员Haloarcula,Haloferax,Halorubrum,Haloterrigena,和Natrialba(表6)。对于这些实验,发现病毒生产从转染细胞通过空斑实验指标的草坪哈尔。hispanica。

3所示。讨论

PH1在粒子形态非常相似,基因组结构和序列前面描述的halovirus SH1 [8,16]。像SH1,长期以来末端反向重复序列和终端蛋白质,表明protein-primed复制。纯化PH1粒子浮力密度相对较低,氯仿敏感和显示一个分层的衣壳结构,符合内部可能存在的膜层,作为SH1已被证明,HHIV-2, SNJ1 [13,26]。PH1的粒子稳定温度,pH值,减少盐是类似于SH1 [8]。PH1非常相似的结构蛋白序列和相对丰富的SH1,所以这两个病毒可能会共享相同的粒子几何(16]。

使用protein-primed复制的病毒,如噬菌体Φ29,携带病毒B型可以明确交互的DNA聚合酶与蛋白质附着在基因组末端和启动链合成(38]。Archaeoviruses His1 [7),Acidianus状病毒(39可能使用这种模式的复制。然而,无法找到一个聚合酶基因的基因组PH1, SH1或HHIV-2。DNA聚合酶酶大,唯一的ORF的SH1足够长编码等酶,以前也没有被指派ORF55结构蛋白,它指定一个865 aa蛋白质含有不保守域表明聚合酶(27]。HHIV-2的最近的研究表明,这种病毒基因(42)中相应的开放是一个病毒的结构蛋白,通过推理,这可能也相应的蛋白质SH1和PH1(不同族体存在于SNJ1)。这些病毒聚合酶基因,必须使用大量酶,但搜索病毒B型在宿主的基因组DNA聚合酶,哈尔。hispanica,或者在其他的基因组测序haloarchaea,没有发现任何的匹配。这强烈地主张一个复制机制,以Φ29是不同的。是显示一个有吸引力的选择链霉菌属线性的质粒,5′末端蛋白和细胞聚合酶用于复制(40]。终端蛋白质不用于主复制但最终修补(41),它已被证明,如果末端重复序列是远离这些质粒和末端的结扎,他们可以复制为环状质粒(42]。这提供了一个可测试的假设halosphaeroviruses复制的,也提供了一个路径之间切换线性(例如,PH1)和循环(例如,SNJ1)形式。使用主机聚合酶的能力也符合SH1 PH1染色体DNA转染不同haloarchaeal物种(31日]随着这些酶及其作用方式是高度保守的。

PH1的生长特性哈尔。hispanica,通过单细胞和单步增长实验,给值50 - 100病毒/细胞,显著低于SH1(200病毒/细胞)8)和HHIV-2(180病毒/细胞)13]。后者病毒裂解,而SH1 PH1, SNJ1开始生产细胞外病毒之前任何细胞密度下降,表明病毒释放可能发生没有消散。与SH1这是最明显的显示,几乎100%的细胞可以感染(8]。感染哈尔。hispanicaPH1是低效率的细胞(~ 30%),但在单步执行病毒生产增长的动力学曲线SH1 PH1是相似的,与病毒生产发生在几个小时而不是在一个明确的时间后感染。这两个病毒也很密切相关并感染同一宿主物种,所以很有可能他们使用相同的细胞退出计划。两种病毒,最终细胞密度减少单步执行文化,表明病毒感染并导致细胞死亡。这种出口方式似乎最大化生产的病毒随着时间的推移,随着宿主细胞存活一段时间。在自然水域咸水环境的细胞数量通常是高,但增长率很低(12),和高入射紫外线(通常是浅池塘)将破坏病毒DNA,所以减少病毒粒子释放的半衰期43]。这些因素可能青睐的退出策略显示这些病毒,提高传输到一个新主机的机会。

的主题GATC缺席PH1的基因组,SH1 CTAG HHIV-2,图案是缺席或大大弱势。所有三种病毒共享相同的主机,但GATC和CTAG图案是丰富的哈尔。hispanica基因组(到达CP002921和CP002923)。避免这些图案haloviruses His1、His2 HF1, HF2之前报告(7]。这种净化一般选择宿主限制性内切酶的结果,,Hfx。volcanii,正是这两个主题是目标(44]。一个Hfx。volcanii酶识别A-methylated GATC网站(45),另一个承认un-methylated CTAG网站(受基因组中甲基化保护)。在当前的研究中,这可以解释-转染结果Hfx。volcaniiPH1染色体包含两个CTAG图案。相比之下,SH1基因组不包含CTAG图案,可以使转染Hfx。volcanii(31日]。

PH1的比较和SH1基因组允许一个详细的图片之间的自然变化发生病毒密切相关,揭示可能由小重复删除事件,前面描述的过程的研究Hqr。walsbyi和称为repeat-mediated删除20.]。也有很多替代品,包括发生在长序列块开放阅读框架(如衣壳蛋白基因,VP1和VP18)。VP3和VP6已知的外表面形成较大的峰值SH1病毒粒子,大概一个或两个与宿主细胞受体(16]。PH1和SH1相同的宿主范围,符合高序列之间的相似性表明相应VP3 VP6蛋白质。

先前的研究SH1不能检测记录可在注释orf 1 - 3或55 - (30.]。orf 1和56个发生在终端反向重复序列,并且,在目前的研究中,人们发现没有羊痘疮PH1染色体对应于这些。考虑到两个基因组的密切相似,比较数据与转录数据一致,表明这些SH1 orf不习惯。SH1 orf 2和3更有问题,好这些也出现在PH1的同系物。之间的冲突比较基因组转录数据和证据需要进一步的实验工作来解决。最近的状态SH1 ORF55相关病毒的研究,证实了HHIV-2(如上所述)。

pleolipovirus集团已经在过去的几年里,急剧扩大,现在由一群不同的病毒基因组不同类型和复制策略。更值得注意的是,现在能看到类似的扩张与SH1-related病毒,其中包括病毒至少有两种复制模式和基因组类型(线性和圆形)。haloarchaeal基因组序列的证据显示不仅前病毒病例要素或质粒(例如,pKH2和pHH205)而且基因组位点(ViPREs)包含磁带的病毒基因来自不同来源,和至少两种情况(本研究中描述)丙氨酸出网站表明螺旋和机动性。虽然有一个清晰的关系与圆形ds - ssDNA病毒基因组复制(即通过滚动圆方法。,ssDNA形式是一个复制中间);更难解释衣壳基因磁带可以移动这些病毒和线性基因组和终端之间的蛋白质。在pleolipoviruses, His2线性基因组包含病毒B型DNA聚合酶和终端蛋白质,而所有其他的成员有圆形的基因组包含一个描述代表同族体可能通过滚动圆方法复制(14,19]。同样halosphaeroviruses, PH1、SH1 HHIV-2有线性dsDNA终端蛋白质和可能复制同样的,但相关的圆形dsDNA SNJ1病毒基因组。病毒的衣壳基因所表现出的明显关系在每一组中,加上连接显示haloviruses外每组(例如,His1和His2)的DNA聚合酶,都说重组的有力手段;可以随时开关衣壳与完全不同的病毒之间的基因复制策略。最有可能操作流程如何?ViPREs提出的一种可能性是,这似乎是移动的衣壳和复制来自不同来源的基因集合。他们提供发生重组的固定位置,提供基因磁带可以可行性产生新的病毒基因组,以及一些可能重组循环形式。例如,ViPRE_Hmuk1携带基因相关pleolipoviruses halosphaeroviruses,和其他haloviruses。目前尚未决定是否在这些位点的基因在细胞内表达(如衣壳蛋白基因)或者如果ViPREs提供任何主机的选择优势。

4所示。材料和方法

4.1。水的样本

水样本收集从1998年粉红湖(32°00′年代和115°30′E),咸水湖泊Rottnest岛,西澳大利亚,澳大利亚。同年上映haloviruses使用描述的方法(8]。一块哈尔。hispanica草坪板被和replaque纯化。这部小说halovirus PH1指定。

4.2。媒体、菌株、质粒

在这项研究中使用的媒体描述的在线资源,Halohandbook (http://www.haloarchaea.com/resources/halohandbook/index.html)。人工海水,含有30% (w / v)总盐,由4 M氯化钠、150毫米MgCl₂,150 mM MgSO₄、氯化钾90毫米和3.5毫米CaCl₂和调整pH值7.5 ~ 2毫升1 M Tris-HCl每升(pH值7.5)。米高梅含12%、18%或23% (w / v)总盐和HVD (halovirus稀释剂)准备从集中股票如前所述46]。Bacto-agar (Difco实验室)添加到米高梅固体(15 g / L)或顶层(7 g / L)媒体。

表1列出了haloarchaea用于这项研究。haloarchaea都增加耗氧在37°C在18%或23% (w / v)米高梅(取决于应变)和搅拌(除了“哈尔。sinaiiensis”)。使用的质粒是pBluescript II KS + (Stratagene克隆系统),pUBP2 [47],pWL102 [48]。pUBP2和pWL102第一通道大肠杆菌JM110 [49),以防止大坝DNA甲基化,这已被证明会降低转换效率在某些菌株(45]。

4.3。Negative-Stain电子显微镜

negative-stain TEM方法是改编自诉Tarasov,描述在网络资源,Halohandbook (http://www.haloarchaea.com/resources/halohandbook/index.html)。一个20μL下降的样本放在干净的表面,病毒粒子被允许吸附Formvar电影400 -网铜网格(ProSciTech)为1.5 2分钟。然后他们被负染色20μL下降2% (w / v)铀酰乙酸1 - 2分钟。多余的液体与滤纸吸收,和网格被允许空气干燥。网格检查要么飞利浦厘米120 BioTwin透射电子显微镜(皇家飞利浦电子),操作在一个加速电压120 kV,或西门子Elmiskop 102透射电子显微镜(西门子),操作在一个加速120千伏的电压。

4.4。病毒宿主范围

十二haloarchaeal属的菌株Haloarcula,Halobacterium,Haloferax,Halorubrum,和Natrialba(表1),13个自然Halorubrum隔离(h . Camakaris未发表的数据),和五个但一个个haloarchaeal隔离从湖哈代,粉色(在澳大利亚西部)和蛇形湖湖(d·沃克和m . k . Seah未发表的数据),筛选PH1易感性。溶菌产物从PH1-infected哈尔。hispanica文化(1×10¹¹空斑形成单位/毫升)被发现在草坪的应变(使用媒体和12%或18% (w / v)米高梅,取决于应变)和培养2 - 5天在30 - 37°C。

4.5。大规模病毒增长和净化

液体PH1的文化增加了感染早期指数(MOI, 0.05)哈尔。hispanica文化在18% (w / v)米高梅。文化孵化耗氧在37°C,搅拌,3天。结算(即。,complete cell lysis) of PH1-infected cultures did not occur, and consequently cultures were harvested when the absorbance at 550 nm reached the minimum, and the titre (determined by plaque assay) was at the maximum, usually ~10¹⁰-10年¹¹空斑形成单位/毫升。病毒纯化SH1使用前面描述的方法(8,31日),除了在最初的低速旋转(Sorvall GSA;6000 rpm, 30分钟,10°C);病毒从被感染的文化集中在26000转离心(13小时,10°C)到30% (w / v)蔗糖垫,HVD。体积小的颗粒是resuspended HVD和加载到一个预先线性5% - -70% (w / v)蔗糖梯度,紧随其后的是在1.3 g / mL集运等密度的离心(贝克曼70 ti;60000 rpm, 20小时,10°C)。白色的带病毒发生在密度为1.29 g / mL,收集和稀释halovirus稀释剂(HVD,看到部分4),病毒颗粒状(贝克曼SW55;35000 rpm, 75分钟,10°C)和resuspended HVD体积小和储存在4°C。病毒复苏的主要阶段补充表1中给出了一个典型的净化。纯的具体传染性病毒解决方案被确定为空斑形成单位/毫升的吸光度的比值在260海里。

4.6。PH1单步生长曲线

早期指数期的文化哈尔。hispanica生长在18% (w / v)米高梅感染PH1 (MOI, 50)。在这些条件下感染细胞的比例大约是30%。吸附时间后的1小时37°C,这些细胞被洗了三次为18% (w / v)米高梅(室温),resuspended 100毫升18% (w / v)米高梅(这些方法确保所有残留的去除病毒),和孵化37°C,用颤抖(100 rpm)。样品被每小时测量吸光度在550 nm和感染性中心的数量。后立即取样,滴定度空斑实验测定与草坪的一项指标哈尔。hispanica。每个实验进行了一式三份。

4.7。Halovirus稳定

各种治疗方法后,样品被稀释HVD,和病毒滴定度测定空斑实验哈尔。hispanica。每个实验进行了一式三份,代表数据显示。氯仿灵敏度检查的暴露PH1溶解产物在18% (w / v)米高梅氯仿的体积比1:4(氯仿溶解产物)。孵化是在室温下,不断搅拌。在适当的时间点,被允许定居,和一个样本被撤HVD上层和稀释。低离子环境的影响被稀释了PH1溶解产物(在18% (w / v)米高梅)到重蒸馏的H₂O的体积比1:1000(溶菌产物重蒸馏的H₂O)。孵化是在室温下,不断搅拌。样品在不同时期被移除,HVD稀释。PH1的pH稳定性是由稀释PH1的溶解产物在18% (w / v)米高梅在合适的pH缓冲(HVD缓冲与适当的Tris-HCl)的体积比1:100(缓冲溶菌产物)。孵化是在室温下,不断搅拌。30分钟后,样品被移除,HVD稀释。PH1的热稳定性是由一个1小时检查孵化病毒的溶菌产物在18% (w / v)米高梅在不同的温度下,之后他们将很快到室温,HVD稀释,滴定。

4.8。蛋白质的过程

去除盐、纯化病毒制剂和三氯乙酸(10% (v / v)最终浓度)和冰上孵化15分钟让蛋白质沉淀。离心(16000克,15分钟后,室温),沉淀在丙酮清洗三次,干,resuspended重蒸馏的H₂o .蛋白质溶解在Laemmli样品缓冲了48毫米β巯基乙醇(50),在沸水中加热5分钟,然后分开在12% (w / v) NuPAGE Novex Bis-Tris凝胶使用MES-SDS运行缓冲,根据制造商的方向(表达载体)。经过电泳,凝胶在双重蒸馏冲洗H₂O和沾0.1% (w / v)艳蓝G在40% (v / v)甲醇和10% (v / v)醋酸。凝胶和几位的变化使退色40% (v / v)甲醇和10% (v / v)醋酸。另外,凝胶是沾GelCode糖蛋白染色装备,Pro-Q翡翠488糖蛋白凝胶和污点染色装备,SYPRO Ruby蛋白质凝胶染色,根据制造商的方向(皮尔斯表达载体、分子探针、生物技术)。

蛋白质凝胶的乐队被削减和发送到澳大利亚的蛋白质组分析工具(麦格理大学)胰蛋白酶消化和分析基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)在应用生物系统公司4700蛋白质组学分析器(应用生物系统公司)。

4.9。DNA程序

蛋白酶K-treated和nonproteinase K-treated DNA准备工作就绪纯化PH1 SH1使用前面描述的方法(8]。DNA分离在1% (w / v)在Tris-acetate-EDTA琼脂糖凝胶电泳缓冲和与溴化乙锭染色(Sigma-Aldrich)。

λDNA, DNase我(RNase-free)、核酸外切酶III,绿豆核酸酶,核酸酶BAL-31, T4 DNA聚合酶,T4 DNA连接酶,T7核酸外切酶,和II型限制内切酶买来新英格兰生物学实验室。核糖核酸酶A和酵母转移核糖核酸从Sigma-Aldrich购买。蛋白酶K从Promega购买。从Geneworks,购买澳大利亚的寡核苷酸引物。

PH1染色体克隆片段,纯化病毒DNA也消化了Acc我,Eco0109我和均方误差我或Sma我限制内切酶,与DNA聚合酶钝化,大型(克莱诺)片段在适当的地方,和结扎Acc我,,Eco0109我,或者Sma我领悟了pBluescript II KS +使用T4 DNA连接酶,根据制造商的说明(新英格兰生物学实验室)。DNA被引入大肠杆菌包含15 XL1-Blue和转化株生长在Luria琼脂μg / mL四环素和100年μ克/毫升氨苄青霉素。由此产生的克隆测序,序列被用来设计特定的寡核苷酸引物PCR扩增和/或底漆使用病毒基因组步行(或特定的限制片段)作为模板。

放大PH1核酸,大约10 ng病毒DNA结合500海里引物,100年μ每个核苷酸的M, 1 U深发泄DNA聚合酶(新英格兰生物学实验室),和1×ThermoPol缓冲区(新英格兰生物学实验室),反应总量的50μl .模板在95°C变性10分钟,紧随其后的是30个周期为30秒95°C的变性,退火在56°C,持续30秒,2分钟在75°C扩展,最终在75°C扩展了10分钟。PCR反应进行PxE0.2热循环(热电公司)。使用3.2 pmol引物进行测序反应的双脱氧链终止法使用ABI棱镜大染料终结者混合版本3.1在3100年ABI毛细管测序器(应用生物系统公司)应用遗传诊断病理学测序服务部门(墨尔本大学)。

获得终端基因组片段,PH1 DNA被酶消化Pas1,和头(~ 700个基点)和尾(~ 1300个基点)碎片被QIAEX II凝胶纯化提取工具和处理0.5哌啶为2小时37°C去除蛋白质残留。piperidine-treated碎片是由基因组测序的生物科技公司(台北,台湾),使用两个引物:TGACCAATTAATTAGGCCGGTTCGCC (PH1染色体head-R)和GTGCCATACTGCTACAATTCT (PH1 tail-F)。

四百五十四全基因组测序:PH1 DNA样本(~ 5μg)是使用并行焦磷酸测序罗氏454基因组定序器系统在任务生物技术(台北,台湾)。最大的重叠群是27399年与8803年读(贝尔2.7版),有27387个职位被Q40质量。覆盖每个基地的平均深度是82.9。基因库的加入对整个KC252997 PH1序列。

确认

作者感谢卡洛琳浴,梅Kwei Seah(琼)和丹尼尔·沃克早期作品PH1表征;西蒙•克劳福德乔斯林木匠,和安娜Friedhuber援助与透射电子显微镜;蒂芙尼考伊和Voula Kanellakis测序援助。本文已被访问澳大利亚促进蛋白质组分析工具建立在澳大利亚政府的主要国家研究机构计划。SLT的赠款支持生物多样性研究中心、中央研究院、台湾。

补充材料

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