铜、镉阻力因素的分子表征Biomining Thermoacidophilic Archaeon硫化叶菌metallicus

文摘

硫化叶菌metallicus是一个thermoacidophilic crenarchaeon用于高温bioleaching过程强调条件下能够生长,如高浓度的重金属。然而,负责重金属抗性的遗传和生化机制美国metallicus仍无特征。蛋白质组学分析美国metallicus细胞暴露于100毫米铜显示18的30调节相关蛋白的生产和转换能量,氨基酸生物合成和应激反应。10这些蛋白质也上调美国metallicus治疗的1毫米Cd表明至少在某种程度上,一个常见的一般应对这两种重金属。的美国metallicus基因组包含两个完整警察基因簇,每个编码一个metallochaperone (CopM),一个Cu-exporting腺苷三磷酸酶(国王)和转录监管机构(科普特人)。转录表达分析显示copM和国王杯从每个警察基因簇cotranscribed和转录水平增加时美国metallicus生长在铜或使用黄铜矿(财经吗₂)作为可氧化的底物。这项研究显示了第一次的复制版本的存在警察基因簇中古生菌和描述一些铜和Cd抵抗高温archaeon用于工业biomining决定因素。

1。介绍

Bioleaching是一种不溶性金属化合物的生物转化成水溶性形式(1,2]。Microbe-based过程具有明显的经济优势在金属的提取从许多矿床(3),而这些金属提炼过程通常比物理化学过程(更环保3- - - - - -5]。一些矿石耐火嗜中温浸出和温度最好是需要高达75 - 85°C (6,7]。在高温下,biomining财团由thermoacidophilic主导古生菌的属硫化叶菌,Acidianus,和Metallosphaera(8]。

金属扮演不可或缺的角色在生活中微生物的过程,但在高水平至关重要的和不重要的金属都可以破坏细胞膜,改变酶的特异性,扰乱细胞功能和损伤DNA的结构(9,10]。酸浸的解决方案的特点是大部分有毒的金属浓度高的生活,可能,微生物生长在矿产资源丰富的环境中,在大多数情况下,非常包容广泛的金属离子(3,11和应具备强大的金属耐药机制11- - - - - -15]。

尽管如此,只有一些金属公差值已报告(6)和遗传和生化机制负责金属电阻biomining嗜酸性古生菌刚刚开始是特征(16]。因此,重要的是进一步了解所使用的机制这些微生物的适应和抵抗高浓度的重金属。

相关热点铜(铜)耐药机制,一些金属射流泵已确定从测序的基因组这一领域的一些成员17]。Cu-resistance (警察)轨迹被描述古生菌,其中包括基因编码一种新的热点转录监管机构(科普特人),一个假定的metal-binding伴侣蛋白(CopM)和一个假定的Cu-transporting p型atp酶(国王杯)[10]。中描述了Cu-resistance机制是相同的硫化叶菌solfataricusP2和能源acidarmanus。在这两种微生物,假定的金属陪伴和腺苷三磷酸酶cotranscribed及其转录水平显著增加铜暴露,表明铜流出的运输系统操作(18,19]。最近,它是描述copRTA操纵子的美国solfataricus应变98/2 (copTMA在美国solfataricusP2) cotranscribed在低水平的未启动子在所有情况下,而增加的转录copTA子发生在铜过剩的存在。这些作者提出了铜的内稳态模型硫化叶菌依靠铜射流和封存(20.]。

在硅研究进一步发现CPx-ATPase最有可能介导流出的重金属阳离子的biomining archaeonMetallosphaera sedula(21]。这一假定的蛋白质的p型atp酶具有显著的身份美国solfataricus(国王)19]。此外,m . sedula包含子与显著的相似性CopM(Msed0491)和科普特人(Msed0492)美国solfataricus(21]。最近,Maezato et al。22)报告基因方法探讨特定的金属电阻之间的关系和lithoautotrophy在黄铜矿的生物转化m . sedula。它的功能作用copRTA操纵子是由跨物种证明Cu-sensitive互补美国solfataricus copR突变体(22]。

镉(Cd)在低浓度时非常有毒,可能致癌。然而,这种金属的生物效应和毒性的机制还不清楚(23- - - - - -26]。在一些中性微生物,Cd都是通过镁和锰吸收系统(23]。虽然在上的嗜酸生物机制尚未阐明,假定的Cd阻力操纵子在一些在嗜酸微生物基因组测序已确定。最高的物种的同源性每主题是Acidithiobacillus ferrooxidans和热原体属spp。这些高相似性表明Cd出口中可能是一个常见的抗性机制上的嗜酸生物(11]。最近,一个依赖于时间的转录组分析使用微阵列抗放射性的archaeonThermococcus gammatolerans细胞暴露于Cd显示相关基因的诱导金属体内平衡,药物解毒,代数余子式的再氧化,ATP生产、DNA修复(27]。

一个替代机制提出了金属公差在微生物金属阳离子的封存无机聚磷酸盐(息肉)28),同时细胞内离子浓度会调节聚合物的水解(29日]。美国metallicus可以容忍非常高浓度的铜和积累大量的息肉颗粒(14,30.]。此外,细胞内息肉的水平大大降低当这个archaeon生长在200毫米铜或转移到100毫米铜(14,30.]。增加exopolyphosphatase (PPX)活动和π射流由于铜的存在表明金属耐受性机制介导通过息肉14,30.]。实际证据表明息肉可以提供机械的选择优化微生物健身的适应压力环境下的极端微生物之间的相关性和可能是至关重要的。息肉代谢的基因Crenarchaeota只有部分阐明,只要息肉合酶活动仍报告和特征在这个王国15]。

到目前为止,还没有研究,使潜在的遗传和生化机制美国metallicus成长在这样高浓度的铜和其他金属。理解这些机制可能特别有用的潜在改进bioleaching微生物,这可能增加bioleaching流程的效率。自的基因组美国metallicus目前没有,可能的基因参与铜电阻使用CODEHOP和搜查了“基因组步行”的方法,这些孤立的基因的转录表达被实时rt - pcr进行评估。此外,蛋白质组学的方法是用来识别可能的蛋白质参与抗铜和Cd美国metallicus。据我们所知,这是第一篇论文显示的复制版本的出现警察基因簇中古生菌并提供洞察分子铜和Cd阻力因素在高温工业biomining archaeon雇用。

2。材料和方法

2.1。品种和生长条件

美国metallicusDSM 6482年增长88年中等65°C(德意志Sammlung冯Mikroorganismen和Zellkulturen)含有0.05% (w / v)单质硫和0.02% (w / v)酵母提取物。美国solfataricusDSM 1617年增长182年中等70°C(德意志Sammlung冯Mikroorganismen和Zellkulturen)和0.1% (w / v)酵母提取物和0.1% (w / v) Casamino酸。研究Cd的宽容美国metallicus和美国solfataricus,microoganisms生长在各自的媒体,除了不同浓度的Cd(0.005 - 5毫米)在场最初,显示在相应的实验。

对微分表达式化验,美国metallicus细胞生长在没有铜或Cd的早期的固定相,并删除从细胞中离心后,然后他们被转移到新媒体CuSO包含100 - 200毫米₄(从现在起铜)或1毫米CdSO₄从现在起(Cd)在24小时。这一次后,细胞治疗获得蛋白质提取物。增长是通过测量监控无污点的细胞数量的相衬显微镜下Petroff-Hausser室。

2.2。制备蛋白质提取物美国metallicus

细胞从800毫升的控制文化发展到10⁸早期细胞/毫升(固定相),或者文化转移到100 - 200毫米铜或1毫米,被离心收获7700克15分钟。球是用88把硫介质。细胞被resuspended在50 mM Tris-HCl pH值8.15,10毫米EDTA, 100μ(20 g / mL PMSF缓冲区μL /毫克湿重),冷冻,用六次每次30年代。5分钟的溶解产物离心机在4300 g,消除细胞碎片。上层清液的蛋白质浓度是由布拉德福德的方法(Coomasie +蛋白检测试剂,皮尔斯)。在120年和500年之间μg蛋白质提取的蛋白质混合能源论坛补液合作缓冲区,所描述的Hatzimanikatis et al。31日和崔书记和李32)做了一些调整,包括8 M尿素、硫脲2 M, 2% (w / v)的家伙们,Bio-Lyte 3 - 10 0.27% (v / v), Bio-Lyte 5 - 8 0.13% (v / v)和溴酚蓝0.001% (w / v),其次是孵化为30分钟25°C。德勤(0.03克)和无菌nanopure水被添加到完成最后一卷300μl .样本在室温下培养1 h。

2.3。等电聚焦()

每个样本(300μL)加载到pH值3 - 10(非线性)17厘米IPG条(Biorad)在第一维度室,并在室温下孵化1 h。矿物油(2.5毫升)被添加到防止尿素样品的蒸发和降水,和带被动水化18 h。能源论坛千变万化的等电聚焦进行合作(Biorad)使用下列条件:15分钟250 V, 2000 V 2 h, 4 h 8000 V, 10000 V 11 h,和50 V为4 h,达到120000 V / h。

2.4。sds - page

second-dimensional电泳前,带平衡描述了Hatzimanikatis et al。31日)做了一些调整。条被孵化15分钟解决方案包含6 M尿素,156毫米德勤,30% (v / v)甘油,2% (w / v) SDS和24毫米Tris-HCl pH值6.8,随后15分钟在溶液中含有6 M尿素,135毫米碘乙酰胺,30% (v / v)甘油,2% (p / v) SDS, 24毫米Tris-HCl pH值6.8。最后,条是孵化与含有192毫米甘氨酸的电泳缓冲液,1% (w / v) SDS和250毫米Tris-HCl pH值8.3,直到second-dimensional运行。sds - page都使用了千变万化的二喜细胞如Laemmli所述33),凝胶由11.5或15% (w / v)的聚丙烯酰胺。条被覆盖到second-dimensional凝胶密封为1% (w / v)琼脂糖电泳缓冲含有微量溴酚蓝。电泳是在恒定70 V 15 h。所有实验进行了一式三份。凝胶染色用银或Coomasie蓝g - 250所描述的舍甫琴科et al。34)和Giavalisco et al。35),分别。

2.5。凝胶分析和质谱分析

凝胶图像被扫描(爱普生)和数字化分析与δ2 d软件(Decodon)来识别点差异表达由于有毒金属的存在。估计的相对定量的基础上改变了在银彩色凝胶体积百分比的变化。点感兴趣的是从Coomasie恢复蓝g - 250彩色凝胶手动和被送到电子喷雾电离串联质谱分析(串联MS-MS: ESI-QUAD-TOF)。获得的结果进行了分析与吉祥物算法(http://www.matrixscience.com/index.html通过使用MS / MS)离子搜索,和所有可用的基因组数据库被用作查询。整个女士在剑桥中心进行蛋白质组学分析,英国剑桥大学。

2.6。CODEHOP-PCR

国王和CopM氨基酸序列美国acidocaldarius,年代。tokodaii和美国solfataricus得到从NCBI (http://www.ncbi.nih.gov/)。调整后的序列使用CLUSTAL X程序同源性的识别领域,根据CODEHOP consensus-degenerate PCR引物的设计策略36,37),使用万维网访问http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html。两个区域的序列相似性被确认为国王杯和CopM序列,分别(图S1看到Supplementry材料

可以在网上http://dx.doi.org/10.1155/2013/289236),并用于设计consensus-degenerate混合寡核苷酸引物(表1)。Consensus-degenerate混合寡核苷酸引物设计和N -糖基的国王,而一双退化混合寡核苷酸引物设计为CopM(图S1)。

放大反应包含1 x高温DNA聚合酶缓冲MgCl 2毫米₂核苷酸,0.2毫米,0.5μ每个引物的米,5 U Taq DNA聚合酶,40 ng美国metallicus基因组DNA作为模板和水最后一卷50μl的热循环在95°C条件3分钟;后30 95°C的周期30年代,50°C 30年代,72°C, 1分钟;1最后10分钟的额外周期在72°C。放大的产品被应用到1.0% (w / v)琼脂糖凝胶,和主要放大乐队被切除,纯化,TA-cloned pCR2.1-TOPO(表达载体)向量,最后测序。

2.7。基因组步行实验

基因组行走策略进行描述Acevedo et al。38]。因此,一个双链oligo-cassette AdaptT适配器是由两个磷酸化引物的退火AdaptF: (5′-CTAGGCCACGCGTCGACTAGTACTA-GCTT-3′)和AdaptR: (5′-AGCTAGTACTAGTCGACGCG-TGGCCTAG-3′)。退火是由加热引物(10μ米)在沸水浴5分钟,然后慢慢冷却到室温。

建立了六种不同的DNA库通过消化1μ克美国metallicus基因组DNA与以下限制性内切酶:后三世,Bam你好,生态RI,生态房车,以区域我和太平洋标准时间我,分别。DNA消化反应进行了使用10 U的限制性内切酶,2μ在20 L相应的酶反应缓冲区μ总反应体积的L。反应混合物在16°C在16 h孵化。完成3′隐性的DNA片段,并添加一个3′悬臂腺嘌呤,500 ng的消化和纯化的DNA被孵化与5 U的Taq DNA聚合酶,1μL(10毫米混合核苷酸5μL 10 x高温DNA聚合酶缓冲在50个μ在70°C L总量,45分钟。七个μL的混合物被孵化15 pmol AdaptT oligo-cassette, 1 U T4 DNA连接酶(Promega)和2μL 5 x连接酶的缓冲区,总量的10μl .结扎的反应是孵化16°C在16 h。

两个连续放大反应被执行。第一个PCR反应是用1 x Elongase混合缓冲,1.9毫米MgCl₂核苷酸,0.2毫米,0.5μ米第一特定引物(SP1)(从已知的目标基因序列设计;正向引物被用来放大3′端反向引物5′端放大),5μL的结扎DNA稀释10倍和1μL (Elongase(表达载体)和水最后一卷50μl .热循环条件如下:1在94°C周期1分钟,20 94°C的周期32和68°C 5分钟,在70°C和最后一个额外的周期为7分钟。PCR产品稀释10倍和3μL是用作DNA模板PCR,第二个是使用相同的条件执行第一个PCR为0.5μ米第二特定的引物(SP2)和0.2μM oligo-cassette-specific底漆AdaptF2 (5′-CACGCGTCGACTAGTACTAGCTT-3′)和1μL Elongase。热循环条件1周期在94°C 1分钟,35周期32 94°C的年代,5分钟和68°C, 1最终额外的周期在70°C 7分钟。PCR产品被切除,净化,TA-cloned pCR2.1-TOPO(表达载体)向量,最后测序。

2.8。总RNA的隔离

收集细胞颗粒(10毫克湿重)和稀释60μL十缓冲区(20毫米Tris-HCl pH值8.0,1毫米EDTA, 100毫米氯化钠)其次是60μL TENST缓冲区(20毫米Tris-HCl pH值8.0,1毫米EDTA, 100毫米氯化钠,1.6% Na-lauroyl肌氨酸,和0.12% Triton x - 100)。这种悬架是孵化在室温下15分钟允许细胞溶菌作用。总RNA然后使用试剂盒提取试剂(表达载体)推荐的制造商。DNA污染的RNA准备被DNase我治疗(罗氏),遵循制造商的指示。核糖核酸纯化,沉淀,最后在diethylpyrocarbonate resuspended (DEPC)处理过的水。总RNA浓度被分光光度测量(OD估计_260年)及其质量评估通过确定吸收的比例在260 nm和280 nm),这是首选的1.8 - -2.1范围内。

2.9。Northern

Northern差异基因表达的实验中,媒体被补充与不同浓度的铜(5-50毫米)、Cd(5毫米),你₄(15毫米),ZnSO₄(50毫米),或Ag)₂所以₄(0.08毫米),分别表示。对于一些实验中,元素硫取代黄铜矿(中央财经₂)集中,作为唯一的能量来源为1% (w / v)。

总RNA (5μg)是由电泳分离甲醛1%琼脂糖凝胶吸水Hybond-N尼龙膜上紧随其后(英国Bucking-hamshire Amersham淀粉微球的生物技术)。杂交被Sambrook等进行了描述。40]。DNA探针被随机引物标记DNA标签工具包(Fermentas)使用(α-32 p] dCTP。杂交信号的检测和分析利用分子成像外汇软件系统和数量。这些基因探针扩增的引物序列表中列出1。

2.10。Cotranscriptional rt - pcr分析

研究相邻基因的表达copM和国王杯,通过使用0.8互补脱氧核糖核酸合成μg的总RNA美国metallicus文化生长在20毫米铜的存在和反向引物组合国王杯序列。正向引物退火copM序列用于PCR反应(表1)。PCR扩增与1的进行μL 1/10稀释的cDNA 25 pmol底漆。放大条件包括变性的初始3分钟在95°C,紧随其后的是35周期30年代在95°C, 30年代在55°C,和1.5分钟在72°C,在10分钟完成在72°C。没有酶逆转录酶反应是为了排除放大由于基因组DNA污染。

2.11。定量rt - pcr

已经没有dna单链0.8 ng的互补脱氧核糖核酸合成细胞RNA样本使用随机五个一(Fermentas)和ImProm-II逆转录系统(Promega)制造商的指示。软件工具IDT Scitools DNA技术(集成)被用来设计引物的扩增子150 - 200个基点(表1)。qPCR与2执行μL 1: 10稀释cDNA样本,12.5μL 2 x QuantiFast SYBRGreen PCR反应混合液(Quiagen), 1μM的底漆,水最后一卷25μl .每一对引物的效率计算的平均斜率线性回归曲线,这都是因为qPCRs使用10倍稀释系列(10 ng第10页)美国metallicus染色体DNA作为模板。Cq值(量化周期)是自动由实时PCR Rotor-gene 6000软件(生命科学Corbett)在40周期。Cq值感兴趣的每个记录的是标准化的Cq价值16 s核糖体rna基因(39]。至少3生物复制的评估条件和2技术复制/ qPCR反应进行。

3所示。结果与讨论

3.1。宽容的美国metallicus和美国solfataricus铜和光盘

在之前的工作中,这是确定美国metallicus能够容忍高铜浓度。而100毫米铜的存在并不影响美国metallicus生长动力学,观察细胞生物量的减少只有30%当暴露于200毫米铜(30.]。高耐铜被描述在其他嗜酸性与中性微生物(细菌和古生菌相比,主要是11,14]。进一步扩展,这分析描述的反应美国metallicusCd。因此,这是确定美国metallicus增长并不影响在0.5或1毫米Cd相比的控制条件没有金属(图1(一))。此外,当美国metallicus挑战2和3毫米Cd,这是发现在指数增长阶段后期,细胞数量下降了30 - 50%,分别为(图1(一))。此外,增长美国metallicus在5毫米的存在完全抑制Cd(图1(一))。另一方面,美国solfataricus无法增长Cd浓度大于0.05毫米(图1 (b))。在0.01毫米光碟,美国solfataricus细胞数减少35%左右(图1 (b))。这些结果与之前的报道相一致美国solfataricus被证明能够增长到0.01毫米Cd [41]。其他嗜酸性archaeons参与bioleaching过程,例如Metallosphaera sedula和能源acidarmanus被发现能够容忍0.9和9毫米的Cd,分别为(18,42]。最低抑制浓度(MIC) Cd被描述为不高于1毫米数高温和中性Thermococcus物种(43]。最近,据报道,最抗放射性的archaeon,Thermococcus gammatolerans2毫米的麦克风,Cd浓度(27]。迄今为止,尽管其中一些微生物的重金属耐受性显示,策略来承受压力来自过渡金属最广泛的研究只有在haloarchaea [44]。

3.2。铜和Cd对全球蛋白质组的影响美国metallicus

分析了蛋白质组学对铜的反应和Cd来识别蛋白质可参与重金属抗性美国metallicus。早期的固定相生长细胞治疗或治疗100或200毫米铜或1毫米Cd在24小时期间,通过比较和分析二维凝胶电泳显示在实验过程。23蛋白质被发现是下调100毫米铜治疗后(图2(一个))。类似的模式获得了在200毫米铜(没有显示)。此外,用δ2 d软件(Decodon), 11这些蛋白质被发现完全没有凝胶和超过8蛋白减少强度的范围从1.5——5倍相比,控制细胞生长在铜(图的缺失2(一个))。因此,这些结果表明,大量的蛋白质成为non-detectable或减少他们的水平美国metallicus面对铜。这样的反应也发生在微生物被暴露在Cd(数据未显示)。这种行为也观察到类似的研究f . acidarmanus是挑战,(III)或铜(16,18]。此外,30其他蛋白质的表达被发现调节铜治疗后(100或200毫米)(图2 (b))。大多数这些蛋白质可以确定只有在与铜、条件和点5,13和15诱导2.6,3.4,和5.5倍,分别,而细胞没有铜治疗。此外,3低分子量的蛋白质(3点31日,33),增加了他们的表情当细胞暴露在100毫米铜也被发现(图2底部面板)。这些蛋白质时才发现15%使用聚丙烯酰胺second-dimensional (sds - page)分离。另一方面,大量减少整体表达的蛋白质1毫米Cd治疗后观察(没有显示)。有趣的是,10的13当细胞表达蛋白的鉴定为上调暴露于Cd和铜处理后还显示水平上升。他们中的一些人在图所示3。

3.3。识别的蛋白质调节细胞对铜和Cd美国metallicus

总共18美国metallicus蛋白质的水平被发现是上调对铜被质谱分析。确定蛋白包括功能相关的生产和运输能量,生物合成的氨基酸,应激反应和转录调控(表2)。在生产和运输相关的蛋白质的能量,一个假定的ATP合酶亚基B(现货23)被描述为ATP合成发挥根本性作用被发现(表2)。当细胞受到一些强调条件如重金属的存在,更大的细胞对能源的需求已报告发生(18]。最有可能的是,这种现象可能是由于ATP-driven铜运输通过atp酶有实质性的相互作用在金属解毒(45]。此外,ATP合酶亚基B时也被确定为上调美国metallicus是治疗Cd(表吗2)。

另外两个蛋白质与假定的氧化还原酶,如铁氧还蛋白氧化还原酶(现货3)和酒精脱氢酶(现货4),已普遍参与电子运输链和使用河畔⁺作为电子受体。铁氧化还原蛋白的水平氧化还原酶也上调对Cd(表2)。一些先前的报道表明,氧化还原酶导致的氧化保护细菌和古菌在重金属(46- - - - - -48]。中性的微生物大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,它被描述氧化酶类和脱氢酶有助于氧化保护、铜内稳态、和压力反应(46,47]。此外,一些参与蛋白质氧化损伤修复,如NADH-dependent氧化酶类和硫氧还蛋白还原酶,在细胞的表达f . acidarmanus暴露(III) (16]。这组蛋白的表达也被观察到的相同的微生物暴露时铜(18]。因此,氧化还原酶起着重要的作用对氧化应激和可能消除活性氧,构成的主要组成部分过渡金属(造成的压力44,49,50]。

氨基酸的生物合成相关的酶被发现普遍上调针对铜或Cd。他们与磷酸甘油酸盐脱氢酶(9点)和谷氨酸脱氢酶(现货20)。前一个催化河畔⁺端依赖氧化磷酸甘油酸3-phosphohydroxypyruvate,糖酵解途径的分叉点和初始反应L-serine生物合成(51]。谷氨酸脱氢酶催化氧化脱氨基作用的谷氨酸生产2-oxoglutarate与减少NAD和氨⁺(52]。参与氨基酸合成蛋白质在细胞的表达f . acidarmanus暴露(III) (16]。此外,增加水平的蛋白质生物合成的含硫氨基酸被观察到酿酒酵母细胞暴露于Cd [24),这表明这些蛋白质可能也在不利条件下的细胞反应。

两种蛋白质显示身份等应激反应机制的组件的一个亚基HSP60 chaperonin(现货24)和蛋白酶体的一个亚基(位置1)。在古生菌,压力HSP60蛋白是直接参与蛋白质折叠过程53]。蛋白质组学分析f . acidarmanus细胞暴露于(3)和Cd显示参与蛋白质折叠的蛋白质的表达和DNA修复,包括HSP60 chaperonin DnaK热休克蛋白(HSP70);从而作者建议这个微生物使用多种机制抵抗高水平的铜(16,18]。另一方面,水解酶被描述为非特异性蛋白水解纳米与蛋白质分解代谢有关。水解酶,密切参与维持蛋白质降解折叠小姐和变性蛋白质质量控制的细胞应激反应在所有三个领域的生活(54]。的蛋白质组学分析thermoacidophilic archaeon热原体属acidophilum表明,水解酶和chaperone-related蛋白高度对应力诱导条件,表明高周转率的蛋白质(55]。在p . furiosus的表达式β1亚基的蛋白酶体在细胞受到热休克诱导应力(56]。此外,蛋白酶体亚基也发现差异时美国metallicus受到了Cd压力(表吗2)。

蛋白质的转录规章制度与假定的转录监管机构(现货32)和转录因子努(现货33)参与的内在终止转录(57]。重镇也报道显示重要功能细胞反应的不利因素(58]。的表达两个转录监管机构相关氨基酸生物合成和metal-dependent基因镇压被发现被诱导p . furiosus细胞受到氧化应激(48]。此外,多个基因的表达编码预测转录监管机构诱导Cd曝光后t . gammatolerans细胞(27]。

点5、6、13、14、15、21、22日,30日和31日(表2)并没有显示出显著的成绩与任何现有蛋白质序列数据基地。有趣的是,点2、4、9、13、21日和30被发现时通常调节美国metallicus细胞治疗与铜或Cd(图3、表2)。

这里给出的结果与以前的工作相一致描述全球蛋白质表达谱,以应对重金属报告f . acidarmanus(16,18),微生物层社区在一个网站(酸性矿山废水59),和其他原核和真核微生物(24,60]。因此,协调不同群体的基因的表达表明监管网络的存在,如应激反应机制和呼吸链调整应对重金属离子的存在(61年]。

3.4。Cu-Resistance (Cop)基因集群复制美国metallicus基因组

Cu-resistance (警察)轨迹被描述在古细菌的基因组是高度保守的,由基因编码一种新的热点转录监管机构(科普特人),metal-binding伴侣蛋白(CopM)和Cu-transporting p型atp酶(国王)19]。因为的基因组序列美国metallicus还没有提供,我们寻找的存在吗警察基因通过共识退化混合寡核苷酸primers-based PCR (CODEHOP-PCR)。国王和CopM氨基酸序列比对美国acidocaldarius,s . tokodaii和美国solfataricus被用来确定保守序列块,因此设计CODEHOP或夹住退化混合寡核苷酸引物(图S1,表吗1)。从而PCR检测使用美国metallicus基因组DNA为模板扩增子的ca。150 bp和ca。950个基点copM和国王杯CODEHOP一对引物,分别为(数字4(一),4 (b))。估计从引物对氨基酸序列比对上的立场,获得PCR产品与预期大小、暗示的存在copM -和国王杯例如基因美国metallicus基因组。为了确定放大DNA片段的身份,他们TA-cloned和测序。Blastx序列分析显示,150个基点的DNA片段编码为一个不完整的ORF分享63%的同源性美国solfataricusCopM (SSO10823),而950 pb DNA片段的分析产生了部分开放分享54%的同源性美国solfataricus国王杯蛋白(SSO2651)。

的基因组组织公认的警察基因在美国metallicus分析发现其相似性与先前描述的吗美国solfataricusP2和f . acidarmanus,那里的警察集群由tandem-orientated基因copTMA(18,19]。因此,使用copM_degF(向前)和copA_cdegR(反向)引物,我们试图放大一个假定的copMADNA区域。这PCR了ca的产物。2000 pb,对应于预期的大小,导致2 orf显示与CopM序列同源性高、国王杯美国solfataricus(图4 (c))。有趣的是,当调整copMA序列的国王杯和copM序列获得以前,他们是不相同的,强烈暗示的存在重复的假定的警察基因编码Cu-ATPases (copA1和copA2)和metallochaperones (copM1和copM2)美国metallicus基因组。

隔离整个警察基因序列、基因组步行方法描述Acevedo et al。38使用了)。图书馆是由六种不同的DNA美国metallicus基因组DNA与多个限制性内切酶消化,包括5′过剩和钝端限制性内切酶。DNA库被用作模板2连续PCR反应。从先前已知的序列,两个特定引物的3′端放大和两个特定反义引物的5′端放大设计(缩写SP1和SP2)。因此,假定的基因的5′和3′端copA1和copA2,部分通过基因组步行技术确定放大。

通过重叠序列孤立的简并PCR和横向序列获得的基因组步行(图S2),可以完成整个公认的基因的核苷酸序列copA1。此外,可以确认上游的存在copM1基因和确定部分的发生copT1基因的上游tandem-orientatedcopM1(图5)。通过额外的基因组步行实验,部分copT1序列可以进一步完成。同样是真的当隔离整个假定的基因的核苷酸序列copA2一样的存在copM2和copT2基因的上游被证实copA2。然而,它是不可能完成的整个5′末端的基因copT2为确定长度与相比只有90%的完整美国solfataricus科普特人基因(图5)。

总之,简并PCR结合基因组实验允许描述发生在散步美国metallicus基因组的2警察基因位点(命名为轨迹cop1和轨迹cop2)编码paralogous基因可能参与Cu-resistance(图的产品5)。尽管一些古细菌基因组展览两份假定的Cu-P-type atp酶的描述美国solfataricus(62年),显示为一个基因组安排警察基因簇(copTMA)已经被报道在只有一个代表许多古细菌基因组复制(10,19,21]。此外,我们进一步分析寻找重复的更新警察基因集群中所有可用的最新的古细菌基因组序列(2012年10月),检索只有一个警察轨迹在每种情况下。因此,我们建议的发现警察基因簇的基因组复制美国metallicus是到目前为止前所未有的特性的一个代表古生菌域和可能导致其高金属电阻。

在这种情况下,它已被广泛报道,增加基因拷贝数可以提高基因表达允许原核的繁荣增长限制条件下(13,63年- - - - - -68年]。然而,除了增强基因复制,不能排除的警察操纵子重复美国metallicus可能会带来其他:Cu-ATPases更广泛的曲目,这可能不同的金属亲和力和/或特异性,射流速度,和/或差异丰富监管。

在氨基酸序列分析,进一步确定每个编码的多肽美国metallicus,除了CopT1,显示高度同源同源同行编码Sulfolobales(表3)。此外,3 orf编码的轨迹cop2共享标识与相应的约90%美国solfataricus直向同源多肽(表3)。美国metallicus警察基因产品显示特征域,称为各自提出了生物活性的关键。美国metallicusparalogous基因产物CopA1 (749 aa′)和CopA2 aa(747′)共享51.3%的身份。这两个假定的Cu-ATPases (CopA1和CopA2)包含氨基酸序列基序共产党ALGLA已提出授予Cu-transporting特异性CPx-ATPases [48),还发现在其他CopA-like蛋白质biomining细菌和古菌(14]。

另一方面,CopM1 (71 aa)和CopM2 56 (aa),分享66%的身份,提出金属绑定域垃圾(贩卖、阻力和遥感重金属)(10]。此外,当分析假定的转录监管机构、c端垃圾的存在域CopT1和CopT2也发现。CopT1序列还包含整个n端helix-turn-helix (HTH)图案(图中未显示),类似于原核转录监管机构的dna图案,如Lrp-like蛋白质(67年]。HTH图案只有部分中确定CopT2自5′的地区copT1基因尚未被完全孤立。

3.5。转录分析美国metallicus警察的基因

要洞察的作用警察位点,相应基因的表达在不同条件下进行了分析。美国metallicus最初生长在存在不同的重金属(铜、锌、Cd,倪o Ag)在给定的浓度并不影响增长动力学(30.,42]。随后,总RNA分离指数生长后期文化和北方污点实验是为了确定两者的表达copA1和copA2基因。如图6,转录copA1和copA2使者特别诱导在铜和镉离子的存在。这种基因表达模式是在良好的协议与被描述美国solfataricus,bicistroniccopMA转录水平也发现上调对铜和Cd [19]。

北部污点分析表明,大小为国王杯成绩单(~ 2.5 Kb)不完全对应单个基因长度(每个2.25 Kb)(图6)。这充分表明,成绩单也可以包括各自的copM位于上游的基因的国王杯在每一个警察位点。证实这一假设,co-transcription实验(图完成7)的互补利用RNA提取得到一种文化生长在20毫米铜的存在和使用反向引物组合copA1(图7(一))或copA2(图7 (b))基因序列,分别。PCR扩增进行了通过使用相应的互补dna作为模板和每一对引物躺在相邻基因(copM)。预期的规模的扩增子的存在在每一种情况下表示相邻基因多顺反子使者(图的一部分7)。这些结果清楚地表明美国metallicus每一对情侣的copMA基因表达的转录单位,报道f . acidarmanus和S。solfataricus(18,19]。coexpression基因配对的copMA可能会建议一个协调和相关的函数相应的编码蛋白质。的细菌大肠hirae,metallochaperone CopZ (CopM美国metallicus)满足一个关键的角色在铜内稳态机制(45]。因此,结果表明,这种蛋白质相互作用直接与Cu-ATPase CopB(国王杯美国metallicus),将为后续去除铜。在这种情况下,也许有人会认为,蛋白质CopM1 CopM2美国metallicus有类似的角色来描述吗大肠hirae。此外,定量rt - pcr实验是为了确定的微分表达式警察基因在不同铜浓度。的表达copA1,copA2,copT1和copT2相对于转录水平的测试吗核糖体rna 16 s基因水平没有显著影响以来所有评估条件(数据没有显示)。如图8(一个),copA2和copA1转录水平被发现与此同时随着铜浓度增加出现在媒体。转录水平较高的copA1被认为在所有测试条件相比copA2的水平。copA1转录水平被发现是32.5倍上调相比50毫米铜条件versuscontrol(缺乏金属),而copA2转录水平显示只有17.5倍(图的增量8(一个))。发现Cu-ATPases mRNA水平显著增加对铜离子接触表明,铜流出的交通系统可以操作美国metallicus。

此外,copA2和copA1基因表达时量化美国metallicus种植使用黄铜矿(财经吗₂作为可氧化的底物(图)矿石8(一个))。矿物氧化的微生物生成一个进步的介质中铜离子浓度的增加。找出是否的可溶性铜诱导Cu-ATPases基因的表达、总RNA提取的美国metallicus文化发展到后期指数期,中央财经的1%₂。很明显,一个老年病Cu-ATPases编码基因也发生在美国metallicus是生长在中央财经的存在₂(图8(一个))。copA1转录水平与控制条件相比增加了14倍。在缺乏铜、copA2基因表达增加了7.6倍。而且,通过原子吸收光谱法(AAS)的分析,随着铜离子的总量(铜^{2 +}/铜^{1 +})mM决心出现在中,表明copA2和copA1基因表达是最有可能的铜文化中由于中央财经₂microbial-solubilization。

的发现copA1高度表达相比copA2在所有测试条件提出可能的生理层次之间的两个atp酶当克服铜或Cd的压力。在这方面,通过遗传的方式了美国solfataricus,虽然国王杯是一个有效的铜流出运输车在低和高铜浓度,另Cu-ATPase (CopB)只似乎是低亲和力铜出口atp酶(68年]。此外,通过使用一个m . sedula国王杯删除突变就证明这个应变破坏金属电阻,因此废除黄铜矿氧化(22),强调铜解毒的作用机制在给定bioleaching过程。我们试图显示CopA1和CopA2的功能美国metallicus通过使用大肠杆菌作为一个不同的主机并不成功。显然,这些羊痘疮的超表达毒性的影响大肠杆菌妥协其可行性。虽然基因破坏工具还没有被开发美国metallicus两者的功能作用copTMAlocimight进一步研究跨物种互补的铜敏感美国solfataricus copR突变,因为它被Maezato et al。22]。这将是极大的兴趣建立在未来的研究可能的孤立的假定的转运蛋白的功能美国metallicus。

同样地,定量rt - pcr实验表明copT1转录水平提高与此同时随着铜浓度增加,而copT2显示相对相似的转录水平,最有可能表明组成型表达概要(图8 (b))。此外,而copT1转录水平被发现在财经增加3.6折₂发展文化,copT2水平保持不变与控制相比,在缺乏铜(图8 (b))。获得的结果为美国metallicus copT2与报告基因表达是一致的美国solfataricus。科普特人转录监管机构提出了抑制因子的函数美国solfataricus显示组成型表达,在铜的存在失去亲和力的启动子区域copMA允许的表达这polycistron [19]。相比之下,转录水平的增加copA1和copT1伴随的铜浓度较高的环境中表明假定的转录监管机构CopT1可能通过激活copMA1也许本身(图8)。关于这一点,最近报道,CopR(科普特人美国metallicus)美国solfataricus应变98/2作为催化剂科普特人(copM在美国metallicus),国王杯表达式[69年]。然而,将需要额外的实验来测试这种可能性美国metallicus。

4所示。结束语

我们先前报道,美国metallicus抵制铜浓度极高,介导的使用在某种程度上可能基于无机金属电阻系统多磷酸盐水解,因此铜-流出(15,29日,30.]。这里我们有解决问题是否微生物编码为其他因素可能有助于解释其高重金属耐受性。作为微生物的基因组序列还没有可用的,我们共同使用CODEHOP-PCR和基因组步行方法,建立两个不恒等的同源的发生警察基因座的基因美国metallicus(cop1和cop2)。每一个警察轨迹编码为一个热点转录监管机构(科普特人),一个metal-binding女伴(CopM)和Cu-transporting p型atp酶(国王)。高水平的多顺反子mrnacopMA每一个警察轨迹观察治疗后与铜或Cd,这表明编码atp酶排出重金属为了消除细胞内环境。,先前的报道,这一研究获得的结果允许我们表明,一些关键的元素可能解释铜的高电阻美国metallicus铜电阻的重复吗警察基因,一种防御性反应压力和polyP-based积累机制。的Cd,尽管一些类似的压力反应观察,可比Cu-responsive元素是否也参与Cd反应还有待观察。

利益冲突

作者声明,这项研究是在没有任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

确认

这项工作是支持的批准号FONDECYT 1110214部分和ICM p - 05 - 001 f项目。

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