基因确认Sulfopyruvate脱羧酶的辅酶M生物合成的作用产甲烷球菌属maripaludis

文摘

对甲烷生成辅酶M是一个重要的辅酶。拟议中的生物合成途径由五个步骤组成,其中第四步是由sulfopyruvate催化脱羧酶(ComDE)。破坏的基因来通过转座子突变导致部分辅酶M营养缺陷型,也不缺乏辅酶M和保留不到3%的野生型辅酶M生物合成的水平。在辅酶M,正常生长变异的恢复。此外,互补与野生型的突变来基因反式完全恢复增长缺乏辅酶M .这些结果证实辅酶M生物合成过程中起着重要的作用。无法产生一个完整的CoM营养缺陷型表明,要么转座子插入或未能完全灭活基因m . maripaludis拥有一个滥交的活动部分补充突变。

1。介绍

Hydrogenotrophic产甲烷菌,如产甲烷球菌属maripaludis,拥有专门的新陈代谢。在一个被称为甲烷生成的过程,他们减少CO₂对CH₄使用H₂或甲酸作为电子供体(1]。而其他methanoarchaea可以使用醋酸、甲胺和其他methyl-group-containing化合物(1],辅酶M (CoM),最小的已知的有机辅助因子,作为最后一个甲基载体中扮演着重要角色在所有产甲烷菌(2]。因此,甲烷形成的减少methyl-CoM辅酶B(棒子)作为电子供体methyl-CoM还原酶。的氧化玉米产量与CoM heterodisulfide (CoM-S-S-CoB),这是减少再生的硫醇heterodisulfide还原酶(Hdr) (3]。没有完成生物合成辅酶M存在甲烷,机体不能产生必要的能源增长。

辅酶M (CoM)的生物合成途径Methanocaldococcus jannaschii有机体密切相关m . maripaludis,提出了五个步骤进行。四种酶参与生物合成的CoM的生化特征(7- - - - - -10]。此外,编码这些酶的基因已经被发现在不同的环境,包括m . maripaludis。拟议的CoM的生物合成途径从磺化PEP的磷酸烯醇丙酮酸sulfotransferase(昏迷)。然后,phosphosulfolactate磷酸酶(梳理)水解phosphosulfolactate,和脱氢酶(数控)氧化(Rsulfopyruvate) -sulfolactate中间形式。在第四步中,sulfopyruvate脱羧酶(ComDE)能够催化sulfopyruvate形成sulfoacetaldehyde进行脱羧反应的酶(10]。最后提出一步的CoM生物合成,sulfoacetaldehyde是意向性还原性硫醇盐形成辅酶m .然而,这种酶尚未确定。此外,的基因组甲烷八叠球菌属物种缺失的基因通路的前三个步骤,表明CoM生物合成存在的另一个途径(2]。最后,这个途径的台阶都没有得到证实在活的有机体内该基因的突变。

m . maripaludis可能有能力占据辅酶M的媒介。先前的研究已经确定了辅酶M内的能量依赖性运输系统产甲烷球菌属voltae(11]。因为这些methanococci分享许多代谢和生理功能,我们假设存在于相同的吸收系统m . maripaludis。此外,辅酶米营养缺陷型随机诱变也被孤立m . voltae,但基因位点的突变是不确定12]。

在目前的研究中,辅酶米营养缺陷型的产甲烷archaeonm . maripaludis是由在体外转座子突变转型为基因组紧随其后。这个系统曾用于构造色氨酸营养缺陷型m . maripaludis(6]。选择目标基因来(MMP1689)编码酶的亚基之一sulfoacetaldehyde能够催化sulfopyruvate进行脱羧反应的酶。在基本培养基在缺乏辅酶M,变异越来越差,和正常生长恢复的辅酶M .因此,辅酶M增长刺激但并不是绝对必需的。这些结果证实了进来辅酶M生物合成的作用和能力m . maripaludisCoM。

2。材料和方法

2.1。压力、引物和质粒

压力、引物和质粒在表中做了总结1。设计引物在这项工作都是使用Primer3Plus软件(13]。

酶的蛋白质序列比对sulfopyruvate产烷生物物种之间的脱羧酶,ClustalW2软件从欧洲生物信息学研究所(图1)。物种组成Methanothermobacter thermautotrophicus(NCBI的参考序列O27275),Methanospirillum hungatei(NCBI的参考序列YP504382),甲烷八叠球菌属acetivorans(NCBI的参考序列AAM06668),Methanocaldococcus jannaschii(NCBI的参考序列P58416),和产甲烷球菌属maripaludis(NCBI的参考序列NP988809)。

2.2。生长条件

大肠杆菌是生长在Luria-Bertani介质在37°C。固体培养基的准备,1%琼脂补充道。氨苄青霉素(100μg / mL)和卡那霉素(50μg / mL)补充表示。

产甲烷球菌属maripaludisS2菌株生长在28毫升鲍尔奇管加压与H 275 kPa₂/公司₂(80:20,v / v) 37°C在5毫升的最小(m cn)或复杂(McCV)中减少3毫米半胱氨酸在厌氧条件下如前所述[5]。当表示,McCV补充了3毫米CoM形成McCm介质,和m cn与10毫米醋酸形成McNA补充。在接种之前,3毫米硫化钠是补充道。嘌呤霉素(2.5μ和新霉素(500 g / mL)μ当表示g / mL)被添加。固体培养基的准备,1%琼脂补充道。

干重的文化假设转换因子计算340毫克干重(左)⁻¹文化与OD_600年= 1.0 (14]。

为了避免残留辅酶M污染,本研究中使用的玻璃器皿加热4 - 5小时180°C。对于一些实验,玻璃器皿加热24小时在425°C。

2.3。建设来::Tn5突变

PCR扩增的来遗传区域使用底漆RegcomEF和RegcomER(表执行1),TaqDNA聚合酶(Fermentas)。自行车项目进展如下。3分钟后变性在95°C,以下步骤进行30周期:变性在95°C 30年代,退火在58°C为3分钟,在72°C和扩展为3分钟。最后一个在72°C扩展进行了10分钟。3089个基点放大产品和质粒向量pUC18使用限制性内切酶消化BamHI和XbaI 37°C和结扎90分钟一起使用T4连接酶(新英格兰生物学实验室)25°C为30分钟。由此产生的质粒,pComE(5775个基点),变成了Transformax EC100 electrocompetent细胞电穿孔(中心)的一个2毫米的电极间距试管(2.36 kV)。样本resuspended 1毫升的LB培养基,培养1小时在37°C,和传播磅琼脂板上的存在和没有氨苄青霉素(100μg / mL),以确定转换效率。克隆选择,使用Zyppy质粒提取质粒miniprep工具包(Zymo研究)。筛查,1μ克的质粒是使用以下的限制性内切酶消化(Sph1 / Nde1 / Alwn1和Kpn1 / Nco1(新英格兰生物学实验室))。

的Tn5KAN-2-pac转座子(6使用5′)是PCR扩增磷酸化寡核苷酸ME-Plus9-3′和ME-Plus9-5′(中心)和Phusion高保真DNA聚合酶(新英格兰生物学实验室)。自行车项目进展如下。3分钟后变性在98°C,以下步骤进行30周期:变性在98°C 30年代,60年代退火在55°C, 140年代在72°C扩展。最后一个在72°C扩展进行了10分钟。PCR产物纯化使用DNA清洁和集中器(5)工具包(Zymo研究)和resuspended TE缓冲(10毫米Tris-HCl缓冲区,pH值7.5,1毫米EDTA)。在体外换位是通过孵化80 ng的转座子,200 ng pComE, 1μL (EZ-Tn5转座酶(1 U /μL,震中)后,制造商的指示(中心)。混合物转化为Transformax EC100 electrocompetent细胞(中心)按照制造商的指令进行操作。稀释的混合物被传播到盘子含氨苄青霉素(100μ克/毫升)或卡那霉素(50μg / mL)。孤立kanamycin-resistant殖民地被挑选,生长在肉汤的氨苄青霉素和卡那霉素。质粒提取与转座子插入使用Zyppy质粒miniprep工具包(Zymo研究)。筛选、转座子的插入排序从最后使用底漆KAN-2RP-1out2 [6密歇根大学的DNA测序的核心。两个不同的质粒插入来基因被发现和命名pComET1 pComET2。

转换成m . maripaludis与圆形质粒pComET1和执行pComET2如前所述5]。转换混合物连续稀释,500μL与嘌呤霉素传播McCm琼脂板上补充。孵化后6天在H ~ 150 kPa的存在₂/公司₂(80:20,v / v) 37°C,孤立puromycin-resistant殖民地被选择,多尝试与嘌呤霉素McCm琼脂板上补充。增长后在相同条件下,孤立puromycin-resistant殖民地被转移到图文化管包含5毫升McCm培养基+嘌呤霉素、加压275 kPa,孵化37°C。冷冻股准备McCm中+ 30%甘油(v / v)和悬浮液储存在−80°C。集成的新菌株质粒pComET1 pComET2命名m . maripaludis分别S201和S202(表1)。为了进一步净化突变S201,冷冻股接种在5毫升McCm +嘌呤霉素,加压275 kPa的H₂/公司₂(80:20,v / v),和孵化37°C。细胞悬液连续稀释,镀在血清瓶琼脂偏McCm介质+嘌呤霉素(5]。经过5天的孵化的137 kPa的H₂/公司₂(80:20,v / v) 37°C,孤立puromycin-resistant殖民地文化选择和转移到加塞管包含5毫升McCm培养基+嘌呤霉素。冷冻股准备,和悬浮液储存在−80°C。基因组DNA提取使用ZR真菌/细菌DNA MiniPrep (Zymo研究)。

验证突变的基因型是通过使用两套引物PCR(表1)。第一组由一个正向引物(KAN-2RP-1out2)转座子和反向引物从周围基因MMP1688 (MMP1688R)和转座子插入用于演示。第二组包括正向引物comEF和反向引物来者,野生型的放大来基因。产品使用Phusion高保真PCR扩增DNA聚合酶(新英格兰生物学实验室)。自行车项目两组引物进行如下。1分钟后变性在98°C,以下步骤进行30周期:变性在98°C 15年代,退火30年代在59°C,和扩展30年代的72°C。最后一个在72°C扩展进行了10分钟。PCR产品在1%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色。

确定突变体的表型,~ 1×10⁵突变体和野生型S2细胞接种在5毫升McNA 146年的存在或缺乏μ辅酶的M M .文化是生长在28毫升鲍尔奇管加压与H 275 kPa₂/公司₂90小时没有抗生素。第二个和第三个段落是由接种~ 1×10⁴突变体和野生型S2细胞从之前的细胞悬浮液为5毫升的存在或缺乏McNA 146μ辅酶的M M和孵化为100和480小时在相同条件下,分别。

互补,来基因组DNA的基因PCR扩增m . maripaludis应变S2使用底漆comEexpF和comEexpR(表1)。PCR产品和航天飞机矢量pMEVII消化了NsiI BglII和凝胶纯化。PCR产物的克隆基因,到消化pMEVII取代β-半乳糖和由此产生的质粒,pMEVII -来,变成了S201使用上述PEG-mediated方法没有辅酶M补充中。转换文化上映McCV板块含有新霉素和嘌呤霉素,和互补菌株被任命为S203。突变体的表型S203由接种~ 1×10⁴突变细胞的存在和嘌呤霉素+新霉素的缺失。

3所示。结果

该基因编码而中断在体外与Tn5转座子突变KAN-2-pac转座子(6),编码在methanococci嘌呤霉素抵抗。在第一步中,转座子是随机插入一个包含3089个基点的质粒的染色体区域m . maripaludis窝藏的来基因。两个独立的转座子的插入来硫胺素焦磷酸的下游基因映射绑定域(图1)。野生型来基因在基因组取代transposon-disrupted基因通过同源重组,产生菌株S201 S202,与插入位置336个基点和395个基点从基因的5′开始,分别(图1)。因为插入互相靠近,只有一个的菌株(S201)被选中作进一步鉴定。的基因型突变体由两个独立的PCR扩增(图确认2)。当使用引物扩增来基因,只有野生型菌株显示一个乐队在约600个基点。在这些条件下,突变体不产生一个放大产品,大概是因为的长度和GC含量高pac盒内的转座子阻止放大。相比之下,使用底漆的转座子到年底来预期大小的基因,一个产品被发现的突变而不是野生型菌株。

在基本培养基+醋酸在缺乏辅酶M,突变株S201显示较长的滞后阶段,80年至120年间,h,在对数生长期较慢的增长速度,最大增长低于野生型期间的实验。这种“生病”表型在146年的恢复μM辅酶M .这些结果被观察到即使三段落的移行辅酶米的1.2点,远小于70纳米的浓度增长所必需的m . voltae(图2 (c))[12]。在这些条件下,倍增时间(三个文化意味着±标准差)的S2 McNA介质在缺乏辅酶M和S201 McNA介质中辅酶的缺失和存在M为4.9±0.4,162±2,分别和5.9±0.4小时。观察到的最大增长(意味着±标准差的三个文化)的S2 McNA介质在缺乏辅酶M和S201 McNA介质中辅酶的缺失和存在M为0.53±0.01,0.22±0.03,0.53±0.02毫克干重毫升⁻¹分别的文化。假设辅酶M内容0.43 nmol(毫克干重)⁻¹(15),CoM生物合成必要支持的最低利率观察到的增长率分别为0.06和0.002 nmol(毫克干重h)⁻¹分别为S2和S201表明突变体保留不超过3%的野生型辅酶M生产水平。

因为只有低水平增长,所需CoM玻璃器皿的污染可能负责观察到的增长。测试这种可能性,不同时间和温度的热处理玻璃器皿进行评估(数据未显示)。热处理后干净的玻璃器皿和玻璃器皿故意与CoM“污染”在425°C,温度之前证明,消除小的痕迹CoM (16],突变株的倍增时间S201(意味着±标准差的三个文化)是160±17和165±13个小时,这是类似于突变菌株的生长速率S201第三通道在玻璃器皿热处理4小时180°C。因此,突变体的低数量的增长并不是少量的污染的结果CoM在中。

确认最大增长和增长速度的差异是由于转座子插入,互补菌株S203 pMEVII——是由航天飞机将向量来到S201,基因来所表达的是m . voltae组蛋白启动子(PhmvA)。的反式表达的基因来完全恢复突变体的生长(图3)。

突变菌株的生长S201测试在不同浓度的CoM(图4)。翻倍的突变菌株S201 McNA中补充了146μ1.4米,μ米、250 nM、10 nM, 0.5 nM,以及缺乏辅酶M分别为5.3±0.3,5.3±0.5,7.2±1.0,77±90±11日分别和153±16个小时。浓度的辅酶M / 1.4μ完全恢复野生型增长。相比之下,辅酶M的浓度10 nM时,变异成长不佳。因此,增长的突变体在CoM的缺失严重受损,但CoM不是经济增长的必要条件。支持这一结论增加收益率介质时补充少量的CoM。基于CoM的水平测量整个细胞的0.43 nmol /毫克干重(15),预期的最大增长10 nM CoM的存在是0.023毫克干重毫升⁻¹。然而,观察到的增加增长为0.32±0.01毫克干重毫升⁻¹或14倍(图4)。这些结果证实,突变是低水平的CoM生物合成的能力。

4所示。讨论

部分营养缺陷型辅酶米了m . maripaludis通过基因的破坏来sulfopyruvate脱羧酶,编码β亚基参与第四步的CoM生物合成的途径2]。突变展品受损的增长基本培养基+醋酸,完全恢复的除了辅酶M,表明是重要的生物合成的CoM。这些结果证实,在CoM生物合成中起着重要作用m . maripaludis。

然而,转座子插入的来没有产生一个完整的CoM营养缺陷型,表明m . maripaludis仍然具有一种辅酶M .辅酶M的方式仍是未知的。然而,可能会有三种可能性。硫胺素pyrophosphate-binding域的脱羧活动最重要的保守氨基酸残基被上游的转座子插入。因此,它是可能产生诱变后仍保留足够的活动来支持经济增长缓慢。或者,滥交的酶可能已经取代了CoM sulfopyruvate脱羧酶的生物合成途径。的基因组m . maripaludisS2 MMP0142编码蛋白质,具有28%的序列相似性120 aa的重叠区域。喜欢,这种酶属于硫胺素焦磷酸(TPP)总科和展品嘧啶(PYR)绑定域。可能,MMP0142参与不同的生物合成途径和sulfopyruvate但拥有一些偶然的亲和力。最后一个可能是,m . maripaludis拥有一个未知的替代途径辅酶m .然而,解决这个谜更多实验必须进行。

承认

这项工作是由国立卫生研究院和美国能源部支持。

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