微生物多样性和生物化学势由温泉基因组编码来源于堪察加半岛

文摘

火山地区含有多种环境适合极端微生物。本研究侧重于评估和利用原核两个微生物群落的多样性来源于不同Kamchatkian温泉宏基因组方法。样本取自附近的thermoacidophilic春天Mutnovsky火山和高温的春天Uzon火山口。环境宏基因组分析的DNA被直接从沉积物样品采集分离细胞溶菌作用。原核的社会成分进行检测分析的热点和细菌16 s rRNA基因。总数量1235 16 s rRNA基因序列,得到用于分类划分。最丰富的样本的成员Thaumarchaeota,Thermotogae,变形菌门。Mutnovsky温泉是由地面温泉群,Kosmotoga,Acidithiobacillus。Uzon破火山口是由无教养的杂项Crenarchaeotic小组的成员肠杆菌科。剩下的16 s rRNA基因序列属于Aquificae,Dictyoglomi,Euryarchaeota,Korarchaeota,Thermodesulfobacteria,厚壁菌门和一些潜在的新门。此外,恢复被用于代宏基因组DNA库,随后被开采的基因编码分解脂肪的蛋白水解酶。三个小说基因赋予脂解的和一个基因赋予蛋白水解活动被确定。

1。介绍

火山活动的网站可以找到世界各地甚至海底。火山地区提供各种不同的环境extremophilic古细菌和细菌微生物。著名的例子这种极端环境地面温泉。对地理、物理、环境和化学特征,温泉是独一无二的网站extremophilic微生物(1- - - - - -3]。极端微生物存在于温泉的近亲被认为是地球上最早的生命形式(4,5]。因此,这些弹簧提供洞察生命的起源和演化。此外,嗜热菌和超嗜热菌产生多种水解酶如脂酶、糖苷酶、肽酶等生物分子,工业感兴趣(6- - - - - -8]。例如,Hotta et al。9)发现了一个非常稳定的羧酸酯酶在hyperthermophilic archaeonPyrobaculum calidifontisVA1, Arpigny et al。10)中分离出一种新型耐热分解脂肪的酶硫化叶菌acidocaldariusDSM 639。

特别是在极端环境中,大多数微生物不愿cultivation-based方法(11,12]。因此,文化无关宏基因组策略是很有前途的方法来评估系统组成和功能的潜力在极端环境中微生物群落的生活(7,13,14]。例如,西蒙等人研究了原核在冰川冰社区,发现一个高度多样化的细菌社区(15]。1998年,Hugenholtz et al。1)调查了黑曜石池中细菌多样性在黄石国家公园和识别几个新的细菌候选人分裂。相同的池和两人进行了研究后,Meyer-Dombard et al。16]。他们遇到不同的细菌和古细菌社区在所有三个温泉。

在目前的研究中,我们调查了两个微生物群落的系统组成和代谢潜力来自两种极端网站的堪察加半岛,位于俄罗斯的远东地区。堪察加半岛由大约472300公里的一个领域²和描述土地的火第一个探险者由于高密度的火山和火山现象有关。例如,北半球最大的活火山,Klyuchevskaya火山,位于堪察加半岛。沉积物样品分析在这项研究中被从两个温泉提供thermoacidophilic (70°C, pH3.5-4)或高温(81°C, ph7.2 - 7.4)环境。原核的构成社区的两个Kamchatkian温泉被16 s rRNA基因分析评估。此外,宏基因组库生成和新型生物催化剂的筛选。

2。材料和方法

2.1。抽样和DNA提取

两个沉积物样品从温泉位于堪察加半岛在2001年夏天。第一个样本来自thermoacidophilic春(70°C, pH3.5-4) Mutnovsky火山(52.453 N, 158.195 E)。第二个样本来自春天高温(81°C, pH值7.2 - -7.4)在Uzon火山口(54.5 N, 159.967 E)。两个沉积物样品的化学分析如表所示1。

DNA提取描述周et al ., 199617]。回收DNA的浓度是量化使用NanoDrop nd - 1000分光光度计(PEQLAB,埃朗根,德国)。

2.2。16 s rRNA基因的扩增和代克隆库

评估原核的社区结构,古细菌和细菌16 s rRNA基因扩增的PCR和分析。PCR反应混合物(50μL)包含2.5μL(10倍Mg-freeTaq聚合酶缓冲区,200μ米的四个deoxynucleoside三磷酸腺苷,1.75毫米MgCl₂,0.4μ每个引物的M, 1 UTaqDNA聚合酶(Fermentas、圣Leon-Rot、德国),大约25 ng回收DNA作为模板。原核基因16 s rRNA放大了以下组引物:8 f 5′-AGAGTTTGATCMTGGC-3′(18)和1114 r 5′-GGGTTGCGCTCGTTRC-3′(19),A800F 5′-GTAGTCCYGGCYGTAAAC-3′(20.)和A1530R 5′-GGAGGTGATCCAGCCG-3′(21),Arch8F 5′-TCCGGTTGATCCTGCCGG-3′(15)和Arch958R 5′-YCCGGCGTTGAMTCCAATT-3′(22]。下面的热循环使用方案:初始变性在94°C 2分钟,25周期的变性在94°C 1.5分钟,退火在56°C (1114 f和r), 51°C (A800F和A1530R),或55°C (Arch8F和958 r),紧随其后的是扩展在72°C(1分钟1 kb)。最后在72°C扩展进行了10分钟。消极的控制是由使用反应混合物没有模板。获得的PCR产品纯化使用向导SV凝胶和PCR清理系统(美国麦迪逊Promega)和随后克隆成pCR2.1-TOPO推荐的制造商(美国卡尔斯巴德表达载体)。由此产生的重组质粒被用来变换大肠杆菌十大细胞。总共有1271 insert-carrying质粒从随机选择被孤立大肠杆菌克隆。插入序列是由哥廷根基因组学实验室(德国哥廷根)。

2.3。16 s rRNA基因的分析

评估原核生物的群落结构、检索使用QIIME [16 s rRNA基因序列进行分析23]。获得的16 s基因序列编辑使用gap4 [24),最初检查嵌合序列的存在使用野鸭[25],柏勒罗丰[26],嵌合体检查(27]。剩余序列集群采用UCLUST算法(28和以下QIIME脚本:pick_otus。py和pick_rep_set.py。序列是集中在操作分类单元(辣子鸡)1,3,20%基因不同。

原核系统组成的社区在这两个样品确定使用QIIME assign_taxonomy。py脚本。一个爆炸对齐29日)在最近的席尔瓦ARB数据库(30.]。序列的分类分类对他们最好在ARB数据库。最后,OTU表生成。稀疏曲线,香农指数(31日),和Chao1指数(32计算采用QIIME。此外,辣子鸡的最大数量估计为每个示例使用Michaelis-Menten-fitα多样性指标包括在QIIME软件包。

遗传距离每OTU一个序列(1%)被进一步用于建设的系统发育树。序列导入到最近四Ref席尔瓦ARB的数据库程序包(33]。多重序列比对是手动检查和改进采用ARB编辑器工具。系统发育树是由使用ARB的最大精简算法的实现。获得树拓扑结构的鲁棒性是通过引导分析评估与100类似。

2.4。在宏基因组库的建设

利用生化潜力,宏基因组在库生成。由于低DNA复苏,这些库的生成起始物料是通过多个位移放大采用GenomiPhi V2 DNA扩增工具包(通用电气医疗集团,慕尼黑,德国)。提高克隆效率,超支化结构解析和DNA插入pCR-XL-TOPO(表达载体)所描述的西蒙et al。34]。通过这种方式,两个宏基因组库生成。

2.5。筛查水解活动和相应的基因的识别

构建宏基因组库筛选基因赋予分解脂肪的或使用功能驱动蛋白水解活性的方法。建库是用来变换大肠杆菌DH5α细胞。重组细胞被镀上磅琼脂板包含1%三丁酸甘油酯(分解脂肪的活动)35)或2%脱脂牛奶(蛋白水解活性)36]。盘子在37°C孵化长达两周。水解活动是由晕的形成。确定protease-producing克隆的底物特异性,脱脂牛奶替代0.3% (w / v) azocasein, azoalbumin或elastin-Congo红色。插入序列的重组质粒来源于积极的克隆是由哥廷根基因组学实验室。检索到的插入序列编辑采用gap4 [24),假定的orf注释使用阿耳特弥斯(11.0版)(37]。

2.6。克隆的基因赋予分解脂肪的或蛋白水解活性相应基因的表达载体和净化产品

对酶分解脂肪的蛋白质的生产,确定基因克隆到pET101-TOPO根据冠军pET101定向威尼斯平底渔船表达工具(表达载体)。通过这种方式,他的序列编码₆标记和添加了V5提供的抗原决定基向量的3′端编码区域。选择起始密码子被ATG取代。大肠杆菌恒星BL21 (DE3)(英杰公司)是用作酶大量生产。执行生产制造商推荐的。随后,重组细胞被离心收获,用三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗净(30毫米,pH值8.0),和resuspended 50更易与L⁻¹磷酸钠缓冲区包含0 3摩尔L⁻¹氯化钠(pH值8.0)。这些细胞被破坏采用法国媒体(1.38×10⁸Pa)。随后,提取是通过离心14000 g和4°C 45分钟。上层清液用作源为可溶性蛋白质。重组蛋白在纯化使用Protino Ni-TED 2000包装列(Macherey-Nagel、Duren、德国)推荐的制造商。蛋白质制剂透析使用钠磷酸盐缓冲剂(50毫米,pH值7.5)去除残余咪唑。蛋白质纯化样品的浓度确定Roti-Quant(卡尔罗斯,卡尔斯鲁厄,德国)按照制造商的建议。分析了蛋白质的纯度准备根据Laemmli SDS-polyacrylamide凝胶电泳(38]。

对蛋白质生产的假定的蛋白酶,相应的基因(pepBW1)被克隆到pBAD / Myc-His(英杰公司)使用修改后的融合方法39]。基因在两个PCR反应放大后两组引物对含有合成网站克隆到向量(下划线):对1 5′-CATGGTGTTCAATAAATATGTCTT-3′, 5′-CTAGGGTAGACTTAACGC-3′和2 5′-GTGTTCAATAAATATGTCTTATT-3′, 5′-CGCTAGGGTAGACTTAACGC-3′。混合后,变性、杂交,形成四种不同的杂交产品哪一个悬臂包含向量消化的互补以区域我(Fermentas)和Bsp119年我(Fermentas)。preligation混合物(10μL)包含1μL o缓冲区(Fermentas)和大约50 ng的PCR产物。悬臂来创建适当的克隆,以下使用热循环方案:变性在95°C 3分钟,4再次退火周期为2分钟65°C,和再次退火25°C,持续15分钟。结扎反应混合物(20μL)包含了preligation混合物,1μL o缓冲区(Fermentas), 1μL ATP(10毫米),1 U的T4 DNA连接酶,和10 ng pBAD / Myc-His消化以区域我和Bsp119我。的反应是孵化16°C在一夜之间灭活通过加热10分钟的65°C。结果重组质粒被用于转换大肠杆菌十大细胞。

2.7。分解脂肪的活动的描述

测定酶特异性针对不同triacylglycerides由日益增长的决定大肠杆菌BL21 (DE3)窝藏磅的重组质粒琼脂板包含triacylglycerides具有不同链长(C18 C4)。盘子和IPTG补充到最后0.1毫米的浓度诱导基因表达。

定量分析,p-nitrophenyl酯与不同链长度被用作提出Rashamuse et al。40]。常规的酯酶活性测定是由测量的释放p硝基酚的p-nitrophenyl (pnp)酯410海里使用卡里100紫外可见分光光度计(美国瓦里安,帕洛阿尔托)和珀尔帖效应的温度控制器。除非另有描述,酶活性测定在Tris-HCl 50°C(50更易与L⁻¹;pH值7.5)pnp辛酸盐(1更易与L⁻¹;溶解在丙胺)作为衬底。pnp辛酸盐被用作基质标准试验由于其高温稳定性和碱性pH值。酶活性的EstBW2决心pnp丁酸作为酶与其他基板测试都没有活动。因此,EstBW2没有测量温度和pH值的依赖关系超过75°C和pH值8。所有测量进行了一式三份。

确定底物特异性,酶活性测定采用以下标准试验条件pnp酯各种链长度:pnp醋酸(C2),pnp丁酸(C4),pnp辛酸盐(C8),pnp癸酸盐(C10),pnp月桂酸盐(C12)pnp棕榈酸酯(C16)。

酶活性对温度的依赖关系是决定在标准试验条件下20到95°C。补偿温度对pH值的影响,缓冲区被预热设定点温度和调整使用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(50更易与L⁻¹)。热稳定性是衡量孵化酶在不同时期在不同的温度下。在标准试验条件下酶活性被测定。最佳pH值在标准试验条件下酶活性测定采用不同的重叠缓冲解决方案(50毫米):醋酸钠缓冲(pH值4和5),钠磷酸盐缓冲剂(pH值5、6和7),Tris-HCl (pH值7,8,9);痒(pH值9和10),和帽子(pH值10和11)。

不同的洗涤剂对酶活性的影响是由在标准试验条件下1毫米AgNO的存在₃1毫米CaCl₂1毫米CoCl₂1毫米cetyltrimethylammonium溴铵(CTAB), 1毫米CuCl₂1毫米的乙二胺四乙酸(EDTA), 1毫米FeCl₃MgCl 1毫米氯化钾1毫米₂1毫米MnCl₂你,生理盐水1毫米,1毫米₄1毫米的十二烷基硫酸钠(SDS), 1毫米ZnCl₂80年,0.01% (v / v)渐变,或0.01% (v / v) 2-Mercaptoethanol。恢复的丝氨酸依赖分解脂肪的酶被验证在标准试验条件下孵化的1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF)。此外,我们分析的意义决定对酶活性的影响。随着酶测试进行了一式三份,我们假设测量酶活性都是正态分布。方差同质性测试使用F以及,洗涤剂的意义影响随后与学生的测试t以及(同质方差)或韦尔奇t测试(异构方差)。所有统计分析R(41]。

2.8。加入核苷酸序列号码

16 s rRNA基因序列已经沉积在基因库HM149792-HM150618加入数字。核苷酸序列的四个基因已经被识别沉积在基因库加入数字HM063743 (plpBW1) HM063744 (estBW1) HM063745 (estBW2)和HM063746 (pepBW1)。

3所示。结果

3.1。采样和研究沉积物的化学性质

从两个Kamchatkian温泉沉积物样品采集。弹簧是位于Mutnovsky火山附近(Mutnovsky样品)和Uzon火山口(Uzon样本),这代表thermoacidophilic (70°C, pH值3.5 4)和高温(81°C, pH值7.2 - -7.4)环境,分别。研究沉积物都是化学不同于对方(表1)。Mutnovsky样本中包含更高,Ca,有限公司铜、铁、铅、锌浓度比Uzon样本。因为,B,英航,钾、锰、钠浓度,相反的记录。铬的浓度、镁、镍、Sr, P, Ti, V和总有机碳含量几乎相同的样本。

3.2。隔离的宏基因组DNA和宏基因组库的建设

评估原核和代谢多样性潜在的宏基因组方法,环境样品DNA提取。大约2.7μ每10 g g DNA样品沉积物被找回。清除余下的盐后,古细菌和细菌16 s rRNA从纯化的DNA基因放大。结果PCR产品被用于生成16 s rRNA基因库。总共有1271个克隆测序从这些库。质量过滤和清除潜在的嵌合序列后,1235年取得了高质量的16 s rRNA基因序列(536 Mutnovsky样本,699 Uzon样本)。两样本的DNA也用于构建宏基因组库。Mutnovsky库包含大约479000个质粒平均插入5.3 kb大小。insert-carrying质粒的比例是74%。Uzon图书馆由大约117000个质粒的平均插入大小为4 kb。insert-carrying质粒的比例是85%。 In summary, the generated small-insert metagenomic libraries harbored approximately 2.27 Gbp of cloned environmental DNA.

3.3。古细菌群落结构

我们能够分配265 16 s rRNA两样本基因序列域古生菌。隶属于四个不同的古细菌类群的分类序列(图1)。的Thaumarchaeota是最丰富的古门在两个样本(57%和68%的序列、职责)。大部分的序列是隶属于杂项Crenarchaeotic群现在属于最近提议Thaumarchaeota(37%)。另一个丰富thaumarchaeotic组是陆地温泉组(24.7%)。大多数其余Mutnovsky样本序列附属于没有文化的成员Euryarchaeota(34.7%),只有在这个样本中发现。大多数其余Uzon序列属于Crenarchaeota(32.1%)。序列是隶属于已知属等Sulfophobococcus(12.1%),Thermofilum(6.8%),Ignisphaera(5.3%)和Desulfurococcus kamchatkensis(4.2%)。古细菌的门Korarchaeota只有Uzon样本中确认(1)序列。

3.4。多样性和物种丰富度的热点社区

确定古细菌多样性和丰富性,稀疏与QIIME分析。观察到OTU数字Mutnovsky样本和Uzon样本33和13(1%遗传距离),25 - 11(3%遗传距离)和7和5(遗传距离20%),分别为(表2)。集群的最大能预期的数量对样品确定基于Michaelis-Menten_fit指标。平均超过90%的覆盖了整个古社区调查工作。香农指数Mutnovsky和Uzon样本分别为1.83和2.96(1%遗传距离),2.70和1.83(3%遗传距离)和0.86和1.87(遗传距离20%),分别为。这些表示低古细菌多样性的研究样本。比较稀疏的分析辣子鸡的数量取决于Chao1丰富估计表明,遗传距离在1和3%,稀疏曲线几乎是饱和(图4)。因此,大多数的估计恢复了丰富(表测量工作2)。

3.5。细菌群落结构

我们能够分配271序列Mutnovsky和434年序列Uzon样本到域细菌。分类序列是隶属于三、八个不同的细菌类群和候选人分裂Mutnovsky样本和Uzon样本,分别(图1)。的Thermotogae是最丰富的细菌门Mutnovsky样本(54%)。这个门是几乎没有Uzon样本(1%)。有趣的是,所有序列Mutnovsky样本进一步隶属于无教养的属的成员Kosmotoga。这属完全缺席Uzon火山口。的变形菌门第二个最丰富的门在Mutnovsky样品(39%)和最丰富的一个Uzon火山口样例(62%)。大多数这些序列被进一步分配Acidithiobacillus caldus写明ATCC 51756 (28%) Mutnovsky样本内和不同属Enterobacteriacaeae(41%),Uzon样本。的Aquificae第三个最丰富的门在Uzon样本(13.4%)。被分配到相应的序列Sulfurihydrogenibium rodmanii(9.7%)和Thermosulfidibacter takaii(2.8%)和未受教育的成员Aquificae。另一个丰富的细菌门Thermodesulfobacteria(12.9%)。所有的序列属于属Caldimicrobium。剩下的序列是隶属于Dictyoglomus thermophilum和Dictyoglomus turgidum的Dictyoglomi(6.5%)、Candiate部门OP9 (2.1%)厚壁菌门(0.9%),和候选人部门KB1 (0.2%)。

3.6。细菌社区的多样性和物种丰富度

观察到OTU数字在温泉都是17岁,50(1%遗传距离)、12和42(3%遗传距离)和10和11(20%遗传距离)Mutnovsky样本和Uzon样本,分别(表2)。分析集群的最大能预期的数量表明,超过94%的整个细菌社区恢复了测量工作。相应地,稀疏的比较分析与辣子鸡的数量取决于Chao1丰富估计量显示为1%,3%,和20%的遗传距离,稀疏曲线几乎是饱和(表2,图4)。

3.7。宏基因组库的筛选

两个生成的宏基因组库是用于基于函数的筛选确定小说分解脂肪的蛋白水解酶。三个新基因编码分解脂肪的酶(plpBW1,estBW1,estBW2)和一个基因编码的蛋白水解酶(pepBW1)被确定在宏基因组筛选来自Uzon样本。宏基因组内没有水解酶识别来自Mutnovsky样本。

所有确定的近亲蛋白质序列来自已知的嗜热微生物。他们相似但一个个假定的基因产物来源于Desulfurococcus kamchatkensis(PepBW1),Sulfurihydrogenibium azorense(PlpBW1和EstBW2)Thermobaculum terrenum(EstBW1)(表3)。

PlpBW1隶属于patatin-like蛋白(PLPs)。四个保守域描述这种酶类型(42),都可以被确认在氨基酸序列(数据没有显示)。有趣的是,PLPs不具备催化三分子。赋予的分解脂肪的活动是催化丝氨酸残基形成二分体的,天冬氨酸残基(42]。EstBW1和EstBW2附属于家庭V(分解脂肪的酶的分类系统Arpigny和Jaeger43]。PepBW1分类采用MEROPS数据库(44]。它是附属于枯草杆菌蛋白酶家族(家庭S8)。有趣的是,pepBW1基因序列几乎相同的假定的基因编码的丝氨酸肽酶Desulfurococcus kamchatkiensis(表3);Desulfurococcus kamchatkiensis属于Crenarchaeota并从温泉也被孤立在Uzon火山口(45]。此外,16 s rRNA基因序列的物种被发现在我们的16 s Uzon样本分析。

3.8。重组酶的特性

描述所有重组蛋白,脂解的和蛋白水解活性的基因克隆到表达载体。的重组大肠杆菌包含PepBW1应变测试对不同蛋白质和显示蛋白水解活性与脱脂牛奶和elastin-Congo红色而不是azoalbumin或azocasein。

重组的活动对不同triacylglycerides分解脂肪的蛋白质进行了测试。一切以三丁酸甘油酯为底物蛋白质显示活动。此外,与长链triacylglycerides PlpBW1显示活动,含量;(C14)。水解的不同p-nitrophenyl酯用于进一步分析底物特异性(图5(一个))。PlpBW1 EstBW1显示,最高的活动pnp乙酸和p分别np丁酸。这两种酶表现出对所有的测试活动pnp酯,除了pnp棕榈酸酯。活动随链长增加而降低。相比之下,EstBW2只显示活动pnp丁酸。具体的活动在标准试验条件下使用的最佳基质U /毫克(PlpBW1),U /毫克(EstBW1)U /毫克(EstBW2)。根据结果,所有三个分解脂肪的酶是最有可能的羧酸酯酶和脂酶。

分解脂肪的酶都是活跃在宽的温度范围内。PlpBW1、EstBW1 EstBW2保留至少50%的活动从60到90°C, 65到95°C,分别和40到75°C(图5 (b))。最大活动记录在85°C, PlpBW1 EstBW1在90°C, EstBW2在65°C。我们进一步确定三个稳定的分解脂肪的酶对不同的温度。PlpBW1的半衰期是45分钟在70°C, 15分钟在80°C, 5分钟在90°C。EstBW1展出半衰期5 h在70°C, 2.5在80°C, h,非凡的半衰期为15分钟在90°C。EstBW2不稳定在90°C(7分钟半数居住),但活动几乎是不受5 h(孵化在70°C和80°C(数据没有显示)。

pH值影响酶活性测定在pH值从4到11(图5 (c))。所有酶表现出高活动在中性或碱性pH值。最大的活动是决定在酸碱10 (PlpBW1)和7 (EstBW1和EstBW2)。

添加EDTA,氯化钾、氯化钠反应混合物对酶活性没有显著的影响(),而所有其他测试洗涤剂表现出影响的活动至少有一个恢复的酶(表4)。CTAB,二层80,ZnCl₂显著影响这三种酶的活动。PlpBW1显示高出2.5倍活动在CTAB的存在,而EstBW1和EstBW2显示损失的活动。渐变80 PlpBW1酶活性的增加和EstBW2 EstBW1但不是。添加ZnCl₂减少三个重组酶的活性。EstBW1分解脂肪的活动和EstBW2 phenylmethylsulfonyl氟化物被完全抑制,表明存在丝氨酸残基的酶的活性位点。有趣的是,PlpBW1并不受PMSF的活动。

4所示。讨论

4.1。原核社区Kamchatkian弹簧组成

宏基因组研究的数量已经在过去的几年中迅速上升。宏基因组已经被用来评估和利用生物多样性的栖息地包括极端微生物的环境(1,15,16,46,47]。在这项研究中,我们调查了原核生物的多样性两个温泉位于堪察加半岛。我们发现不同的细菌和古细菌社区网站,由变形菌门,Thermotogae,Thaumarchaeota。

杰克逊et al。(2001)研究了垫由诺里斯间歇泉盆地,酸性温泉在黄石国家公园(46]。他们发现社区模式相媲美,在Mutnovsky样本有一个区别。他们不能够识别Thaumarchaeota,这并不令人感到意外,因为作为这门在2008年被首次提出48]。这个门的成员并不局限于最初称为嗜中温嗜热的栖息地Crenarchaeota(48- - - - - -50]。Meyer-Dombard et al .(2005)的一项研究调查了三个温泉的原核社区黄石国家公园(森林之春、野牛池和黑曜石池)(16]。而另一个池,而中性环境,森林之春低pH值为5。然而,这种酸性春天的原核生物的群落结构不同酸性Mutnovsky春季样品中发现。Meyer-Dombard等人发现了Crenarchaeota作为最丰富的古细菌群体,而Thaumarchaeota我们的研究是最丰富的。最近的一项研究对原核的社区组成的温泉在青藏高原还发现Thaumarchaeota作为主要热点集团(48]。

Uzon样本的分析揭示了更多样的原核的社区比Mutnovsky样本。只有两个辣子鸡1%遗传距离是共享的,而所有其他的辣子鸡是独一无二的每个样本(数据2和3)。观察到不同的社区组成两个采样之间的网站可能是由于不同的温度和pH值的网站。然而,黄et al。(2011)没有发现温度之间的统计相关性和多样性48]。

尽管地理位置分离,黑曜石游泳池和Uzon火山温泉共享一个群落结构非常相似,几乎相同的占主导地位的古细菌和细菌组确认16]。此外,一些罕见的动物门出现在这两个样本,即Korarchaeota。这门是一种相对较新的门谷仓等人于1996年第一次描述了(51]。另一个罕见的细菌群体中发现的这两个样品是OP9候选人分裂。这些结果证实的假设提出了另一个极端的环境相似的环境条件导致相似的微生物群(15]。

4.2。水解酶

在目前的研究中,我们能够识别三个小说分解脂肪的酶和蛋白水解酶。确定最优的温度和pH值反映了DNA样本用于隔离的环境条件,表明环境形状的特征酶。相应地,分解脂肪的酶特征(PlpBW1、EstBW1 EstBW2)显示特性类似于其他metagenome-derived酯酶,确定高温网站。Rhee et al。(2005)确定了高温酯酶在宏基因组DNA库生成的温泉和泥洞(52]。酶活性从30到95°C和展示一个最优的pH值约为6.0。Tirawongsaroj et al。(2008)筛选宏基因组库来自泰国温泉和确定了两个小说分解脂肪的酶,其中一个还认为patatin-like蛋白(53]。据我们所知,PlpBW1是第二个报道patatin-like蛋白质来自温泉宏基因组到目前为止(53]。与大多数其他分解脂肪的酶活性部位含有丝氨酸残基,PlpBW1抑制剂PMSF[不是灭活的51,54]。锌的作用^{2 +}离子记录所有重组酶研究在这项研究中还提到了酯酶研究楚et al。54]。他们也记录活动的减少锌的存在^{2 +}离子。恢复分解脂肪的酶的活动是积极的还是消极的影响的CTAB或渐变80(表4)。这些洗涤剂已被证明可以促进分解脂肪的酶或减少活动形成的胶束聚合单体,然后与疏水部分的酶(55]。

除了酯酶,宏基因组库还在开采蛋白水解活性。PepBW1丝氨酸肽酶识别,是第一个metagenome-derived肽酶从高温环境。PepBW1来源于一个古细菌生物,它说明筛选不同的主机可以成功,即使目标基因来源于一个不同的生活领域56]。

4.3。生态学的温泉

由于大多数研究生态学的温泉都是针对原核生物的多样性,例如,通过16 s rRNA基因或其他标志基因分析,所知甚少在全球这些extremophilic社区的重要性。伯吉斯et al。(2011)研究了两个热池Uzon破火山口的16 S rRNA基因分析和相关的一些社区成员不同的古细菌和细菌群体,这可能在循环中发挥作用的C、N和S (57]。

的至关重要的作用古生菌在N₂固定和良好的脱氮58]。的第一步硝化氧化铵,最初被认为是限制一些变形菌门(59]。然而,最近的宏基因组研究提供了证据古生菌能够氧化铵硝酸盐(58,59]。直到最近,产甲烷Euryarchaeota被认为是唯一的古集团全球相关元素的循环。这改变了推定ammonia-oxidizing古生菌的发现60),隶属于最近提出的门Thaumarchaeota。这个门的成员大大加剧全球N周期,作为他们的丰度高、极低的衬底阈值为主导作用提供了强有力的证据氨氧化剂在开放的海洋60]。在我们的研究中,我们确定了不同thaumarchael组在两个沉积物样品调查。因此,温泉也扮演了重要的角色在全球氮循环。

确认

作者感谢乔安娜s Potekhina博士从伏尔加河流域的生态研究所,(Togliatti俄罗斯科学院,俄罗斯)提供环境样本。这项工作得到了Bundesministerium毛皮陶冶和大幅减退(BMBF)。

引用

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