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古生菌
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古生菌/2012年/文章
特殊的问题

古生菌在过去和现在Geobiochemical过程和元素周期

把这个特殊的问题

研究文章|开放获取

体积 2012年 |文章的ID 940159年 | https://doi.org/10.1155/2012/940159

阿尔玛Siggins, anne - marie Enright,佛罗伦萨亚伯兰,凯瑟琳敲竹杠,文森特O 'Flaherty, ”影响三氯乙烯接触微生物多样性和蛋白表达在厌氧颗粒生物质37°C和15°C”,古生菌, 卷。2012年, 文章的ID940159年, 13 页面, 2012年。 https://doi.org/10.1155/2012/940159

影响三氯乙烯接触微生物多样性和蛋白表达在厌氧颗粒生物质37°C和15°C

阿尔玛Siggins,1 安妮玛丽恩莱特,1 弗洛伦斯亚伯兰,2 凯瑟琳敲竹杠,3 和 文森特·O 'Flaherty1

1微生物生态学实验室、微生物学、自然科学学院,国立大学的爱尔兰,爱尔兰高威

2功能环境微生物学、微生物学、自然科学学院,国立大学的爱尔兰,爱尔兰高威

3BSRC质谱设备,圣安德鲁斯大学,圣安德鲁斯KY16 9ST,英国

学术编辑器:迈克尔Hoppert
收到了 2012年7月13日
接受 2012年9月14日
发表 2012年11月08

文摘

颗粒从实验室规模生物质厌氧生物反应器试验分析来识别微生物群落结构和功能的改变在反应温度和三氯乙烯(TCE)。两个生物反应器在37°C,而两人在15°C。抽样时,每个温度对生物反应器被曝光过程failure-inducing TCE浓度(60毫克L−1),而另一个作为TCE-free控制。细菌群落结构调查使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)和16 s rRNA基因克隆库分析。温度被确定作为细菌群落组成的一个重要因素,而细微的差别与三氯乙烯的补充。变形菌门的主要门所有生物反应器,而克隆库分析显示更高比例的拟杆菌门,Chloroflexi和Firmicutes-like克隆15°C比37°C。比较宏蛋白质组学的存在和缺乏TCE是由二维凝胶电泳(2-DGE)和28个蛋白质斑点,假定的功能相关的细胞过程,包括甲烷生成、糖酵解,乙醛酸循环和甲基丙二酰基通路。metaproteomic物种之间一个好的协议转让和系统发育信息观察,10的识别与门变形菌门的成员相关的蛋白质。

1。介绍

厌氧消化(广告)是一个连续的合作微生物的过程,用于废物和废水的工程生态系统治疗和用生物质生产的沼气和有机残留物(1]。低温操作实验室规模的厌氧消化器已被证明可行的具有成本效益的替代传统嗜中温操作温度范围广泛的污水类型(2,3]。应用温度范围,广告依赖于各种微生物的适当组合;复杂syntrophic古细菌和细菌物种之间的相互作用是至关重要的完全降解有机化合物甲烷(4]。在过去的二十年里,参与低温微生物群落的性质广告受到更严格的监督,与承认更大的潜力和局限性的理解微生物协会可以帮助过程的最优化。例如,Enright et al。5]表明,转变产甲烷群落结构观察到末端限制性片段长度多态性(TRFLP)与hydrogenotrophic活动增加,而Bialek et al。6)使用统计分析(移动窗口/非度量多维标度)定量聚合酶链反应(qPCR)数据想象的变化可以归因于生物反应器的产甲烷社区配置。这两个研究,传统的微生物群落的调查基础厌氧消化的过程,集中在产甲烷菌,一群厌氧乙酸古生菌参与的转换和氢甲烷(7]。低生物多样性与广告促进了产甲烷菌的生成功能和根据产甲烷社区中信息结构(8]。

我们以前记录的响应社区内厌氧产甲烷颗粒生物质的三氯乙烯(TCE);(9])。TCE是一种潜在的致癌和致突变的化合物(10),这是通常用于清洁和金属脱脂行业,并且可以完全由厌氧消化的过程[dechlorinated11]。我们之前的研究(9)调查的影响入渗TCE浓度膨胀颗粒污泥床生物反应器的稳定运行在37°C和15°C。为了研究观察到的减少操作性能指出在温度响应的入渗TCE浓度60毫克L−1,具体产甲烷活性(SMA)和毒性批化验,除了qPCR产甲烷社区的分析,是进行(9]。我们确定产甲烷社区对TCE的变化并不足以导致观察到的过程失败,而颞抽样显示,温度变化导致更高的人口结构对产甲烷的影响(9]。特定的产甲烷活性和毒性试验表明,acetoclastic可逆地抑制了产甲烷菌的存在TCE和/或其降解衍生品,而竞争的脱氯生物可能有限的可用性氢hydrogenotrophic甲烷生成(9]。虽然我们的研究(9)解决古细菌的反应社会TCE的存在,没有变化,可以明确占生物反应器失败TCE浓度被确定。结论与研究是基于代谢组而不是特定的生物,和结果之间的差异的分子和生理数据观察(9]。因此,本研究试图进一步调查的结构响应细菌域,和整个微生物群落的功能反应。

这项研究调查了TCE对细菌群落结构的影响(使用DGGE和16 s rRNA克隆库)和微生物群落功能(使用基于2-DGE宏蛋白质组学)在广告生物反应器操作在37°C和15°C。

2。材料和方法

2.1。生物质来源

厌氧颗粒污泥来自四个膨胀颗粒污泥床(EGSB)生物反应器进行了研究。所有生物反应器(R1-R4)是利用治疗的挥发性脂肪酸(VFA)的废水。R1和R2在37°C,而R3和R4在15°C,浓度增加与R1、R3补充三氯乙烯(TCE;60毫克L−1)。准备的影响是存储在一个封闭的系统,以防止TCE的挥发;充氮气体袋是用来平衡压力的影响从储存容器注入生物反应器。生物反应器试验和相关性能数据详细介绍Siggins et al。9]。生物量从生物反应器采样235天,当入渗TCE浓度R1、R3 60毫克L−1。

2.2。挥发性脂肪酸(VFA)的分析

VFA浓度废水样品的分析从R1-R4收集整个审判是由加热(85°C)和激动顶部空间,在瓦里安2000年土星GC / MS系统中,与CombiPAL autosampler(瓦里安公司,核桃溪市,CA)。瓦里安毛细管柱进行分离,CP-WAX 58 (FFAP) CB(内部直径25米长×0.32毫米×0.2μ膜厚度,瓦里安)。喷油器成交2毫升和喷油器温度维持在250°C。氦受雇为载气,1毫升的流量最小−1。温度程序如下:50°C(20岁)到110°C(20岁)2°C的速度最小−1;从110°C到200°C(20岁)的速度20°C min−1。MS-detector在扫描模式在40 - 150 z的范围−1在温度为210°C。vfa的识别是通过匹配标准化合物的色谱保留时间和光谱(乙酸、丁酸和propionic-acids)。校准曲线的标准建立了vfa,用于相对vfa浓度污水顶空样品,表示为毫克L−1。

2.3。特定的产甲烷活性(SMA)测试

生物样本筛查代谢能力使用特定产甲烷活性(SMA)测试。这些都是使用压力传感器技术(执行12,13),丙酸(30毫米),丁酸(15毫米)和乙醇(30毫米)被用作基质试验间接甲烷生成。所有化验包含2 - 5 g挥发性悬浮固体(VSS) L−1在一式三份,进行生物反应器操作温度(R1和R2 37°C;R3和R4 15°C)。瓶没有任何衬底被用作控制。

2.4。基因组DNA的提取

总基因组DNA提取重复使用一个自动化从四种生物质样品核酸提取器(Magtration 12 gc, PSS有限公司千叶,日本)。颗粒生物质使用迫击炮和杵碎,精致和re-suspended 1 x磷酸缓冲盐的比率1:4 w / v。一个100μL整除的生物质悬挂是加载/提取。中提取DNA在100年被筛选了μL Tris-HCl缓冲区(pH值8.0)和存储在−20°C。

2.5。克隆库16 s rRNA基因的分析

细菌克隆库是由提取的基因组DNA;16 s rRNA基因扩增使用向前菌进行底漆27 f (5′aga GTT TGA太极拳TGG CTC AG-3′;(14])和反向引物1392 r (5′ACG GGC GGT GTG TRC-3′;(15])。反应混合物(50μ包含1.5毫米MgCl L)2,5μL 10 x NH4缓冲(NH(16毫米4)2所以4,67 mM Tris-HCl 25°C) (pH值8.8,0.01% Tween-20), 0.2毫米每核苷酸(dATP、dCTP dGTP, dTTP),每个引物12.5 pmol, 2μL模板DNA,和1 uTaqDNA聚合酶。PCR反应进行了使用降落PCR在下列条件:初始变性在95°C 10分钟,其次是10个周期95°C的60年代,退火63°C的60年代,120年代在72°C和扩展,在退火温度下降了1°C /周期;紧随其后20周期的变性为60年代在95°C,退火52°C的60年代,120年代在72°C和扩展,紧随其后的是最后10分钟在72°C扩展。控制不含DNA也用来确认放大的污染物,也没有被发现。PCR产品被绑定到质粒向量PCR 2.1威尼斯平底渔船(表达载体)和混合向量变换大肠杆菌十大主管细胞,遵循制造商的指示。转化株筛选使用Luria-Bertani(磅)琼脂板包含50μ克毫升−1卡那霉素。克隆库是由越来越多的殖民地96随机选择来自每个样本200年在一夜之间37°CμL包含50磅肉汤培养基μ克毫升−1卡那霉素96孔板。

2.6。放大rDNA限制分析(ARDRA)

从每个图书馆九十六年克隆筛选来确定是否包含适当大小的插入。Vector-specific M13使用正向和反向引物的浓度12.5 pmol,与其他PCR试剂如前所述。PCR条件:变性在95°C 10分钟;30的循环:60年代95°C, 55°C 60年代,60年代72°C;紧随其后的是最后一个在72°C扩展10分钟。五μL的PCR产品消化与0.8μ限制性内切核酸酶的L有三世在37°C 12 - 16个小时。由此产生的DNA片段被电泳解决3.5% (w / v)高分辨率琼脂糖和条带模式分为操作分类单元(辣子鸡)。

2.7。部分16 s rDNA测序、系统发育和统计分析

插入来自克隆代表52 OTU的鉴定是测序Licor凝胶音序器使用向量特定M13引物(MWG生物技术,德国)。序列从这个研究与16 s rRNA基因序列从BLASTn检索和使用RDP Clustal X [16),系统发育推断包Paup * 4.0 b8是用于所有系统发育分析17]。结果部分16 s rRNA基因序列被存入数据库基因库在HM749844-HM749879加入数字。辛普森多样性指数 计算使用Primer6软件为了比较四种生物质样品的细菌多样性所揭示的克隆库分析,使用该算法 ,在那里 是个人属于一个物种的数量在任何给定的样本吗 是个体的总数出现在任何给定的样本(18]。辛普森多样性指数接近1意味着示例是高度多样化的18]。

2.8。变性梯度凝胶电泳(DGGE)

DGGE分析细菌16 s rRNA基因提取四个样品进行如下:最初使用PCR扩增引物341 f(5′有条件现金援助ACG GGA GGC AGC AG-3′(19r])和517年(5′att ACC GCG GCT GCT GG-3′(19]),一双40-base GC夹附在正向引物的5 '末端。

降落PCR程序由一个初始变性为120年代在94°C;其次是10周期94°C的30年代,退火30年代在65°C,在72°C和扩展30年代,退火温度的下降了1°C /周期;随后20周期在95°C的变性30年代,退火在55°C 30年代和72°C扩展在30年代,紧随其后的是最后10分钟在72°C扩展。一个40μL整除GC-clamped PCR产品加载到10% (w / v)包含变性梯度聚丙烯酰胺凝胶的30 - 70%(其中100%变性剂包含7 M尿素,40%甲酰胺),跑60°C和70 v 16 h D-Code系统(BioRad大力神,CA)。DGGE凝胶是溴化乙锭染色和紫外线trans-illumination下拍摄。17乐队被选作进一步调查,测序和系统发育分析。十这些选定的乐队出现在所有样品和不受温度或TCE的影响。六只乐队出席15°C (R3和R4),当一个乐队现在只有在37°C (R1和R2),在两种情况下指示微生物群落与温度有关的反应。选择乐队从凝胶使用无菌手术刀切除刀片,resuspended在200年μL无菌水,储存在室温下了三个小时的洗提DNA凝胶用作PCR模板。上述进行PCR反应条件下以及由此产生的PCR克隆产品使用威尼斯平底渔船TA(表达载体)。提取质粒从五个随机选择的克隆/反应和2μL的质粒DNA作为模板使用使用相同的引物PCR和条件如前所述。为了确认目的,PCR的产品从质粒DNA电泳在原始PCR DGGE凝胶与相应的产品。质粒产生的乐队接受了变性和原样品一样的浓度梯度,从而通过凝胶迁移相同的距离,选择和排序(MWG生物技术,德国)。

序列从这个研究与16 s rRNA基因序列从BLASTn检索和使用RDP Clustal X [16),系统发育推断包Paup * 4.0 b8是用于所有系统发育分析17]。结果部分16 s rRNA基因序列被存入数据库基因库在HM749788-HM749804加入数字。

2.9。DGGE数据的统计分析

DGGE凝胶分析通过创建二进制矩阵,在乐队的存在与否每个样本表示的数值“1”或“0”,分别。这些矩阵被用来计算未加权的pair-group方法采用算术平均值(UPGMA)使用PC-ORD相似系统树图5.0统计软件包(20.]。

2.10。二维凝胶电泳(2-DGE)

蛋白质提取的重复50毫升每个颗粒污泥样品的声波降解法,随后由2-DGE [21,22]。简单,第一个维度包括等电点聚焦(IEF)使用7厘米IPG条与线性pH梯度(pH值4到7;Amersham)。二维聚丙烯酰胺凝胶12% (w / v)运行成对随着分子量标记的范围10 - 225 kDa(广泛蛋白质分子标记,Promega)。凝胶染色在GelCode 135蓝染色试剂(皮尔斯),然后在deionised使退色,蒸馏水几个小时。二十四凝胶运行对应两个重复独立提取技术复制和三四个样品。与PDQuest-Advanced凝胶图像处理和分析软件,版本8.0.1 (BioRad)。现货数量获得使用现场检测向导使高斯模型选择和数据进行正常化使用当地的回归模型,作为推荐的制造商。点强度测定的比率存在和缺乏TCE 37°C和15°C。被认为是重要的蛋白表达率大于1/2。 Proteins deemed of interest were excised from the gels and identified using nanoflow liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (nLC-ESI-MS/MS), as previously described [21,22]。MS / MS数据分析使用吉祥物2.2搜索引擎(矩阵科学、英国伦敦)针对NCBInr数据库(2010年3月04 10530540序列)没有物种的限制。积极的蛋白质识别是基于两个标准:吉祥物Mowse > 52分(95%置信水平)和最低检测两种多肽/蛋白质。

3所示。结果

3.1。特定的产甲烷活动

R1、R3入渗TCE浓度60毫克L−1,SMA对丙酸、丁酸和乙醇的通常是低TCE-supplemented生物反应器(R1、R3)比相应的控件(R2和R4;表1)。对于每一个测试的三种基质中,TCE-supplemented生物反应器的活动在37°C (R1)高于15°C (R3;表1),这一趋势观察生物来自控制生物反应器,与R2 (37°C)的活性高于R4 (15°C)为所有三个底物利用试验(表1)。
温度 生物质 丙酸 丁酸盐 乙醇
37°C R1 (TCE) 123 (5) 124 (3) 160 (11)
R2(控制) 222 (2) 160 (33) 210 (28)
15°C R3 (TCE) 82 (5) 14 (1) 51 (5)
R4(控制) 164 (1) 23日(2) 48 (11)
表1
特定的产甲烷活性(SMA)的生物量采样R1 R4在235天的生物反应器试验,当入渗TCE浓度的R1、R3 60毫克L−1(9)值表示为毫升CH4gVSS−1一天−1也意味着与std.错误(std.偏差/一式三份 , 括号中给出)。

3.2。克隆库16 s rRNA基因的分析

进行ARDRA共有354个克隆,和几个温度有关,但显然TCE-independent,细菌群落结构的变化观察(图1)。例如,尽管克隆相关门变形菌门是占主导地位的生物反应器,Proteobacteria-like克隆的比例高于R1和R2 (37°C,有或没有TCE, resp)比R3和R4 (15°C,有或没有TCE,职责),而拟杆菌门的对面是真的,Chloroflexi和Firmicutes-like克隆(图1)。15°C生物质样品显示物种多样性高于在37°C,和辛普森多样性指数是:R1 (37°C TCE) 0.7032;R2 (37°C控制)0.6384;R3 15°C (TCE) 0.8459;0.8462 R4 (15°C控制)。

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(d)
图1
细菌的多样性克隆获得16 s rRNA基因克隆库。R1: 37°C TCE-supplemented;R2: 37°C控制;R3: 15°C TCE-supplemented;R4: 15°C控制。
3.3。DGGE

UPGMA PCR-DGGE数据的分析表明,细菌群落的生物量统计集群通过生物反应器的操作温度,与37°C细菌社区(R1和R2)展示> 80%相似,和15°C生物反应器(R3和R4)展示> 90%相似,无论TCE曝光(图2)。此外,这些样品的细菌群落结构最大的不同是37°C和15°C之间观察到生物反应器集群,建立温度作为一个强大的驱动力在细菌群落多样性比TCE(图2)。


图2
细菌UPGMA聚类分析16 s rDNA碎片从DGGE条带生成配置文件。相似性百分比计算(1−索伦森(Bray-Curtis)测距)* 100。R1: 37°C TCE-supplemented;R2: 37°C控制;R3: 15°C TCE-supplemented;R4: 15°C控制。

系统发育分析17个DNA片段的切除DGGE凝胶允许生物细菌社区内(图的识别3)。这些17乐队,十,在所有样本,其中9个被确定为密切相关:假单胞菌(B1),Syntrophomonas(B2),核废料旁边(B3和B11),脱磷孤菌属(B9) Syntrophaceae (B10) Myxococcales (B12) Deltaproteobacteria(十三区最)和壁厚菌门(B14),虽然B7没有与任何分类细菌门(图组3)。


图3
23 发展史的细菌序列获得的DGGE R1-R4生物量、使用Kimura-2算法来计算和neighbour-joining方法(]。引导复制(总100复制量)支持分支顺序显示在相关的节点。加入数字和包含各自的生物反应器生物质乐队给出括号。R1: 37°C TCE-supplemented;R2: 37°C控制;R3: 15°C TCE-supplemented;R4: 15°C控制。

六个乐队只检测到15°C (R3和R4)和相关:Planctomycetes (B4),拟杆菌(B5), Chloroflexi (B6和去往B15) Deltaproteobacteria (B16转椅)和螺旋体属(B17);而只有B8在场只在37°C (R1和R2)和被认定为Thermotogae-like物种(图3)。总的来说,六17乐队的分析系统隶属于变形菌门,(B3、B10 B11, B12,十三区最B16转椅)建立它作为最主要的门(图3)。没有观察到在乐队DGGE凝胶,不同检测由于TCE的存在与否。

3.4。宏蛋白质组学

九十三不同的地点被切除,蛋白质测序识别基于蛋白表达率。点被选中,这样持续表达的蛋白,诱导或压抑TCE的存在都包括进行分析。其中,46%的人使用nLC-ESI-MS / MS验明正身。大量的蛋白质被发现迁移为几个不同的地点,导致积极的27个独特的蛋白质(表的识别2)。
蛋白质 建议功能 加入数量 物种的任务 分类 吉祥物的分数 %覆盖率 37°C的比例 15°C的比例
乙酰辅酶a decarbonylase
β亚基
 甲烷生成的乙酸 胃肠道116753609 Methanosaeta thermophila 订单
Methanosarcinales		 253年 8 −1.7 −1.2
171年 8 北达科他州 1.2
辅酶F420依赖它们,N10 methylenetetrahydromethanopterin还原酶 甲烷生成从有限公司2 胃肠道1002717 Methanothermobacter thermoautrophicus 订单
Methanobacteriales		 248年 19 −1.4 −1.7
166年 13 −2.6 北达科他州
147年 9 1.8 1
Tetrahydromethanopterin-S-methyltransferase H-subunit 甲烷生成从有限公司2 胃肠道116754675 Methanosaeta thermophila 订单
Methanosarcinales		 104年 2 −3.9 北达科他州
我Methyl-CoM还原酶
α亚基		 甲烷生成 胃肠道126855 Methanothermobacter marburgensis 订单
Methanobacteriales		 203年 8 3所示。2 −1.6
我Methyl-CoM还原酶
α亚基		 甲烷生成 胃肠道284413635 甲烷细菌属sp。 订单
Methanobacteriales		 469年 25 1.2 −1.9
396年 23 北达科他州 −4.6
237年 16 北达科他州 −3.7
我Methyl-CoM还原酶
α亚基		 甲烷生成 胃肠道47827047 无教养的Methanosarcinales 订单
Methanosarcinales		 140年 17 2。1 2。8
我Methyl-CoM还原酶
β亚基		 甲烷生成 胃肠道126862 Methanothermobacter marburgensis 订单
Methanobacteriales		 393年 11 北达科他州 −8.3
223年 8 −2.7 北达科他州
148年 9 −1.7 −1.5
我Methyl-CoM还原酶
β亚基		 甲烷生成 胃肠道126178567 Methanoculleus marisnigri 订单
Methanomicrobiales		 224年 5 2。8 1.3
我Methyl-CoM还原酶
γ亚基		 甲烷生成 胃肠道116753883 Methanosaeta thermophila 订单
Methanosarcinales		 157年 11 −2.7 4.9
蛋白酶体
α亚基		 蛋白水解作用 胃肠道6093782 Methanosaeta thermophila 订单
Methanosarcinales		 206年 16 −5.1 12.5
151年 12 北达科他州 1.1
Thermosome
 分子伴侣 胃肠道116754081 Methanosaeta thermophila 订单
Methanosarcinales		 272年 9 −2.9 在R4北达科他州
273年 10 北达科他州 1.8
v形ATP合酶
α亚基		 ATP的合成 胃肠道116754898 Methanosaeta thermophila 订单
Methanosarcinales		 217年 10 −1.1 北达科他州
212年 10 3所示。9 北达科他州
199年 10 1.9 北达科他州
191年 8 −5.6 1.9
假设蛋白质mhun - 2513 未知的 胃肠道88603754 Methanospirillum hungatei 订单
Methanomicrobiales		 1640年 46 1 北达科他州
Acetate-CoA连接酶 乙酰辅酶a的合成 胃肠道116754497 Methanosaeta thermophila 订单
Methanosarcinales		 153年 5 3所示。8 5.9
含铁乙醇脱氢酶 乙醇代谢 胃肠道77457538 荧光假单胞菌 门变形菌门 180年 3 1.4 北达科他州
159年 3 1 −1.7
122年 6 北达科他州 1.1
磷酸乙酰转移酶 乙酸代谢 胃肠道95930364 Desulfuromonas acetoxidans 门变形菌门 106年 5 −1.4 6.5
Acetate-CoA转移酶
β亚基		 乙酸代谢 胃肠道147678377 Pelotomaculum thermopropionicum 门壁厚菌门 304年 18 1.1 北达科他州
Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶I型 糖酵解 胃肠道213959469 丙酸菌属曼秀雷敦 门放线菌 375年 17 −2 2
甲基Malonyl-CoA变位酶
大亚基		 异构化的琥珀酰辅酶 胃肠道116747906 Syntrophobacter Fumaroxidans 门变形菌门 507年 16 23.7 −1.1
琥珀酰辅酶合成酶
β亚基		 形成琥珀酰辅酶 胃肠道116749138 Syntrophobacter Fumaroxidans 门变形菌门 235年 15 −1.1 北达科他州
苹果酸脱氢酶 乙醛酸途径 胃肠道116747908 Syntrophobacter Fumaroxidans 门变形菌门 383年 26 1.8 −3.1
O-acetylserine sulfhydrylase 同型半胱氨酸生产 胃肠道148265277 核废料旁边uraniireducens 门变形菌门 216年 10 2。9 3所示。4
伴护蛋白质 高分子组装 胃肠道85859704 先天病aciditrophicus 门变形菌门 555年 17 北达科他州 2。8
伴护蛋白质DnaK 蛋白质折叠 胃肠道116748478 Syntrophobacter Fumaroidans 门变形菌门 230年 8 −1.5 北达科他州
Chaperonin GroEL 蛋白质折叠 胃肠道148266317 核废料旁边uraniireducens 门变形菌门 620年 18 −8.5 3所示。6
326年 10 3所示。6 在R4北达科他州
细胞外配体结合受体 受体
活动		 胃肠道116750526 Syntrophobacter Fumaroidans 门变形菌门 671年 28 −1.5 北达科他州
309年 17 1.2 −2.9
表2
从生物反应器生物质蛋白质鉴定。率= TCE反应堆点强度:non-TCE控制反应堆点强度,也就是说,正值表明表达的蛋白质是在更高强度的TCE-supplemented反应堆,和负值表明表达的蛋白质在更高强度的控制反应堆。北达科他州:没有检测到。

12个蛋白质与细菌种类有关,其中十门变形菌门的成员,放线菌和壁厚菌门每个代表一个蛋白(表2)。来自细菌种类的蛋白质的功能非常多样。相关的蛋白质的代谢影响废水的组件,即乙酸(磷酸乙酰转移酶)和乙醇(酒精脱氢酶),识别出所有样品,是隶属于变形菌门(表2)。

五个蛋白质识别那些可能涉及乙醛酸的降解(表2)。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶、糖酵解途径的酶被发现在所有样品(表2),表明糖酵解途径似乎是活跃在所有的条件下进行。此外,有证据表明methyl-malonyl通路的活动,如甲基malonyl-CoA变位酶被发现在所有样品,采样调节ca。在TCE的存在37°C(表2)。琥珀酰辅酶合成酶,生产琥珀酰辅酶、甲基丙二酰基所需的路径,在37°C样品被确认,但不是在15°C(表2)。苹果酸脱氢酶,蛋白质的苹果酸转化成草酰乙酸的乙醛酸循环,还确定了所有样品,但是是三倍的表达下调TCE 15°C(表2)。草酰乙酸,反过来,可以转换为天冬氨酸盐,从而导致生产L-homocysteine通过形成的O-acetyl-L-homoserine O-acetylserine sulfhydrylase,酶被发现在所有样本和被发现调节在TCE的存在两个温度(表2)。O-acetylserine sulfhydrylase被分配到核废料旁边sp,已知参与TCE脱氯(24]。

剩下的9个蛋白质属于订单被分配到热点Methanomicrobiales Methanobacteriales,和家庭Methanosaeta(表2)。不出所料,甲烷生成的建议功能主导来自古生菌的蛋白质,蛋白质参与生产醋酸的甲烷(乙酰辅酶a decarbonylase)和有限公司2(辅酶F420依赖它们,N10 methylenetetrahydromethanopterin还原酶)中确定所有样品(表2)。

此外,一些辅助蛋白被鉴定,包括那些参与ATP合成和蛋白质水解,而acetate-CoA连接酶调节在两个温度TCE的存在,这将导致增加乙酰辅酶a的生产(表2)。最后,一个假设的蛋白质发现未知函数在37°C,并隶属于Methanospirillumsp。(表2)。

4所示。讨论

一些结果表明消极反应的细菌社区TCE的存在,特别是在60毫克的最大应用浓度L−1。例如,测量VFA的积累,尤其是丙酸,期间观察到的过程扰动初始TCE后加法和后续TCE浓度的增加(图4)。同时,SMA化验使用间接产甲烷基质表示,235天,丙酸的活动,丁酸盐、乙醇使用的通常是低TCE-supplemented生物反应器的控制同行(表1)。然而,分析细菌社区在这个研究没有揭示任何重要的群落结构的变化可以归因于强烈过程失败观察R1 (37°C)和R3 (15°C) 60毫克的入渗TCE浓度L−1(9]。人口与古细菌的情况下(9),细菌社区看起来不是结构受到TCE的加入;然而syntrophic人群的活动可能导致过程失败。

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图4
出水VFA浓度R1-R4:乙酸();丙酸();丁酸(- x)。R1: 37°C TCE-supplemented;R2: 37°C控制;R3: 15°C TCE-supplemented;R4: 15°C控制。

采用16 s rRNA基因分析(DGGE和克隆库)本研究旨在针对细菌群落结构和识别变化,可能是与气温——/或TCE-induced过程失败。此外,metaproteomic总体微生物群落的分析是为了确定与持续的功能相关的蛋白质在生物反应器,包括TCE的还原脱氯。

变形菌门的高水平- - - - - -像物种观察到DGGE和16 s rRNA基因克隆库在所有样本是根据先前的研究,该报道称,变形菌门通常在厌氧生物反应器的主要类群(25,26]。分析确诊的metaproteome变形菌门的代谢活动所有样品(表2),充实这门的重要性在厌氧消化的过程。相应地,几个关键变形菌门的物种被确定一个或更多的这些技术。例如,propionate-oxidisingSyntrophobacter fumaroxidans在场的所有样本,检测到细菌克隆库(图1(图)和DGGE分析3),并与三个有关的蛋白质参与图中概述的代谢途径5。这些蛋白质之一,甲基丙二酰辅酶a变位酶,参与丙酸的新陈代谢(图5),强烈诱导TCE的存在在37°C(表2),尽管SMA化验表明丙酸介导甲烷生成的低活动TCE(表的存在1)。有可能生产甲基丙二酰辅酶a变位酶增加反应代谢瓶颈,并促使CH的稳定生产4在37°C。此外,作为中间减少了有机化合物的氧化丙酸等大力不利,Syntrophobactercoculture需要增长,产甲烷菌利用氢和甲酸等Methanospirillum hungatei这些氧化,从而保持低浓度和允许能源获得的产品所涉及的所有生物(27,28]。qPCR分析使用底漆/探头设置具体的订货Methanomicrobiales,的Methanospirillum属于量化16 s rRNA基因数量的107-10年9副本(gVSS)−1在235天9),具体地说,Methanospirillum hungatei被metaproteome的分析发现,和相关蛋白质的未知函数(表吗2)。


图5
矿渣Mtc Methanoculleus Pelotomaculum 假单胞菌 Syntrophobacter Geo核废料旁边 提出了VFA的降解代谢途径和TCE metaproteomic推断的数据。酶识别研究中展露无遗。物种缩写如下:Mtt Methanothermobacter sp。Msa Methanosaeta sp。Mtb甲烷细菌属sp。;Msr Methanosarcinales sp。sp。图像的基本单位sp。Des Desulfuromonas sp。Psdsp。Synsp。箴丙酸菌属sp。sp。确定了酶的生物反应器在方括号表示,R1的地方:37°C TCE-supplemented;R2: 37°C控制;R3: 15°C TCE-supplemented;R4: 15°C控制。

克隆与几个相关细菌类群被发现在各种生物反应器的低水平,例如:拟杆菌门- - - - - -和Chloroflexi-like克隆被确定在所有生物样品(R1-R4;图1);Spirochaetes-like克隆只占1%的克隆R1、R3生物量和没有发现在R2或R4(图1);和Planctomycetes例如克隆被发现在R2, R3和R4(图1)。的门Planctomycetes,拟杆菌、Chloroflexi Spirochaeteswere每个代表一个DGGE乐队,15°C的生物反应器中检测到,但是没有发现37°C (B4、B5、B6和B17,分别地。,图3)。DGGE PCR扩增可能是对低水平的这些类群的生物反应器,多模板的扩增DNA片段可以抑制小模板的扩增29日]。这些门经典识别在生物反应器内,虽然拟杆菌门的确切功能,Chloroflexi,螺旋体属是未知的30.]。发现这门没有蛋白质隶属于任何示例(表2),这些微生物组在厌氧生物反应器的功能不能从这项研究决定。大多数的文献关于门的作用Planctomycetes在厌氧氨氧化颗粒生物质集中(氨)细菌31日),直接将硝酸盐和铵二氮气体(32),尽管没有一个已知的与这个过程相关的蛋白质被确定在本研究中(表2)。

Firmicutes-like物种被多个检测分析方法在所有的样品。例如,Peptococcaceae-like克隆被发现在每个克隆库(图1),而宏蛋白质组学检测acetate-CoA转移酶在生物反应器(表37°C2),这是相关联的Pelotomaculum thermopropionicum,高温、syntrophic propionate-oxidising Peptococcaceae家族的细菌(33]。这一物种已被证明与hydrogenotrophic coculture生长Methanothermobacter thermoautotrophicus(33),也是发现活跃在所有生物样品(表2)。此外,Syntrophomonas物种在厚壁菌门门是由两个克隆库(图1(图)和DGGE分析3)在所有样品中,曾被证明syntrophically与成长Methanospirillum物种,导致形成的甲烷(34]。

Desulfuromonadales顺序,具体地说,核废料旁边物种,被发现在所有样本(数据1和3),都与TCE的部分脱氯作用有关独联体1、2 DCE (24]。相关的蛋白质核废料旁边sp, O-acetylserine sulfhydrylase,调节TCE的存在,在37°C和15°C(表2)。O-acetylserine sulfhydrylase参与生产L-homocysteine(图5),它可以进一步转化为半胱氨酸(参与蛋白质折叠)或蛋氨酸(经常发现与membrane-spanning蛋白质域的脂质双分子层;(35])。是可能的,增加生产O-acetylserine sulfhydrylase可能导致增加L-homocysteine水平对亲脂性的TCE的作用,这可能与细胞膜,导致细胞膜atp酶的抑制36]。有趣的是,尽管核废料旁边物种与TCE脱氯作用有关(24),已发现在这项研究中通过克隆库(图1(图)和DGGE分析3),允许使用宏蛋白质组学的一个建议为一个特定的函数这一组提出。

没有专门针对相关蛋白质还原脱氯TCE被确定2-DGE metaproteome分析(表2)。一个假设是,作为生物反应器影响包含VFA浓度要高得多的比吨标煤,TCE浓度可能诱导生产足够的酶对TCE脱氯,但被2-DGE检测不足。尽管TCE的脱氯作用并不是监控在这个试验中,我们之前报道的成功脱氯TCE DCE(> 98%)和一个类似的实验设计在37°C和15°C (37),在温度低至7°C (38]。类似的困难与检测相关的特定的酶参与生物修复通路已经遇到关于碳氢化合物(39)和甲苯等化学污染物(40]。没有匹配的宏基因组数据集无疑阻碍了蛋白质识别,例如,先前的研究表明,分析活性污泥的metaproteome 2-DGE导致38蛋白质的识别(412 d-nano-lc方法的),而实现宏基因组数据集识别了5029蛋白(42]。

总的来说,克隆库和生物反应器的DGGE分析细菌的数量确定了散度的种子生物质可以认为比TCE对温度。具体来说,UPGMA DGGE乐队多样性分析表明细菌社区发展最大的变化发生在生物反应器操作在37°C和15°C(图2),而在温度、TCE导致改变< 5% TCE-exposed和控制生物质(图2)。这支持了先前的研究,得出的结论是,虽然细菌种群动态分析是很重要的,它不是一个处理事件的可靠指标,可以观察到高水平的活力甚至功能稳定的时期(43,44]。

5。结论

现在可以得出以下结论:(1)metaproteome可以观察到的变化作为操作温度和接触TCE的函数;(2)根据DGGE UPGMA数据,细菌群落结构发展的主要驱动力在厌氧生物反应器温度、有限对TCE的存在;(3)相关联的特定功能的检测蛋白质(如TCE还原dehalogenases)可以提高可用性的宏基因组数据集来帮助蛋白质鉴定。

确认

这项工作是支持企业爱尔兰,爱尔兰环境保护局,爱尔兰科学基金会。

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