识别的主要表达S-Layer模型中的蛋白质和细胞Surface-Layer-Related产甲烷古菌:甲烷八叠球菌属巴氏细菌Fusaro和甲烷八叠球菌属acetivoransC2A

文摘

许多古细菌细胞信封包含蛋白质的外套或鞘组成的一个或多个表面暴露的蛋白质。这些表层(S-layer)蛋白质造成的脂质膜结构完整性和保护环境的挑战。探索Methanosarcinaceae这些层的物种多样性,主要S-layer蛋白质甲烷八叠球菌属巴氏细菌应变Fusaro被确认使用蛋白质组学。Mbar_A1758基因产物是存在于多种形式明显的大小为130,120,和100 kDa,符合转录后修饰包括切除信号肽和蛋白质糖基化。蛋白质功能与表层蛋白质中发现甲烷八叠球菌属acetivoransC2A和甲烷八叠球菌属mazei戈埃尔被确认的m·巴氏细菌基因组。这些数据揭示了一个独特的签名与守恒的蛋白质特性和隐含细胞表面结构的Methanosarcinaceae缺席在其他古生菌。在两个Paralogous基因表达模式甲烷八叠球菌属物种显示丰富的表达一个S-layer假字在每个压力。各自的子元素被识别和显示是守恒的信使rna编码和上游区域。之前m . acetivorans基因组注释指定S-layer或表层角色相关的八十个基因:然而,68年的检查没有明显表示相对于实验S-layer基因决定的。

1。介绍

像其他细胞信封热点以及革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、产甲烷古菌的信封有重要作用在保护细胞免受环境挑战1- - - - - -3]。例如,信封抵抗攻击,针对细胞外酶的胞质膜,小亲脂性的或chaotrophic分子,和其他有毒的代理。信封也有助于抵抗渗透压力和脱水,同时允许运输的小分子量营养物质和废物4]。然而,相对较少的已知细胞信封Methanosarcinaceae,包括高度生物模型研究甲烷八叠球菌属acetivoransC2A,甲烷八叠球菌属mazeiGoe1,甲烷八叠球菌属巴氏细菌Fusaro。之前的电子显微镜研究揭示的存在典型的S-layer周围的细胞质膜(5,6]。生物信息学研究预测表层和surface-layer-related蛋白质产甲烷菌株。例如,基因组的注释m . acetivorans与这些分配函数(81子列表7),而在14和52个orf的注释m . mazei和m·巴氏细菌基因组编码相关的表层蛋白质,分别8,9]。在另一项研究中使用比较生物信息学方法,m . mazei m .巴氏细菌,m . acetivorans预测拥有12、12和3假定S-layer蛋白质,分别为(10]。几乎没有重叠的基因预测使用上面的注释。

小实验数据存在addresse上述预测,除了最近的蛋白质组报告,确定主要表层蛋白质在两株,m . mazeiGoe1和m . acetivoransC2A [11]。的甲烷八叠球菌属研究发现一种蛋白质在每个物种相似预测氨基酸序列(即。MM1976 MA0829),但不同的表观尺寸所揭示的sds - page。的m . mazeiS-layer显示三种约131、119和101 kDa,每个拥有未知成分多糖修改。m . acetivorans显示主要S-layer蛋白质形式134、119和114 kDa的表观尺寸(11]。有趣的是,这些蛋白质以前标注为假想的蛋白质中m . mazei和m . acetivorans基因组与许多其他蛋白质注释表层或surface-related [7- - - - - -9]。基于蛋白质同源性搜索MM1976 MA0829,m . mazei和m . acetivorans基因组包含4到7相关orf (11]。这些相关的角色和表达并加上那些先前相关的注解为表面在这些模型甲烷八叠球菌属尚不清楚。

为了解决上述问题,结合蛋白质组学、生物信息学和基因表达研究探讨表面层次的多样性两个模型甲烷八叠球菌属菌株。主要S-layer蛋白质m·巴氏细菌被确定(Mbar_A1758)及其序列被用来定义一个家庭paralogous和同源蛋白质的吗Methanosarcinaceae。转录水平的大量表达子从两个模型,检测paralogous菌株基因被确定。最后,许多的表达m . acetivorans以前带注释的基因为S-layer和surface-layer-associated蛋白检查:没有发现显著表达。总之,这些m . acetivorans mazei,m·巴氏细菌研究揭示的存在不同的家庭支持bioinformatics-based S-layer基因/蛋白质重新评估Methanosarcinaceae细胞表面层次。

2。方法和材料

2.1。细胞培养

m . acetivoransC2A (DSM 2834)和m·巴氏细菌Fusaro (DSM 804)种植在矿物salts-based介质在单细胞形式如前所述[12)的大气(80:20)氮和二氧化碳的容器顶部空间。灭菌后,介质与filter-sterilized补充0.1毫升50%甲醇乙酸5米或0.2毫升每10毫升介质如前所述m . acetivorans(13]。为m·巴氏细菌细胞生长,文化发展与甲醇(0.5% v / v)或80:20氢的氛围:二氧化碳的容器顶部空间。

2.2。RNA净化

核糖核酸分解动作,文化m . acetivorans或m·巴氏细菌是生长在指定的基板与串行传输至少三次midexponential阶段之前细胞收获。细胞总RNA从10 mL纯化样品使用RNAwiz(奥斯汀Ambion TX)后,制造商的说明和描述12]。纯化RNA是DNase对待我所描述的14,15)和存储−70°C到使用。

2.3。定量rt - pcr

实时逆转录(rt - pcr)反应是使用上标执行二世(英杰公司)如前所述12]。删除互补的RNA, 1μL核糖核酸酶H被添加到混合和孵化20分钟在37°C。实时PCR反应是进行Biorad iCycler (Biorad大力神,CA)使用一个四个步骤的程序包括变性、退火、延伸,收购的步骤。创建rt - pcr引物的修改版本MyPROBES [15]。PCR产品长度是100 - 200个基点的熔化温度范围是在55 - 66°C。GC含量55 - 65%,引物长度是17-22基地(见补充资料在网上http://dx.doi.org/10.1155/2012/873589、表S1)。每一对引物校准使用基因组DNA (12]。基因表达值测定在一式三份,参考基因显示相比没有显著差异表达m . acetivorans(即微阵列实验。,MA3998), or with genomic DNA for them·巴氏细菌实验。实验进行了一式三份,标准偏差小于5%。误差在适当的数字表示。表达丰度单位(来自)拷贝数每5 ng RNA (12]。

2.4。引物延伸分析

引物延伸反应进行确定信使rna 5′末端利用基因特定的引物是60基地位于下游的ATG起始密码子基因(Mbar_A1758)和100基地(MA0829)清单每个引物(表S1)。总RNA是孤立的如上所述。总共30μ使用g的RNA在每个引物延伸反应进行描述(12),但第二Sequitherm Excel工具包(震中麦迪逊,WI)是用于创建梯子从无关的DNA测序反应。

2.5。SDS-Polyacrylamide凝胶电泳和蛋白质可视化

蛋白质是解决NuPAGE 4 - 12% Bis-Tris凝胶使用MES运行缓冲(英杰公司)如前所述11]。染色蛋白质的图像使用SYPRO Ruby (Bio-Rad)通过分子成像仪拍摄的外汇扫描仪和一个图像分析软件(Bio-Rad)。糖化蛋白被Pro-Q显示翡翠300糖蛋白污点制造商的协议(分子探针)如前所述11]。蛋白质分子量标准获得分子探针(甘蔗糖蛋白标准)和Bio-Rad(生物素化的广泛蛋白质标准)。

2.6。胰蛋白酶水解和Nano-HPLC-MS /女士

蛋白质乐队确定被切除的sds - page凝胶spot-excision机器人(蛋白质组的作品,Bio-Rad)或用手。gel-embedded蛋白减少,iodoacetamide-alkylated trypsin-digested (Promega,测序年级修改胰蛋白酶)。产品从聚丙烯酰胺肽提取矩阵在50%乙腈/ 0.1%三氟乙酸在水和干真空离心。肽是溶解在10μL 0.1%的甲酸(FA)解决方案,分析了液体chromatography-tandem质谱(质/ MS)和电喷雾电离(ESI)在一个应用生物系统公司QSTAR脉冲星XL (QqTOF)质谱仪如前所述11]。在液相色谱串联质谱记录自动由information-dependent分析(IDA)与碰撞能量质谱仪选择软件产量最大破碎效率(11]。数据库搜索进行MS / MS数据利用吉祥物(矩阵科学)和完整的MSDB数据库。蛋白质序列搜索使用一个错过的乳沟和质量公差0.3 Da前体和产品的离子。蛋白质达到基于≥2认为肽被接受,至少其中一个拥有MOWSE分数≥50岁()。MS / MS谱和赋予序列之间的通讯也手动验证。

2.7。信息学分析和数据可视化

蛋白质的相似性确定使用爆炸[16]而对齐和蛋白质的种系发生树进行clustalw [17]。执行的可视化树与splitTree4 [18]。上游DNA区域寻找回文,重复图案使用简单的Perl脚本编写的软件在房子在UTR区域搜索守恒的元素(12]。潜在Rho-independent终结者序列预测使用TransTermHP软件(19]。信号肽预测使用signalP 3.0 (20.)和跨膜域利用TMHMM预测(21]。RNA二级结构预测使用RNAfold网络服务器(22]。

3所示。结果

3.1。识别的主要m·巴氏细菌细胞表面蛋白

我们最近发现的主要S-layer蛋白质m . acetivoransC2A和m . mazeiGoe1 MA0829和MM1976基因产品,分别为(11]。然而,身份和大小(s)的专业m·巴氏细菌S-layer蛋白(s)目前未知由于存在多个paralogous基因相关的主要表面蛋白分泌和修改m . acetivorans和m . mazei(在下面描述)。为了解决这些问题,进行蛋白质组学分析m·巴氏细菌细胞生长midexponential阶段以甲醇为唯一碳源和能源(部分2)。Cell-extracted蛋白质分离通过sds - page和被荧光染色可视化,使用Ruby SYPRO揭示总蛋白质含量(图1 (b))和Pro-Q祖母绿(图1(一))揭示糖基化的蛋白质。三位著名的糖化物种明显大小为130,120和100 kDa Pro-Q透露了翡翠染色(图1(一)带1 - 3)。130 kDa物种出现主要由SYPRO Ruby总蛋白染色(图1 (b))。此外,一些乐队小还含有糖蛋白(图1(一)标记为乐队4 - 6)。

主要glycan-stainedm·巴氏细菌蛋白质乐队(图1(一),1 - 3)切除的sds - page凝胶并受质/ MS分析(表S2)。高度丰富的在每个频带被Mbar_A1758蛋白质编码。预计这个基因编码一个假想的蛋白质73535 Da的大小([9]IMG变得)但由于凝胶表现出物种有130,120,和100 kDa,看来蛋白质转译后的修改的S-layer蛋白质m . acetivorans和m . mazei([11];下面讨论)。通过串联质谱,成熟的n端(ADSVEIR)决心开始残渣25(表S3)。

3.2。的m·巴氏细菌基因组拥有九Mbar_A1758-Like蛋白质

生物信息学Mbar_A1758-like蛋白质编码的搜索m·巴氏细菌Fusaro基因组(部分2)显示9个高度保守的orf(表1)。假字都具有信号肽预测,表明蛋白出口,再加上一个或两个未知函数称为DUF1608包含域。然而,不同的蛋白质表观尺寸和c端疏水跨膜元素的存在。

,以确定哪些假字中大量表达m·巴氏细菌每个基因,独特的引物对设计和使用定量pcr基因转录酶测定(图2(一个);部分2):从细胞中分离出RNA种植mid-exponential阶段与甲醇或氢/二氧化碳作为唯一碳源和能源。只有一个的m·巴氏细菌orf(即。,Mbar_A1758) was abundantly expressed. Of the remaining eight genes, transcripts for only two, Mba_A1034 and Mbar_A2016, were detected (ca在1.2%和1.7,Mbar_A1758成绩单)。基于丰富的Mbar_A1758蛋白的检测m·巴氏细菌细胞提取物和独特的高水平的成绩单,它似乎构成了主要的信封S-layer蛋白质。对于后续的基因识别和描述,我们指定这种蛋白/基因。

3.3。的m . acetivorans基因组具有多个MA0829-Like基因

潘伟迪发展史之前搜索的m . acetivorans基因组(11显示四个MA0829相关蛋白质(即。,MA0844 MA0068 MA3556, MA3639)。所有的这些都是预测编码蛋白质,含有未知函数的域,指定为DUF1608。在一个生物信息学的搜索扩展m . acetivorans基因组(部分2)六个额外的开放框架确定了34 131 kDa(表的不同而有所不同1)。有趣的是,所有被标注为未知函数的假设的蛋白质([7];下面讨论)和拥有一个或两个DUF1608域。

3.4。的m . acetivoransMA0829基因大量表达

以确定哪些十MA0829-like基因m . acetivorans基因组表达,独特的DNA引物对的设计为每个如上所述m·巴氏细菌(部分2、表S1)和细胞生长mid-exponential阶段与甲醇或醋酸为唯一碳和能源供应。细胞总RNA是孤立和用于定量pcr基因表达分析(图2 (b))。一个例外(ORF MA0829,指定区别于相关orf)成绩单都出现在低到几乎无法觉察的丰度。相对于,下一个最高表达ORF MA3556 (),其次是MA0068 ()的约1.8%和3.5,分别。有趣的是,之前我们的蛋白质组学研究中,这对表面蛋白丰富,发现MA0068 MA3556蛋白质从洗出液伴刀豆球蛋白,这表明蛋白质糖基化的或与聚糖。他们没有检测到不用人伴刀豆球蛋白浓缩(11]。这些paralogous的潜在作用slmA1例如基因是下面讨论。

3.5。MA0829信使rna 5′末端的识别

的m . acetivorans slmA1成绩单的5′末端决心(部分2)。观察一个5′末端对应159核苷酸上游的一个位置slmA1平移start(图3(一)、弯曲的箭头)。分析DNA编码区上游的mRNA起始点包含一个可辨认的塔塔所需盒子真沸点识别/招聘和DNA结合[12]。三个短的地区双对称14到21个核苷酸长度也见过在这个区域(图3(b),薄的箭头)。最后,检查(UTR)透露一些信使RNA 5′端非翻译区潜在的RNA二级结构(部分2:图S1)。

的m . acetivorans slmA1基因位于上游的两个基因编码的蛋白质(即。MA0830-MA0831)和下游的tRNA基因(图3)。来确定MA0830 ORF cotranscribed着slmA1定量PCR (qPCR)实验(图执行4)。MA0830表达式(醋酸)约2%到7%(甲醇)的水平slmA1,这表明没有转录通读发生从上游MA0829子元素。有一个rho-independent-like终结者MA0829后序列预测使用TransTermHP [19]。蛋白质组学的研究没有提供证据大量MA0830或MA0831。

比较slmA1基因表达水平相对于几个高度丰富的子功能m . acetivorans甲烷生成,具体引物对(表S1)设计的mcrA和家长会基因。在大多数细胞中高度表达,mcrA基因编码的一个亚基甲基辅酶M还原酶酶甲烷形成的中央通道家长会醋酸编码phosphotransacetylase所需的激活和利用率。结果qPCR分析证明slmA1表达明显高于(ca。通过2至10倍)mcrA或家长会(图4)。

的m·巴氏细菌slmA1信使rna 5′末端也确认(部分2,图3(b)),它对应于一个位置类似发现m . acetivorans slmA1。154核苷酸(nt)上游的转化开始网站,m·巴氏细菌slmA1UTR序列高度保守的关系的m . acetivorans(>91%的身份)。进一步的上游,DNA还包含一个守恒TATA盒。有趣的是,假设一个带注释的蛋白质编码直接下游slmA1,Mbar_A1759,被发现在蛋白质组学研究(数据未显示)。然而,基因只是弱转录甲醇相对于Mbar_A1758生长细胞,它似乎没有明显积累m·巴氏细菌。

3.6。的m . mazei基因组拥有五Mbar_A1758-Like蛋白质

一个搜索的m . mazeiGoe1基因组的m . acetivoransMA0829-like和m·巴氏细菌Mbar_A1758-like蛋白(部分2)显示五个高度保守的orf(表1下面描述)。其中的一个,MM1976 (),以前确定主要S-layer蛋白质m . mazei细胞表面(11]。

3.7。是以前的注释m . acetivoransS-Layer和Surface-Related蛋白大量表达吗?

的注释m . acetivorans基因组与分配函数列出了大约八十个orf S-layer蛋白质或surface-related蛋白质(7)(表S4)。以确定这些羊痘疮明显表达,我们分析了两个m . acetivorans微阵列数据集从细胞生长条件下与乙酸或以甲醇为唯一碳和能源供应(部分2)。编译后的像素数据集被规范化mcrA基因编码甲基辅酶还原酶(MA4546)。引人注目的是,六十八年之前没有注释的orf明显表示相对于我们有数据mcrA(ca。,低于3 - 4%)。如上所述,(MA0829)表达式2-4-fold上面观察的mcrA基因(图4)。最后,十二个表层蛋白质预测m . acetivorans由萨利赫et al。10)构成的一个子集所示表S3:他们不是相对于MA0829显著表达。这些实验结果显示计算工具的限制用来预测古S-layer蛋白质和表面相关蛋白组产甲烷菌。

4所示。讨论

4.1。识别和属性的m·巴氏细菌表层的蛋白质

基于之前m . acetivorans和m . mazeiS-layer蛋白质组学和生物信息学数据,它是不可能预测的三到五个orf密切相关m·巴氏细菌基因组编码的主要S-layer蛋白(s)的微生物。糖蛋白染色的sds - page分离m·巴氏细菌包含Mbar_A1758多肽细胞提取了三个不同的乐队(看到Pro-Q翡翠糖蛋白彩色车道1 - 3,图1(一))。这m·巴氏细菌蛋白质是类似于表面暴露出来m . acetivorans和m . mazeiS-layer蛋白质揭示了biotin-tagging研究[11]。是转译后的处理的氨基端信号序列,进一步修改添加未知糖半个。成熟的n端(ADSVEIR)决心开始残渣25(表S4)和对应于那些决定MA0829 MM1976 [11]。凝集素印迹显示Mbar_A1758和凝集素Con之间的相互作用,雪花莲植物血凝素(GNL)Pisum一凝集素(PSA)。反对,优先绑定α甘露糖和α葡萄糖,曾被我们绑定显示m . mazei和m . acetivoransS-layer蛋白质。GNL结合(α1、3)甘露糖残基优先,与大多数mannose-binding凝集素,不绑定α葡萄糖。PSA喜欢绑定α-mannose-containing低聚糖与N-acetylchitobiose-linkedα海藻糖残基。这些植物血凝素结果显示未来方法丰富Mbar_A1758全细胞溶解产物。

4.2。高度表达Methanasarcina slmA1基因

的m . acetivoransMA0829基因()是最高度表达的细胞(数字2和4)。有趣的是,下游基因,MA0830、没有明显转录和似乎没有operon-like结构的一部分。的m·巴氏细菌slmA1基因(Mbar_A1758)也高转录从上游转录起始站点(图一模一样3(b))。utr之间的高保护和启动子元素为主导slmA1基因m . acetivorans mazei,m·巴氏细菌表明,所有三个生物控制转录和翻译的S-layer蛋白质以类似的方式。UTR和假定的二级信使rna结构的作用(图S1)基因表达的目前未知。

而Mbar_A1758和MA0829 S-layer蛋白质最丰富的表达蛋白m·巴氏细菌和m . acetivorans,两个额外的蛋白质,MA0068 MA3556,发现通过蛋白质组学方法,尽管在低得多的水平(11]。相应地,他们的基因转录相对于MA0829(即人口比例低得多。在不到0.04和0.02的水平,分别地。,图2 (b))。他们是否代表小部件所需的S-layer不知何故信封孔隙度和/或适当的组装是未知的。或者,他们可能更高度表达了不同细胞生长条件下。同样,Mbar_A1034和Mbar_A2016基因产物检测m·巴氏细菌。

对齐的主要三大S-layer蛋白质的氨基酸序列m·巴氏细菌,m . acetivorans,m . mazei(图6揭示了高保护相似身份(65%和88%)。每个蛋白质都有针对分泌遵循类似的信号肽序列串联DUF1608域和一个简短的60个氨基酸链接器区域。后者元素可能会使S-layer蛋白c端和疏水跨膜螺旋的细胞质膜。更详细的评估这些蛋白质和各自的假字在进步。

4.3。在其他微生物Mbar_A1758-Like蛋白质

Mbar_A1758-like蛋白质测序的基因组中标识甲烷八叠球菌属物种和其他微生物(部分2、表1)是显示在图所示的系统发育树5。可能是四个主要的结论。首先,这些蛋白质组分成六个深深支集群m . acetivoransMA0829 ()和m . mazeiMM1976 ()下,蛋白质和相邻的三个m·巴氏细菌orf (Mbar_A1758 Mbar_A2011, Mbar_A3145)。一个额外的两个m·巴氏细菌orf (Mbar_A1815 Mbar_A1816)是下一个最密切相关的蛋白质。因此,它是不可能提前预知,这五个m·巴氏细菌基因可能编码主要S-layer蛋白质生物。从基因表达研究(图3(b)), Mbar_A1758是逻辑的候选人由于其高水平的相对于其他相关基因转录。此外,蛋白质组学研究表明,Mbar_A1758基因产品非常丰富,proteolytically加工,进一步修改未知的多糖的添加。

第二,而MA0829同系物m . acetivorans和m·巴氏细菌(即相似。,ten and nine proteins, resp.),m . mazei只拥有5(表1)。有趣的是,所有这些似乎是一个密切相关m . acetivorans和m·巴氏细菌ORF(图5),只有一个甲烷八叠球菌属集群缺乏一个m . mazei成员。四,五m . mazei子已经被他们发现绑定一个(Leon et al .,在准备),只有MM2002没有被观察到。m . acetivorans蛋白质MA3556 MA0068容易检测到从反面洗提,而蛋白质MA0653和MA4531观察不一致。值得注意的,主要的开放在我们检测到甲烷八叠球菌属研究分为三个不同的团体在种系发生树(图5)。发现含有最丰富的蛋白质,另两个不太丰富。

第三,只有另外两个产甲烷古菌具有MA0829-like基因/蛋白质。这些都是Methanococcoides burtonii(四个同源染色体:Mbur_0268 Mbur_1089 Mbur_1690,和Mbur_2129)Methanosaeta thermophilaPT(三个同系物:Mthe_0148 Mthe_0677, Mthe_1177)。这些假定的蛋白质似乎密切相关的丰富甲烷八叠球菌属S-layer羊痘疮,而是聚集在一起更遥远的附近和弱表达甲烷八叠球菌属基因(图5)。有趣的是,Mbur_1690羊痘疮是浮在表面的游离的检测m . burtonii文化(23),这种蛋白质是最类似于S-layer蛋白质中发现m . acetivorans和m . mazei(11]。

第四,只有两个nonmethanogenic古生菌拥有MA0829-like基因/蛋白质(图5)。这些包括各一个Haloarcula marismortui(rrnAC0971 UniProt Q5V3G1)和Natronomonas pharaonisDSM2160 (NP1800A UniProt Q3IS97)。没有相关的开放框架中确定细菌或真核生物。MA0829蛋白似乎是相对罕见的在系统环境中,但在同一时间,它是一个主要的蛋白质这几个生物具有这种特性。

4.4。以前带注释的表层和Surface-Layer-Associated蛋白质

而多个S-layer和surface-layer-associated基因注释的甲烷八叠球菌属基因组测序项目(7- - - - - -9),显然,现在是实验数据过于局限于准确预测S-layer蛋白存在于这些热点。有趣的是,萨利赫的生物信息学研究et al。10]预测但不同S-layer蛋白质几乎没有重叠与其他预测。然而,几个微阵列数据集的分析m . acetivorans未能支持丰富的表达上述候选人(表S4)。

总之,本研究建立了一个主要的存在S-layer蛋白质甲烷八叠球菌属检查压力。其标志性守恒在Methanosarcinaceae但几乎没有在任何其他类型的生物。当前的研究的预测修正标准新基因组测序和宏基因组数据集。事实上,这将是有趣的未来的研究应该分配新发现slmA1基因/蛋白质Methanosarcinaceae。如果是这样,DUF1608主题是受限制的范围相对狭窄的物种。

确认

这项研究受到了美国能源部生物科学部门授予奖项DE-FG02-08ER64689 RPG,由UCLA-DOE基因组学和蛋白质组学研究所的莱托和RPG,由美国国家卫生研究所(GM085402) JL RROL,和露丝l . Kirschstein NRSA奖学金(NIH 5 f31ai61886-02) d . r . l .加州大学洛杉矶分校的质谱和蛋白质组学技术中心成立和装备由w . m .凯克基金会的慷慨的礼物。作者感谢帕特里夏·a·丹尼和保罗·c·丹尼(南加州大学牙科学院的)执行凝集素印迹。

补充材料

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