DNA结合在高盐:分析盐依赖数据的复制蛋白A3Haloferax volcanii

文摘

嗜盐古生菌维持细胞内盐浓度接近饱和生存在高盐环境中,他们的细胞过程适应函数在这些条件下。关于嗜盐的适应所知甚少的DNA加工机械,特别有趣,因为protein-DNA经典盐敏感的交互。为了研究这种适应,我们重组RPA3的dna结合蛋白功能特征Haloferax volcanii(HvRPA3)。在生理盐条件下(3 M氯化钾)HvRPA3是单体的,绑定18核苷酸ssDNA摩尔亲和力,证明战含单一OB-fold /锌指结构结合广泛可比性亲和两个OB-fold /锌指战。减少盐浓度为1 M氯化钾诱导蛋白质二聚,保留其DNA结合的能力。在圆形ssDNA,两种浓度绑定模式。传统,增加盐浓度DNA结合产生的不利影响但HvRPA3并不绑定DNA 0.2氯化钾,尽管multimerisation可能挡住结合位点。单氨基端OB-fold主管绑定没有c端锌指DNA,虽然减少了亲和力。这项研究是第一个定量描述的DNA结合蛋白质在极端嗜盐的盐浓度。

1。介绍

正常的细胞过程中复制、重组和修复DNA瞬变发生在一种单链(ss),它本质上是更容易受到比双链DNA损伤(dsDNA)。生活的所有领域,ssDNA-binding蛋白质(下面)扮演着重要的角色在这个暴露的保护形式,绑定ssDNA高亲和力,因此防止不恰当的二级结构和退火事件和暴露的损坏或修改基地(1]。除了这个防护功能,下面也有一个监管的角色,在这些复杂的连续事件的组织过程通过蛋白质-蛋白质之间的关系(1]。

尽管SSBs发挥核心作用在DNA复制和重组事件,实质性的变化一直在观察SSBs在生命的三个领域,与一定程度的结构性保护oligo-nucleotide /糖类绑定OB-fold [2]。的大肠杆菌单边带形成homotetramer,每个单体包含一个OB-fold和一个扩展的c端域参与蛋白质-蛋白质之间的关系(3,4]。真核和古细菌SSBs被称为复制蛋白(战)和真核区域规划通常包括一个heterotrimer [1]。锌指图案都一个共同特点,就是古细菌和真核战。

更广泛的亚基组成的变化出现在古菌(5,6]。的crenarchaeal硫化叶菌solfataricus(SsoSSB)蛋白由一个包含单个OB-fold单体。域组织被认为是更典型的细菌下面,虽然OB-fold结构更类似于在真核战(7]。更大的多样性是euryarchaea观察。的海床furiosus则是一个稳定的heterotrimer [8),而产甲烷球菌属jannaschii战似乎是单体的形式(9]。不寻常的是,甲烷八叠球菌属acetivorans(Mac)拥有三个区域(RPA1、RPA2 RPA3)。与真核生物,这些可以作为一个单独的单边带,形成为,此外homotetramers RPA1(的10]。

调查这些重要蛋白质的差异和相似之处与一个共同的核心主题,但不同的组织是至关重要的对我们理解进化和DNA的信息处理机制。有大量古菌如何进一步的兴趣,许多现有的在极端的环境中,其基本流程,以适应函数在这些条件下,例如在euryarchaeal存活成为基因易处理的生物模型(11]。这些嗜盐菌需要高盐浓度的增长和维持细胞内盐浓度的K⁺和Cl⁻附近的离子饱和打击下的渗透压力他们的细胞外环境的地方(12]。

各种策略对蛋白质适应嗜盐的生活方式已经指出,包括增加酸性蛋白质表面的残留物,有序溶剂网络,反离子的绑定,增加intersubunit离子对但这些不是万能13- - - - - -16]。鉴于protein-DNA交互主要是静电性质,因此,对高盐浓度,已知敏感重大利益发现嗜盐菌使用的策略来克服这些困难。

tata结合蛋白的亲和力的嗜盐的嗜热的海床woeseiDNA被证明能增加与增加的盐浓度范围0.8 - 1.2米(17]。这种现象似乎依赖于阳离子之间的绑定蛋白质和DNA表面负电荷(17]。进一步突变分析表明,只有三个残基的突变足以扭转绑定的嗜盐的性质,可能是由于降低阳离子绑定没有变异的谷氨酸的侧链(18,19]。在0.8,p . woesei细胞内的盐浓度更温和Haloferax volcanii2.1 - 4米氯化钾(17,20.]。描述的DNA连接酶h . volcanii3.2氯化钾,发现最大的DNA strand-joining活动与活动废除没有盐(21]。

我们最近的晶体结构h . volcaniiPCNA也表明阳离子结合补偿减少带正电的侧链中观察到这种滑动压板的中央通道,减少电荷斥力与DNA骨干(16]。

蛋白质分离出极端微生物在生物技术相关蛋白质自然适应函数在极端情况下,如热,已彻底改变了许多程序22]。嗜盐的蛋白质显然会适合程序要求高盐水平但也被建议相关环境,排除水、有机溶剂等(23,24]。

蛋白质的dna结合蛋白功能分析嗜盐的挑战,因为dna蛋白质绑定是典型盐敏感和协议通常旨在限制盐。额外的并发症出现,盐设备造成不利影响,尤其在电泳过热。

我们有过表达和纯化重组RPA3h . volcanii(HvRPA3),最小的三个h . volcanii战,现有方法适应高盐条件下,探索蛋白质的dna结合蛋白功能的盐浓度范围。

2。材料和方法

2.1。HvRPA3的克隆、表达和纯化

全身HvRPA3被放大h . volcanii基因组DNA(野生型DS2 [12])和克隆的心好和KpnI网站pETDuet1 (Novagen)。n端结构域(元)残留1 - 163和164 - 311 c端域(CTD)残留地区从完整的构建和克隆被放大到心好/ XhoI pETDuet1的网站。所有结构包含一个氨基6 xhistag介绍通过PCR。超表达进行使用大肠杆菌B834 (DE3)细胞生长在包含100磅媒体μ克/毫升氨苄青霉素。全身和CTD-expressing菌株生长OD_600年0.6 - -0.8和1毫米IPTG诱导。在37°C细胞进一步孵化3 - 4个小时,离心收获。消除故障产品时观察到的被忽视的热带病是过表达在这些条件下,细胞生长OD_600年1.0 - -1.2和1毫米IPTG诱导的25°C 1小时。细胞颗粒resuspended在缓冲区(50 mM消息灵通的pH值7.0,1.0 M氯化钠,10毫米咪唑)和一个EDTA-free蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板电脑通过声波降解法(罗氏)和细胞溶解,其次是通过离心澄清。硫酸铵分段进行,20 - 60%颗粒(完整)和0 - 60%颗粒(被忽视的热带病和连续油管resuspended在缓冲区并应用于爪金属亲和树脂(Clontech)在批量平衡缓冲和孵化滚动在室温下30分钟。树脂被30列卷缓冲和筛选了13毫升缓冲B(缓冲补充300毫米咪唑)。树脂是孵化最大化洗脱缓冲B 10分钟。筛选了蛋白应用于26/60 Superdex 200列(通用电气医疗集团)产物在50 mM消息灵通的pH值7.0和1.0 M氯化钠和运行在2毫升/分钟。分数是汇集和集中使用Vivapore 10/20 7500 Da截止(Vivascience)和蛋白质储存在4°C。蛋白质含量是评估在280 nm紫外线吸收,纠正个别消光系数,证实了通过扫描微的蛋白质与已知的标准通过sds - page凝胶沾SimplyBlue Safestain(表达载体)。

2.2。分析尺寸排阻色谱法

分析尺寸排阻色谱法(SEC)进行10/300 Superdex 200列(通用电气医疗集团)产物在缓冲区包含50 mM消息灵通的pH值7.0和0.2,1.0或3.0 M氯化钾。250年μg的浓缩蛋白被稀释到相应的缓冲和孵化一个小时之前加载。相关,克分子数相等的金额(ssDNA单体当量)(18 mer)寡核苷酸(序列5′-GCGTGTGTGGTGGTGTGC-3′, (MWG生物技术))稀释之前被添加在各自的缓冲区。流率维持在0.5 mL / min。蛋白质分数使用sds - page分析和监控的存在ssDNA监控使用量子位ssDNA工具包(表达载体)。校准使用凝胶过滤标准执行(BioRad)每个缓冲区占微分盐效应。洗脱nonhalophilic分子量标准(= 670先生在所有缓冲条件)是相同的,一些观察到的变化标准。

2.3。内在的荧光光谱

光谱获得Eclipse荧光分光光度计使用卡里的96孔板读者附件。使用280 nm的激发波长和发射光谱收集从300年到400海里。激发和发射缝都设定为5 nm。全长HvRPA3或HvRPA3-NTD稀释一式三份到缓冲区包含50 mM消息灵通的pH值7.0,0.2,1.0,和3.0米氯化钾给最后一个蛋白质浓度的70μm .样品在室温下孵化前18个小时分析。光谱都纠正了减法的油井包含存储缓冲区稀释样品缓冲。

2.4。荧光各向异性

指定数量的蛋白质被滴定反应包含50 mM消息灵通的pH值7.0,10%甘油、0.03% BSA, 20 nM Cy5-labelled寡核苷酸序列如上(MWG生物技术),0.2,1或3 M氯化钾。在室温下反应是孵化前10分钟阅读。各向异性测量在一个设想2102年Multilabel读者(珀金埃尔默)板620海里励磁和688海里排放。适合绑定曲线使用GraphPad棱镜v 5.0,平均至少五个数据集和正常化占粘度不同盐浓度。数据符合山上绑定模型。  是最大的特定的绑定,是半峰绑定所需的浓度,是山上的斜率。元,1 M氯化钾两站点模型使用。

2.5。琼脂糖凝胶阻滞

500 ng PhiX174 ssDNA(新英格兰生物学实验室)表示数量的HvRPA3孵育20毫米三,MgCl 15毫米₂2毫米德勤,50μg / mL BSA、6%甘油和1 M氯化钾10分钟37°C之前加载0.6%的琼脂糖凝胶。电泳后1 x此种缓冲区,DNA通过溴化乙锭染色紫外光照下视觉效果。

2.6。锌通过电感耦合等离子质谱法检测

微量元素的浓度(锰、铁、铜、锌、硒、钼、和Pb)纯化蛋白的测定电感耦合等离子体质谱法(ICPMS;热费希尔模型XSeriesII)在“碰撞单元”运营模式(7% H₂在他与“动能歧视”(CCT-KED)多元干扰降到最低。内部标准(193红外光谱、103 rh, 71 ga, 45 sc)是直接添加校准标准和样品成分在稀释剂溶液包含痕量分析年级HNO 1% (1/20)₃(费舍尔科学),2%甲醇,0.1%的非离子表面活性剂”Triton-X。“250μg蛋白的稀释前添加稀释剂解决方案最终氯化钠浓度的0.1米。样本分析一式三份。

2.7。同源性建模

该地区包括的主要二级结构元素OB-fold HvRPA3域(76 - 170)被提交-Tasser服务器(25]。-Tasser利用一个健壮的metathreading方法识别潜在的模板。-Tasser确定三个模板:2肯/ 2 kbn (OB-fold MM0293甲烷八叠球菌属mazei)和1 o7i (美国solfataricus单边带),产生一个单一的模型。分析使用MolProbity产生几何分数得分47百分位数和冲突在第99百分位数(26]。模型预测OB-fold的强烈支持。与人类的第一OB-fold RPA70,而不是作为一个模板,(1江铃汽车(27),使用二级结构匹配收益率1.92 A / 87 C的表示α残留。

3所示。结果

战蛋白质家族已经被广泛的研究由于其重要作用在保护ssDNA在DNA复制和修复和作为一个模型系统理解OB-fold发现的广泛适应性。特别是宽变化是euryarchaeota,战蛋白质的组成和排列。h . volcanii包含三个假定的狙击枪蛋白质,RPA1、RPA2 RPA3,相关证明函数的三种MacRPA蛋白质作为单独的下面(10,28]。我们选择HvRPA3作为一个合适的目标,探索以来,嗜盐菌DNA结合HvRPA3是最小的三个h . volcanii蛋白质和包含一个OB-fold和锌手指,这样的安排是以前uncharacterised(图1(一))。两RPA3蛋白质序列比对(参见图1在网上补充材料doi: 10.115 / 2012/719092)表明n端保护,与罗宾斯和其他人发现残留1 57调解二聚,与蛋白质和c端地区拥有一个锌指主题6]。HvRPA3包含一个小的插入前两个半胱氨酸残基(Cx之间₄残雪₈残雪₂相对于MacRPA3 H)(残雪₂残雪₈残雪₂InterProScan (H)。主题分析http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)预测单一OB-fold HvRPA3(71 - 167)主要调整的第二两个MacRPA3 OB折叠(54 - 164和165 - 277年)。

只有OB-fold HvRPA3领域有足够的同源性来解决结构允许进一步调查这个折叠的嗜盐的适应性的同源性建模。的-Tasser服务器识别三个模板结构,两个核磁共振结构相关m . mazeiOB-folds SsoSSB。调整模型的第一个OB-fold域(dna结合域1-DBD1)人类RPA70结构解决了在复杂与8 mer ssDNA表明一个封闭的核心褶皱β在HvRPA3桶是守恒的27]。偏差是观察到的连接环区域,如前面已经观察到,尽管这些地区与降低程度的信心(不可避免地模仿1]。结构分析SsoSSB牵连残留W56和F79 DNA结合的核心;这些守恒的芳香性质HvRPA3,分别拥有F120和Y144 [7]。F120相当于F238参与基地堆积在人类RPA70 [27]。

减少surface-exposed嗜盐的适应和赖氨酸残基是一种常见的特点是特别相关的DNA结合蛋白质中积极残留发挥核心作用在维护静电相互作用与带负电荷的DNA链。总的来说,HvRPA3, MacRPA3酸性性质,分别为4.20和5.31的理论π,。关注已知dna结合图案、OB-fold HvRPA3相比,MacRPA3和已知的结构m . mazei、人类RPA70 SsoSSB表明HvRPA3和MacRPA3明显减少赖氨酸4.2%和3.9%和6.8 -8.4%(补充图2)。天冬氨酸HvRPA3补偿与典型的嗜盐的增加,降低了该域π的会计HvRPA3(4.03)而不是MacRPA3为6.55。这些差异反映在整个电荷分布补充图3所示,为结合DNA的一部分显示取向对人类RPA70 DBD1。

我们曾提出,关键带正电的残留参与DNA的相互作用被保留,尽管增加酸性的嗜盐的蛋白质(16]。DNA结合的OB-fold是人类RPA70 cocrystal结构特征。对齐的RPA70 DBD1表明残留已知参与DNA结合(R210和R234)守恒HvRPA3和SsoSSB积极的残留物。K263 (RPA70)潜在结构等效HvRPA3赖氨酸。有趣的是,两个赖氨酸残基表面上远端保留dna结合蛋白裂,相当于人类RPA70 R202 K253, SsoSSB R202也守恒的,暗示一个守恒的函数,可能在交替绑定模式或蛋白质-蛋白质之间的关系。

3.1。HvRPA3超表达和纯化

纯蛋白质获得使用上述过程,纯度大于95%的根据sds - page(图1 (b))。迁移减少凝胶显然是弱智,预测标记蛋白质的分子量(MW)。这种现象经常在嗜盐的蛋白质,因为增加的带负电荷的残留物妨碍SDS结合蛋白质,因此阻碍迁移(29日]。

3.2。减少盐浓度促进Multimerisation HvRPA3

在净化过程中,HvRPA3始终从26/60 Superdex筛选了200列位置相当于一个二聚体。罗宾斯和其他人观察到MacRPA3似乎二聚的形式(10]。进一步探讨它与HvRPA3,分析证交会资料比较在不同的盐条件下(图1 (c))。氯化钾浓度的0.2,1、2和3 M以来利用氯化钾浓度比生理盐水生理相关的细胞内嗜盐的蛋白质(20.]。定义良好的峰出现在所有缓冲的条件。

0.2米的洗脱体积氯化钾产量预测兆瓦的约,符合HvRPA3形成四聚物盐浓度。在1 M氯化钾,洗提高峰持续的蛋白质,表明二聚体。在3 M氯化钾,HvRPA3是单体的,淋洗兆瓦的预测。相同的结果出现在当量浓度的氯化钠(数据没有显示)。

3.3。氯化钾浓度的增加促进ssDNA绑定

比较绑定的HvRPA3 ssDNA这些氯化钾浓度下,SEC与克分子数相等的重复(单体等效)浓度的一个18 mer ssDNA(图2(a))。在0.2 M氯化钾,没有观察到的绑定,蛋白质和DNA峰值每个分别洗脱峰。相比之下在1 M氯化钾,单峰值coeluting蛋白质/ ssDNA观察,表明对DNA结合蛋白质仍是二聚的。洗脱体积的转变和吸光度的增加观察DNA结合后,从12.7到22.5毛。在3 M氯化钾,再次ssDNA益生元coelutes与蛋白质峰和一个小的转变峰位置观察。的蛋白质似乎仍然单体的。在这个例子中,没有观察到的吸光度增加复杂的和单独的蛋白质。没有吸收的变化在寡核苷酸控制在不同盐环境下运行。减少紫外线吸收夹层的基地和unstacked单链DNA是一个已知的现象,这里的结果可能表明差异之间的基地曝光单体和二聚的形式30.]。

3.4。HvRPA3显示了DNA结合的两种模式

电泳迁移率改变分析(EMSA)通常被用来描述DNA结合。这种技术的适应高盐条件是具有挑战性的,因为增加盐水平会导致设备过热。然而,随着优化,乐队的变化观察与琼脂糖凝胶中运行1×此种缓冲区,孵化后越来越多的HvRPA3 PhiX174 ssDNA 1 M氯化钾(图2(b))。蛋白质浓度足以引起变化显著过剩的预期是基于与嗜中温战类似的实验。这可能反映了嗜盐的次优条件绑定在电泳过程中,因为它是不可能维持适当的氯化钾在运行缓冲水平。然而,系统允许绑定的定性分析,在结合循环ssDNA方法饱和暗示ssDNA完全被HvRPA3分子和两个不同迁移复合物是观察到,只有在提高蛋白质含量。

3.5。在高盐条件下荧光各向异性许可描述

提供定量分析的代表条件下生理盐水平,荧光各向异性(FA)是用来研究绑定使用18 mer寡核苷酸的标签在5′末端Cy5荧光团,广泛作为MacRPA3[描述10]。分析0.2氯化钾,即使有高浓度的蛋白质,并没有显示出饱和绑定,在与美国证交会达成协议的数据(数据没有显示)。饱和的绑定在1和3 M氯化钾(图2(c)和表1)。绑定模型,考虑重叠的结合位点和随之而来的阻塞可能的结合位点已被用来分析真核战DNA结合(31日]。然而,在这种情况下,尽管结合位点的大小可以通过比较预测HvRPA3 OB-fold模型与人类RPA70,阻塞的程度,因此剩余可用的结合位点的数量,是未知的。因此,给定长度的寡核苷酸利用和减少假设用于模型拟合,数据适合MacRPA3希尔绑定模型,由此产生的曲线和各向异性数据之间具有良好的协议(10,32]。

这一分析收益率的离解常数纳米和希尔系数在3 M HvRPA3氯化钾。一个值大于1是暗示合作绑定。获得的值MacRPA3表表示1,相比之下10]。相同的模型在1 M氯化钾产量值nM。希尔系数小于1 ()表明,绑定一个分子的第二个分子绑定少积极有利的,对于本分析,各个子单元内的二聚体被认为是独立单元。

3.6。DNA结合位点在低盐条件下似乎阻挡

由于DNA结合是废除0.2氯化钾和HvRPA3似乎形成四聚体在这种情况下,我们希望评估绑定裂(数据的可访问性3(一个)和3 (b))。DNA结合在SSBs评估色氨酸残基的荧光发射光谱的变化,与淬火发生在DNA结合(7,33]。检查HvRPA3 OB-fold模型与人类RPA70 / DNA时复杂表明两个色氨酸残基HvRPA3近端绑定DNA,尽管他们并不位于绑定间隙(图3 (b))[27]。

缓冲条件下的发射光谱包含1和3 M氯化钾几乎相同(图3(一个))。显著减少荧光强度在0.2氯化钾,虽然发射波长最大值保持类似的所有三个条件下,让人想起淬火观察在战DNA结合蛋白(33]。前战的研究表明,高达3米的单价离子浓度的变化不影响发射光谱(31日]。

这些数据,采取与美国证券交易委员会(SEC)数据,表明这些色氨酸残基不暴露在溶剂中的四聚物的形式0.2氯化钾,可能导致至少部分阻塞的dna结合蛋白,因为它们是定位在这个网站侧面。尽管二聚作用,在1 M氯化钾,发射的两个色氨酸残基相同的单体的3 M氯化钾形式,符合两种形式被精通DNA结合,尽管它必须强调,色氨酸残基不涉及直接DNA结合,只是标记在DNA侧面间隙。

3.7。减少盐浓度诱导Multimerisation的N - c端域

进一步解剖DNA结合和multimerisation,我们过度表达和纯化n端结构域(元)和c端域(CTD)构造(图1(一))。被忽视的热带病包含OB-fold域,而CTD包含锌指基序。在净化过程中,油管产生等效吸收在最终大小的两座山峰排除步骤,预测的多工作站系统和分别代表四聚物和二聚体的可能蛋白质。这两个高峰集中分别进行分析和被称为CTD-1 CTD-2。通过sds - page CTD-1和2时出现相同的分析,迁移作为一种预期蛋白质(图4(一))。

在3 M氯化钾、被忽视的热带病和CTD-2似乎洗提的大小排斥列在一个位置的单体,与被忽视的热带病淋洗略晚于预计蛋白质,暗示更紧凑的构象在这种情况下,由于蛋白质sds - page分析时似乎完好无损(数字4(一)和4 (b))。在1 M氯化钾,洗脱体积对被忽视的热带病和CTD-2建议二聚作用。形成三出现在0.2 M氯化钾。相比之下,CTD-1筛选了3 M氯化钾卷之间预期的二聚物和三聚物。高阶的观察CTD-1 multimerisation氯化钾浓度较低,在1米五聚物和七聚物0.2氯化钾。

3.8。的被忽视的热带病HvRPA3保留ssDNA-Binding活动

被忽视的热带病,CTD-1 CTD-2分析ssDNA-binding倾向通过秒和FA的完整的蛋白质。没有证据表明DNA结合获得CTD-1或CTD-2蛋白质在任何条件(数据未显示)。

交会分析表明,被忽视的热带病结合二聚体在1 M氯化钾单体在3 M氯化钾,没有绑定在0.2氯化钾,至于全身蛋白质(图5(一个))。通过sds - page分析显示高分子量乐队可能表明残留在0.2氯化钾(图二聚的形式5 (b))。这些没有在1 M氯化钾没有ssDNA但添加ssDNA后出现。一个乐队对应于一个二聚体不明显3 M氯化钾分数;然而,含盐量的增加减少车道拓宽频带的分辨率和原因。飘散的寡核苷酸的存在很可能反映了减少亲和力仅与被忽视的热带病,导致分离的寡核苷酸蛋白质过程中实验。

更高浓度的被忽视的热带病(1750海里)被足总需要产生饱和约束力的曲线,而全身蛋白质500海里(数字6(一)和6 (b)和表1)。,至于MacRPA3,希尔绑定模型曲线产生良好的协议与英足总HvRPA3数据结构,这并非如此的被忽视的热带病1 M氯化钾。两个网站绑定模型更加适合比一个站点1 M氯化钾数据绑定模型(图6(一)),给离解常数 海里, 海里,大错误表明模型并不完全描述绑定行为。为单体的3 M氯化钾数据,希尔绑定模型产生良好的协议与数据曲线,产生的电离常数纳米和希尔系数,减少一个数量级的亲和力和类似程度的积极协调完整的蛋白质。被忽视的热带病的内在荧光分析显示减少荧光在0.2 M氯化钾,大概反映这个领域的multimeric地位在这些条件下(图6 (c))。与完整的蛋白质,在1 M氯化钾,略微减少荧光观察与3 M氯化钾,暗示部分阻塞的一个或两个色氨酸在二聚作用。

3.9。锌绑定

icp是利用评估锌HvRPA3结构(表的内容2)。正如所料,被忽视的热带病不协调锌和CTD-1中不含检测锌。锌锌水平的0.60和0.53摩尔/摩尔的蛋白质(单体浓度)的完整的长度和CTD-2,分别表明CTD-2域的真正代表。CTD-1显然保留一定程度的二级结构组织由于其命令multimerisation,可能反映出由于免费的半胱氨酸残基二硫化物的形成。

4所示。讨论

虽然在嗜盐的一般趋势适应已确定,没有普遍的决定因素,可能反映在蛋白质结构和功能的多样性在细胞内环境。蛋白质结构分析发现,大部分的嗜盐的研究迄今为止广泛守恒的建筑相比nonhalophilic同行(35]。嗜盐的蛋白的酸性性质很大程度上归因于增加surface-exposed带负电荷的残留物和被认为是限制蛋白质聚合(36]。同源建模表明,HvRPA3是典型的嗜盐的蛋白质的建筑保护和增加酸性性质(图3 (b)和补充图2和图3)。

模型表明,HvRPA3可能结合DNA的方式出现在其他战蛋白质,考虑到保留置入芳香残留物和带正电的残留参与绑定。尽管如此,绑定裂显示显著减少正电性,和高分辨率co-crystal结构需要详细解剖残留在这些侧面守恒的残留物,尤其是扮演的角色识别表面离子已经被先前的研究表明是一个重要的DNA结合的嗜盐的适应机理(16,18,19]。

的分析p . woesei着重结合蛋白表现出强烈的趋势增加DNA结合的亲和力与盐浓度增加(0.8 - 1.2米)(17]。然而,细胞内的盐的浓度h . volcanii明显高于p . woesei我们想扩大我们的分析更适合于水平h . volcanii,3 M氯化钾。嗜盐的DNA结合酶的一些研究已经证明了酶活性增加到这样的水平,强烈推断DNA结合在这些条件下(21]。实际困难在建立协议适应量化DNA结合3 M氯化钠和氯化钾详细分析不可避免地有限的绑定。使用的组合证券交易委员会、FA和琼脂糖凝胶阻滞,我们描述HvRPA3的绑定。

在生理盐条件下,在3 M氯化钾,HvRPA3似乎绑定ssDNA作为单体克分子数相等的条件下采用交会分析(图2(a))。在饱和绑定条件用于FA,估计离解常数在摩尔范围和MacRPA3相比(表仅略有减少1)。很明显,HvRPA3已经适应了函数在这些极端盐条件下,与MacRPA3大致类似的亲和力。事实上,轻微的减少也许反应了一定的事实,HvRPA3只拥有一个OB-fold相比两个MacRPA3中确定。模型拟合收益率希尔系数大于1,表明积极的协同绑定,绑定支持的曲线在3 M氯化钾,暗示合作而不是独立的绑定,观察MacRPA3(图2(c))。积极协调曾被报道为单体的单边带T4基因32蛋白质和作者把这种效应扭曲到DNA和/或直接蛋白质-蛋白质之间的关系,使后续进一步分子更有利的绑定(37]。

被忽视的热带病的分析表明,OB-fold域是足够的dna结合活动,虽然减少了一个数量级的亲和力(表1),明显高于观察MacRPA3 (纳米(6])。大概,效果更深刻的比MacRPA3 HvRPA3 HvRPA3以来只拥有一个OB-fold。相当于MacRPA3 c端删除包含单个OB-fold绑定更弱(海里),大概是因为这种蛋白质是优化两个OB-fold绑定。

氯化钾HvRPA3形成二聚体在1米,全长蛋白和被忽视的热带病和通过证交会将DNA出现二聚体(数字2(一)和5(一个))。ssDNA preincubated在一个克分子数相等的比例相对于单体的浓度。长篇HvRPA3,由于缺乏剩余寡核苷酸峰,这表明绑定的比例是1二聚体:2寡核苷酸。增加吸收的蛋白质、DNA复杂的在这些条件下,3 M氯化钾的复杂相比,表明绑定两个蛋白质之间的变化形式。我们解释这表明,在1 M氯化钾,寡核苷酸的一部分移动,因此紫外线吸收的增加。希尔系数0.9显示一定程度的负协同条件下存在过多的蛋白质,这表明绑定的蛋白质配体使绑定第二配体不积极有利的。这与观察到的情况在MacRPA3(二聚体)和可能反映了HvRPA3改变嗜盐的适应的结果。二聚体中的OB-folds面向可能不是最优的顺序之间的绑定,绑定网站可能是独立的。似乎没有这样的被忽视的热带病1 M氯化钾。曲线拟合two-site绑定模型产生一个更好的适合FA数据(图6(一)),尽管大错误表明,这个模型并不完全描述有约束力的行为。被忽视的热带病的色氨酸荧光观察到轻微减少1 M氯化钾条件下表明色氨酸残基溶剂暴露在被忽视的热带病二聚物低于完整长度的二聚体。考虑到这两个因素,这是合理的被忽视的热带病二聚体可以同时绑定ssDNA数组中发现人类RPA70-DNA co-crystal结构(27]。在1和3 M氯化钾,增加吸收被络合的被忽视的热带病ssDNA,表明比例的18 mer寡核苷酸是移动。这是符合预测绑定的足迹OB-fold相对于18 mer寡核苷酸;人类RPA70的结构包含串联OB-folds绑定一个8 mer ssDNA分子。

检查绑定在一个上下文相关细胞的条件下,影响HvRPA3循环ssDNA被EMSA评估(图2(b))。尽管很难量化的盐浓度复合物体验在电泳过程中,两种形式的复杂是清晰可见。缓慢的迁移形式只出现在更高的蛋白质含量。MacRPA3烦恼的分析清楚地表明,蛋白质具有两种DNA结合模式,即浓度(6,10]。在低浓度时,包装模式主导。相比之下,在临界浓度,蛋白质安排本身这样ssDNA变得紧张,而蛋白质分子可能安排在串联阵列ssDNA的长度。后一种形式会在EMSA迁移更慢。这种缓慢的迁移形式的存在在更高的蛋白质含量表明HvRPA3 MacRPA3显示类似的行为,尽管OB-folds multimeric状态和数量的变化复杂的外推。

罗宾斯和其他人提出包装和拉伸模式的变化将备用的地区则与合作伙伴或DNA和蛋白质交互可能影响ssDNA构象(10]。似乎在生物体拥有几个独立的下面,m . acetivorans和h . volcanii,每个蛋白质,从而精确地控制伴侣的蛋白质将时间和空间的关键调控DNA的处理。罗宾斯等表明,c端所需的锌指地区绑定模式MacRPA3和积极协调(6]。小的差异之间的协同是全身HvRPA3 (和被忽视的热带病),这可能反映了不同单体的HvRPA3和二聚的MacRPA3。HvRPA3 c端域的结合锌与完整的蛋白质和可比的入住率很可能在调控中发挥作用的ssDNA绑定通过氧化还原,作为MacRPA3[建议38]。

Multimerisation与减少盐浓度是一个显著的特性研究中的结构分析(数据1 (c)和4 (b))。锋利的洗脱剖面观察符合定义multimerisation而不是聚合与部分展开观察到一些嗜盐的相关蛋白在低盐浓度(39]。增加一个类似multimerisation在低盐浓度被观察到h . volcaniiDNA聚合酶X和RadA在我们的手中(数据没有显示)。大概在低盐水平,观察到蛋白质表面的装饰与离子结构(14,16)小于最优,导致暴露的带电残基。在dna结合蛋白质的情况下,更有可能保留带正电的残留在补丁,multimerisation可能由盐桥之间形成基本的补丁和邻近的主要负表面蛋白质,导致定义的山峰所观察到的,而不是部分的蛋白质的聚合由于接触疏水核心的残留物。

没有证据表明在0.2 M氯化钾(ssDNA绑定数据2和5)。一些h . volcanii蛋白质已被证明在低盐条件下结合DNA (40),而其他酶没有活动没有盐,可能由于废除DNA结合的21]。这种变化可能反映了多样性适应和蛋白质功能的细胞。缺乏DNA结合和观察到的减少固有荧光在全身和被忽视的热带病蛋白质0.2氯化钾的条件下是一致的至少部分阻塞的DNA结合裂缝由于multimerisation定义,虽然它可能是次优的表面离子装饰在这些条件下导致缺乏约束力。

这样的协会在低盐条件下可能不同于二聚效应出现在1 M氯化钾在全身和被忽视的热带病的蛋白质。罗宾斯等(6)确定残留氨基端第一个OB-fold中央二聚和对齐支持保护本地区的单一OB-fold战。HvRPA3在1米二聚的氯化钾和大概的同事MacRPA3以类似的方式。3 M氯化钾条件可能耐火材料形成的二聚体界面。虽然增加离子对一般指出作为一种嗜盐的适应在高盐条件下稳定的接口,这并不是一种普遍的效果。在这个例子中,单体的形式在高盐浓度适应函数,反映了范围的适应性和细胞中的蛋白质功能的多样性。进一步了解这些蛋白质的多样性和适应性,它将描述感兴趣的其他单一的DNA结合和multimerisation行为OB-fold热点区域,如的Archaeoglobus从高温,而非嗜盐的来源(补充图1)。集群的嗜盐的RPA3蛋白质和等效Archaeoglobus蛋白质是一致的系统发育分析其他DNA复制的蛋白质,如MCM复杂(41]。

正如已经指出的那样,古生菌存在不同安排的熔炉SSBs和狙击枪,一个优秀的模型来研究的进化等普遍褶皱OB-fold [6]。特征明显的两个OB-fold /锌指安排MacRPA3似乎是最常见的。这项研究是第一个描述单个OB-fold-containing-RPA加上锌手指。也是第一个定量研究DNA结合的如此极端的盐条件下,代表了一个重要的一步了解嗜盐的适应的最经典食盐过敏交互,包括标准的适用性分析极端盐条件下描述DNA结合。工作正在利用这个信息在结构研究中,提供详细的描述一个DNA蛋白质co-crystal和完全解剖嗜盐的DNA结合的适应。

确认

这项工作是由Wellcome Trust RCDF奖:k .旗帜(批准号076556 / Z / 05 / Z)和巴基斯坦高等教育委员会奖学金到b Patoli作者要感谢斯科特博士年轻进行icp分析在这项研究中,德克兰·布雷迪的帮助他卡里Eclipse,阿吉尔博士马赫迪EMSA专家建议,和托尔斯滕博士阿勒斯和艾米Stroud有用的讨论。

补充材料

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