RNA-Based评估多样性和活跃的热点社区组成德国湾

文摘

古生菌发挥重要作用在不同的生物地球化学循环。他们被称为极端微生物栖息环境如温泉或热液喷口。最近的研究揭示了相当丰富的古生菌在温和的环境中,例如,温和的海水。然而,这些海洋古细菌群落的组成和生态系统功能在很大程度上是未知的。评估多样性和活跃的热点社区组成德国湾七个海洋水采集标本,研究了RNA-based核糖体16 s rRNA的分析。为此,从样本中提取总RNA并转换为互补脱氧核糖核酸。pyrosequencing-based古群落结构进行调查分析,16 s rRNA扩增子来自互补。据我们所知,这是第一个研究结合下一代测序和metatranscriptomics研究热点地区海洋栖息地。pyrosequencing-derived数据集由62045年古16 s rRNA序列。我们确定了Halobacteria作为主要的古细菌群体在所有样本增加丰富的海藻。Thermoplasmatales(Euryarchaeota海洋集团)和我(Thaumarchaeota)中确定小丰度。指出古社区模式受到环境条件的影响。

1。介绍

计算,一毫升的海洋海水包含10个⁶不同的微生物1]。这些古细菌,细菌、原生生物,单细胞真菌贡献98%到主生物质生产和参与几乎所有的生物地球化学循环2]。据估计,全球海洋港口约古细菌细胞和细菌细胞,构成整个海洋picoplankton[63%到90%的3]。此外,大量的古生菌在海洋沉积物中发现了(4]。

与他们的亲戚生活在极端环境中,对海洋的了解甚少古生菌。这部分是由于纯文化的不可用。海洋古生菌可能参与了一些海洋海洋氮循环Crenarchaeota能够硝化作用[5]。然而,我们的知识在海洋生态学的热点的角色是基本的和他们对全球生物地球化学循环的影响在很大程度上是未知的(6]。

文化无关的方法极大地增进我们的知识的海洋微生物群落多样性和生态7- - - - - -9]。下一代测序(上天)导致了这种进步。例如,许多不同的生态系统如土壤(10,11海水]或[12)研究了基于dna的高通量测序的16 s rRNA的基因片段和分析获得的序列。基于dna的宏基因组方法的主要缺点是不能区分活跃的和不活跃的社区成员。

活跃成员和微生物群落的功能可以通过使用RNA-based metatranscriptomic方法。例如,Urich et al。13]分析了活跃的土壤微生物群落的组成和代谢潜力反向转录测序的总RNA。其他的研究分析基因表达在海洋表面水域(8)或深海热液柱(14]。然而,主要是细菌在这些研究社区和他们的能力进行了分析。

在本文中,我们研究了地表水的活跃的热点社区的构成来自北海的东南部,德国湾。德国湾西北分开Doggerbank剩下的北海,一个很大的沙滩。大湾沿海地区的浅的水深约2到12米。在我们的调查中,我们收集了七个水样在不同位置和深度在这些肤浅的近海区域。

我们的研究的目的是评估活跃的热点社区结构在南部北海采用下一代测序产生的16 s rRNA扩增子逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)。据我们所知,这是第一个研究用这种结合的方法来研究海洋古社区。

2。材料和方法

2.1。取样和样品制备

七个海洋水采集标本进行社区热点分析。大约50升的海水/抽样收集网站上的调查船Heincke 2010年5月采用电导率、温度、和深度(CTD)分析器。所有网站都是位于德国湾。通过10海水样本预滤器μm-mesh-size尼龙网和一个过滤器组成的三明治precombusted (4 h在450°C) 47毫米直径的玻璃纤维过滤器(绘画纸GF / D;绘画纸,梅德斯通,英国)和47毫米直径(3.0孔隙大小μ米)聚碳酸酯过滤器(图像比对,绘画纸)。Bacterioplankton收获了1 L预滤器过滤海水通过一个过滤器组成的夹层玻璃纤维过滤器(绘画纸GF / F)和47毫米直径(0.2孔隙大小μ米)聚碳酸酯过滤器(图像比对,绘画纸)。

此外,海洋浮游植物样本收集利用浮游生物网(孔隙大小55μ米)。藻群落的组成是由显微镜的收集样本。

2.2。RNA的提取和纯化

总RNA提取描述Weinbauer et al。15]。一个47岁的过滤器(孔径0.2毫米直径μ米)每个样本。随后,RNA是纯化采用RNeasy迷你设备制造商推荐(试剂盒、希尔登,德国)。

去除残余DNA与RNA样本,Ambions涡轮DNase(美国卡尔斯巴德英杰公司)是根据制造商的指示使用一个修改:后续标准反应,0.5μL涡轮DNase每10μg的RNA被添加到混合,孵化进行15分钟的37°C。苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)被用来DNase灭活。

剩余的DNA的存在被使用16 s rRNA基因PCR检测目标基因扩增。以下两套引物被:518 f / r (5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(16)和5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′(17])和1055 f / 1378 r (5′-ATGGCTGTCGTCAGCT-3′(18)和5′-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3′(19])。

PCR反应混合物(25μL)对目标基因的扩增包含2.5μL(10倍Mg-freeTaq聚合酶缓冲(Fermentas、圣Leon-Rot、德国),200年μ米的四个desoxynucleoside三磷酸腺苷,1.75毫米MgCl₂,0.4μ每个引物的M, 1 UTaqDNA聚合酶(Fermentas),和大约100 ng的纯化RNA样本模板。下面的热循环使用方案:初始变性在94°C 2分钟,28日周期在94°C的变性1.5分钟,退火1分钟55°C,紧随其后的是扩展在40年代的72°C。最后在72°C扩展进行了10分钟。

2.3。从总RNA合成的互补

总RNA的互补脱氧核糖核酸合成采用上标双链cDNA合成装备(英杰公司)与第一链合成修改协议:10μL的总RNA (5μ和1 g)涨跌互现μL随机六聚物引物(罗氏,曼海姆,德国)和1μL核苷酸混合物包含四种desoxynucleoside 10毫米的三磷酸腺苷。混合物是孵化10分钟在70°C和冷冻冰。四个μL 5 x第一链缓冲区,1μ德勤0.1 L, 1μL RNA保护(Fermentas)补充道,反应混合物是孵化为2分钟25°C。随后,1μL(上标2逆转录酶是补充道。10分钟的反应是孵化25°C,然后1 h在45°C。生成的cDNA受到16 s rRNA PCR。

2.4。放大16 s rRNA和焦磷酸测序

分析古细菌多样性,V3-V5热点区域16 s rRNA被PCR扩增。PCR反应(25μL)包含5μL(5倍Phusion GC缓冲区(Finnzymes,万塔,芬兰),200年μ米的四个desoxynucleoside三磷酸腺苷,1.5毫米MgCl₂4μ每个引物(表的M1),2.5% DMSO, 1 U Phusion高保真热态启动DNA聚合酶(Finnzymes),和互补的大约50 ng。以下使用热循环方案:在98°C初始变性5分钟,25个周期98°C的变性45 s,退火在68°C 45 s,紧随其后的是扩展30年代在72°C。最后在72°C扩展进行了5分钟。消极的控制是由使用反应混合物没有模板。引物序列的扩增V3-V5地区(20.]以及454适配器与独特的MIDs表列出了每个样本1。结果PCR产品检查适当的大小,然后纯化使用peqGOLD凝胶萃取工具包(Peqlab,埃朗根,德国)推荐的制造商。三个独立的每个样品进行PCR反应,由凝胶萃取纯化,等量的汇集。定量PCR产品都使用了Quant-iT dsDNA BR化验设备和一个量子位荧光计(表达载体)推荐的制造商。哥廷根基因组学实验室确定的序列16 s rRNA通过使用罗氏GS-FLX 454 pyrosequencer钛化学(罗氏,曼海姆,德国)。

2.5。焦磷酸测序派生数据集的处理和分析

序列的序列读取存档数据存入国家生物技术信息中心在加入SRA056839数量。16 s rRNA生成数据集进行了处理和分析采用QIIME 1.4软件包和其他工具(21]。序列最初根据454数据的去噪处理工作流。序列短于300个基点,平均质量值低于25,或者拥有均聚物超过8 bp被移除。后来,序列去噪。Cutadapt用于截断(剩下的引物序列22]。嵌合基因序列被使用UCHIME和绿色黄金数据集引用数据库(23- - - - - -25]。

剩余序列集群采用UCLUST算法(23和以下QIIME脚本:pick_otus。py和pick_rep_set.py。序列是集中在操作分类单元(辣子鸡)3%和1%基因不同。系统组成确定使用QIIME assign_taxonmy。py脚本。一个爆炸对齐26)在最近的席尔瓦ARB数据库(27)从而执行。序列的分类分类对他们最好在ARB数据库。最后,OTU表生成。

2.6。稀疏分析和多样性分析

稀疏曲线,香农指数(28),和Chao1指数(29日)计算采用QIIME脚本。此外,辣子鸡的最大数量()估计为每个样本在R(2.15版)(30.)使用数据来源于QIIME稀疏基于Michaelis-Menten动力学分析和非线性回归模型(31日]。

比较热点的社区结构基于基于系统或在所有样本点距离度量,一个主坐标分析使用QIIME (PCoA)被执行。下面的脚本先后用于生成一个系统发育树PCoA前1%遗传距离计算:align_seqs。py (PyNAST算法),filter_alignment。py和make_phylogeny.py。树和各自的OTU表被用来生成PCoAs雇佣“beta_diversity_through_plots。py脚本”。

3所示。结果

3.1。环境参数

古细菌社区分析海水样本随机收集了七个不同地点在德国湾(图1、表2)。五个样本(网站659、660、664、670和671年)在存在的藻华。另外两个样品来自河流河口(655)和从一个网站外的藻华(658)。观察到的海藻在抽样主要是由属Phaeocystis。硅藻属的Rhizosolenia和一些甲藻也确定,但其中只有轻微的丰度。

环境因素在所有七个采样站点监控使用CTD剖面仪(表2)。温度和盐度范围从9.73到11.70°C和事业单位,从30.24到32.71。最高最低温度和盐度测量在658网站。所有其他网站显示出类似的条件。荧光是布鲁姆地点由于高叶绿素浓度,而传输减少由于高浊度的水。

3.2。古细菌群落结构揭示了16 s rRNA-Based分析

评估热点社会结构,从样本中提取总RNA。约5μ提取总RNA的g /过滤器从每个样本。污染后的DNA和rna小,0.25到1.5μg的RNA被用作模板互补脱氧核糖核酸的合成。16 s rRNA的V3-V5地区从生成的cDNA放大。结果PCR产品受到焦磷酸测序。序列处理质量包括过滤、去噪和清除潜在的嵌合的序列导致恢复62090年的高质量的序列读取长度≥300个基点的所有7样品。平均读取长度是506个基点。每个样本序列的数量从4301年到23070年不等。我们能够分配62045序列域古生菌和所有这些序列在域级别进行分类。隶属于三个古细菌类群的分类序列12古细菌类或类似的系统组。Euryarchaeota是最丰富的古门(99.25%)和Halobacteria主要类所有样品(> 98.1%)(图2)。大部分的序列的附属Halobacteria(97.81%)隶属于无教养的深海热泉小组的成员6 (DHVEG-6) [32]。有趣的是,Halobacteria更丰富的盛开样品比其他样本(图2)。其他古细菌群体出现在所有样本海洋集团我(Thaumarchaeota)[33)和Thermoplasamata(Euryarchaeota)。序列隶属于后者古集团属于无教养的成员CCA47 [34)组和海洋组二世(33]。

3.3。多样性和物种丰富度的热点社区

确定古细菌多样性和丰富性,稀疏与QIIME分析(21]。α多样性分析在相同级别的测量工作(每样3100个随机选择的序列)。观察到在古细菌picoplankton OTU号码范围从252年到454年辣子鸡(1%遗传距离)和从250年到417年辣子鸡(3%遗传距离(表)3)。集群的最大能预期的数量为每个样本由非线性回归基于Michalis-Menten骑马。OTU保险平均遗传距离分别为62.3%和62.6%,1%和3%,分别。香农指数范围从3.74到7.74(1%遗传距离)和从3.63到7.62(3%遗传距离)。

比较稀疏的分析辣子鸡的数量取决于Chao1丰富估计显示,在1%和3%的遗传距离稀疏曲线(图3)不饱和和丰富性估计表明,41.34%到73.41%的估计丰富,分别被测序的努力(表中恢复过来3)。因此,我们没有充分调查这些遗传分类学多样性的距离,但很大一部分古细菌多样性的个体样本评估遗传差异的3%。

3.4。β多样性的Bacterioplankton社区

活跃的细菌社区的变化应对不同环境条件检查主坐标分析(PCoA)(图4)。测量工作没有或很少影响多样性和群落结构。然而,PCoA分析显示,所有的样品表现出类似的环境参数如温度和盐度被分配到一个站点的阴谋。此外,所有开花样品往往聚集在一起。样本658带外的藻华完全脱离所有其他样品。

4所示。讨论

海洋环境包含一个高微生物生物多样性、海洋微生物群落扮演主要角色在许多生物地球化学循环。研究通过文化无关的方法大大有助于我们理解微生物多样性的程度(35]。这些研究大部分集中在海洋细菌,而很少的多样性与生态海洋而闻名古生菌。最近ammonium-oxidizing宏基因组研究提供了证据古生菌能够硝化作用[36]。一些海洋crenarchaeal血统被认为是重要的氮化物浮游海洋系统(37]。这些结果表明,古生菌在全球氮循环是重要的球员。然而,详细比较生态研究理解古社区模式和环境塑造这些社区的司机失踪37]。

这项研究集中在评估中的活性古细菌群落结构和丰富picoplankton样本来自德国metatranscriptomic曲线的方法。据我们所知,这是第一个研究使用一个RNA-based方法结合门店分析古社区组成。此外,获得平均读取长度(506个基点)是高于其他大多数研究采用16 s rRNA的门店测序基因扩增子(38,39]。大多数是隶属于获得的序列Euryarchaeota。酸式焦磷酸钠et al。40]研究海洋沉积物来源于牡蛎地面(北海),发现高含量,这个门的成员在他们的样品。我们确定了Halobacteria作为最丰富的古细菌群体。这一组的成员可以耗氧和厌氧生长。大型halobacterial花朵出现红色由于生产retinal-containing视紫红质。视紫红质是光敏膜具有高度保守的蛋白质三级结构(41),可以作为一个额外的可能节省能源。这是有利的在海洋环境中,溶解有机物和其他营养物质的浓度通常是低(42]。大多数halobacterial序列分析研究隶属于深海热泉Euryarchaeotal组6 (DHVE-6)。这组最初被描述为一种深海热液喷口血统(43]。后来改名为杂项Euryarchaeotic小组,这个小组的成员也被发现在海洋沉积物44和土壤中45]。另一个古细菌群体中发现所有的样品是我(MG-I)海洋集团。它最初被测序的环境16 s rRNA基因来源于海水(46,47]。成员MG-I占很大分数海洋原核的微型浮游生物应为海洋深层水中的和原核的社区(低于3000米)。Thermoplasmata第三个最丰富的古细菌类的调查样本。大多数序列是附属于CCA47组。这组最初确定的16 s rRNA基因分析氧含量减少海洋环境(48]。后来,费雷尔et al。34)在缺氧微咸的沉积物中发现这一组的成员。几个序列分配到Thermoplasmata也附属于海洋组II。德龙(33)表明,海洋组织成员二世(Euryarchaeota)更丰富的海水在温带海洋集团我(Crenarchaeota)成员。我们恰恰相反,我们记录了一个更高的丰富的海洋集团成员在研究样本。海洋组II成员几乎没有调查样本。这种差异的一个原因可能是,大部分的德国湾强烈受潮流的影响。因此,这些电流可能旋转古细菌细胞表面的沉积物水,因为大多数的识别组织最初称为海洋沉积物的居民。尽管如此,许多研究针对热点社区在水柱明显低于海洋沉积物。由于这种知识缺口,这些热点的栖息地偏好组绝对不能推导出。

环境条件的影响,在研究古细菌群落组成和丰富性已经很少。Auguet et al。37)进行了一般分析方法寻找社区的未受教育的模式古生菌沿着环境梯度或栖息地类型。他们的研究结果表明,生境类型有一个古细菌群落结构的影响大于其他环境条件。所有样本调查在我们的研究起源于几乎相同的生境类型,除了655年和658年,样本收集在一条河河口地区以外的藻华,分别。因此,所有样本来自布鲁姆显示一个几乎相同的社区组成。此外,样本655显示consimilar社区结构。这表明类似的环境因素,如温度、盐度、和高营养的可用性在海藻或在河排放口,产生类似的影响在组成社区活跃的热点。

Herfort et al。49]研究古细菌社区在西南北海通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)和显示大量的之间的正相关关系Euryarchaeota和叶绿素浓度,而丰富的Crenarchaeota与叶绿素浓度负相关。Teeling et al。50]研究细菌Helgoland附近的社区。他们表明,细菌群落结构是高度受藻类过度繁殖的影响。在我们的研究中,我们调查了PCoA海藻对古细菌多样性的影响。样品在布鲁姆的共享类似的群落结构。这表明海洋古社区也受到赤潮和环境参数与开花的存在。我们观察到一个数量的增加Halobacteria盛开的样品。这可能是与有机质的大量繁殖。Halobacteria是最活跃的微生物对有机物降解高盐环境(37]。因此,大量的高Halobacteria藻华样本可能表明一个参与海洋有机物降解时发现在高营养条件下藻类的繁殖。

由于缺少纯文化和大调查,比较健壮的结论海洋古社区生物地球化学循环的贡献不能被吸引。在这项研究中,我们发现高度多样化的和活跃的热点社区地表水的德国湾。是未知的,他们的生态作用,进一步的研究包括分析功能基因表达需要执行解开海洋的作用古生菌。

确认

作者感谢调查船的船员Heincke宝贵支持和奥尔登堡的人,尤其是梅哈德斯坦西蒙和Helge-Ansgar Giebel,水文数据之前,在采样和有价值的帮助。这项工作由德意志Forschungsgemeinschaft (DFG)合作研究中心的一部分TRR 51。

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